Summary
We beschrijven een methode om organotypische hippocampale slices die gemakkelijk kan worden aangepast aan andere hersengebieden te bereiden. Brain plakjes worden gelegd op poreuze membranen en cultuur media is toegestaan om een interface te vormen. Deze methode behoudt de bruto-architectuur van de hippocampus voor maximaal 2 weken in cultuur.
Abstract
De hippocampus, een onderdeel van het limbisch systeem, speelt een belangrijke rol in het lange termijn geheugen en ruimtelijke navigatie 1. Hippocampale neuronen kunt de kracht van hun verbindingen na korte periodes van sterke activering. Dit fenomeen, bekend als de lange termijn potentiatie (LTP) kan duren voor uren of dagen en is uitgegroeid tot de beste kandidaat mechanisme voor leren en geheugen 2. Daarnaast is het goed gedefinieerde anatomie en de connectiviteit van de hippocampus drie maakten het tot een klassiek model systeem om synaptische transmissie en synaptische plasticiteit 4 te bestuderen.
Als ons begrip van de fysiologie van de hippocampus synapsen groeide en moleculaire spelers werd geïdentificeerd, een behoefte om synaptische proteïnen te manipuleren werd noodzakelijk. Organotypische hippocampus culturen bieden de mogelijkheid voor een eenvoudige genetische manipulatie en precies farmacologische interventie, maar behouden synaptische organisatie die is van cruciaal belang voor het begrijpen van synaps functioneren in een meer naturalistische context dan routine cultuur gedissocieerd neuronen methoden.
Hier presenteren wij een methode voor te bereiden en cultuur hippocampale slices die gemakkelijk kunnen worden aangepast aan andere hersengebieden. Deze methode maakt een eenvoudige toegang tot de plakjes voor genetische manipulatie met behulp van verschillende methoden zoals virale infectie 5,6 of biolistics 7. Daarnaast kunnen plakken eenvoudig worden teruggewonnen voor biochemische assays 8, of overgedragen aan microscopen voor beeldvorming 9 of elektrofysiologische experimenten 10.
Protocol
1. Voor het starten van de voorbereiding van de hippocampus Slices.
- Bereid het weefsel slicer door het plaatsen van een stuk van Teflon plaat en montage van een nieuw blad.
- Veeg de weefselkweek (TC) kap met 70% ethanol en stel het ontleden microscoop binnen. Steriliseer de motorkap, microscoop, weefsel snijmachine en alle instrumenten voor het ontleden van 15 minuten met UV-licht.
- Bereid zes goed TC platen. Voeg 750 ul slice cultuur media (SCM) per goed en plaats celcultuur inserts in elk putje. Zorg ervoor dat de membranen worden grondig nat zonder bubbels eronder. Leg de platen in de broedstoof bij 35 ° C vergast met 5% CO 2 totdat het nodig is.
- Giet 50 mL lage Na + ACSF (ontleden oplossing) in een 100 ml beker en plaats het op ijs-zout mix. Bubble de lage Na + ACSF met 5% CO 2 / 95% O 2 tot de kleur verandert en ACSF vormt een brij mix van bevroren en vloeibare oplossing (10-20 min).
- Hier krijg je een P5-P7 ratten pup. Maximaal drie pups worden gebruikt.
2. Hippocampus Slices Voorbereiding.
- Snijd de kop van het dier met scherpe utility schaar. Snijd de huid en de schedel bloot te leggen. Open de schedel door het snijden van links naar rechts langs de interaurale lijn en dan langs de pijlnaad met een klein schaartje. Een optionele gesneden van links naar rechts in de voorkant kan worden gedaan om te bevorderen het verwijderen van de botten en de blootstelling van de hersenen. Schep uit de hersenen snel met een ronde lepel micro-spatel en plaats deze in de brij van ontleden oplossing om te relaxen voor ~ 1 minuut. Giet ~ 10 ml ijskoude ontleden oplossing op een 60 mm schaal en overdracht van de hersenen van de beker aan het gerecht. De hersenen moeten worden gedekt met ontleden oplossing.
- Onder de microscoop ontleden: Plaats de hersenen en houd hem bij de middenlijn met het ontleden tang ingedrukt om de bodem van de 60 mm schaal. Gebruik de hippocampus ontleden instrument om de hemisferen weglaten van de middenhersenen te scheiden. De hippocampus worden dan blootgesteld op elk halfrond. Dan voorzichtig schep de hippocampus uit met de hippocampus ontleden tool. Gebruik het ontleden naald volledig isoleren van de hippocampus en het schoon zo veel mogelijk.
- Met behulp van een geknipt tip van een P1000 filter pipettip voorzichtig zuigen de hippocampus en het overbrengen naar het Teflon vel op het weefsel snijmachine. Plaats de hippocampus op zijn concave kant.
- Lijn de hippocampus loodrecht op het blad te coronale secties te verkrijgen en overmaat vloeistof uitlekken.
- Snijd de hippocampus elke 400 micrometer.
- Giet ~ 10 ml koud SCM in een 60 mm schaal en overdracht gesneden hippocampus van de snijmachine met een andere geknipt P1000 filtertip en koud SCM. Vermijd het maken van bubbels.
- Met de hulp van een iris spatel en een rechte spatel voorzichtig los van de schijfjes van elkaar.
- Aparte goed gedefinieerd en onbeschadigd plakjes van beschadigde schijfjes.
3. Hippocampus Slices Cultuur
- Breng de zes-well platen met SCM en celkweek inserts uit de incubator. Met de hulp van een ander geknipt P1000 filtertip, transfer afzonderlijke segmenten op het membraan. Leg 4-5 plakjes per membraan. Wees voorzichtig niet te plaatsen de plakjes ofwel dicht bij het invoegen muur of dicht bij elkaar. Indien nodig, gebruik iris spatel te scheiden plakken. Verwijder overtollig medium. Touch plakjes zo weinig mogelijk als ze eenmaal op het membraan.
- Verhuizen plaat terug naar incubator en cultuur bij 35 ° C en 5% CO 2.
- Verandering SCM elke 48 uur in de TC kap door opzuigen van de SCM met een Pasteur pipet. Voeg 750 ul van verse voorverwarmde SCM per well. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden gevormd onder het membraan.
4. Oplossingen
- Een lage Na + ACSF - Dissecting Oplossing voor slice culturen
Om gedeïoniseerd en steriele H 2 O toe te voegen:Voor 500 ml Voor 1000 ml Uiteindelijke concentratie CaCl 2 (1 M) 0,5 ml 1 mL 1 mM D-Glucose 0,901 g 1,802 g 10 mM KCl 0,149 g 0,298 g 4 mM MgCl 2 (1 M) 2,5 ml 5 ml 5 mM NaHCO 3 1,092 g 2,184 g 26 mM Sucrose 40 g 80 g 234 mM Fenolroodoplossing 0,5% in DPBS 0,5 ml 1 mL 0,1% v / v
Mix ~ 30 min
Sterilize door passage door 0.22μm filter
Maak 50 ml porties en bewaar bij 4 ° C niet langer dan 2 maanden. - Slice Cultuur Medium (SCM)
Voor 500 ml Voor 1000 ml Uiteindelijke concentratie MEM Eagle medium 4,2 g 8,4 g 8,4 g / l Paardenserum hitte geïnactiveerd 100 ml 200 ml 20% L-Glutamine (200 mm) 2,5 ml 5 ml 1 mM CaCl 2 (1 M) 0,5 ml 1 mL 1 mM MgSO 4 (1 M) 1 mL 2 mL 2 mM Insuline (1 mg / ml), opgelost in HCl 0,01 N 0,5 ml 1 mL 1 mg / l Ascorbinezuur, oplossing (25% w / v) 0,024 mL 0,048 mL 0,00125% D-Glucose 1.16g 2.32g 13 mM NaHCO 3 0.22g 0.44g 5.2 mM Hepes 3.58g 7.16g 30 mM
Meng tot alles goed opgelost en breng aan de kamertemperatuur.
Pas de pH op 7,27-7,28 met 1 N NaOH
Meten osmolariteit. Aan te passen aan 320 mmol / kg met gedeïoniseerd en gesteriliseerd H 2 O. Verwachten dat ongeveer 25 tot 40 ml toe te voegen. Controleer opnieuw osmolariteit.
*** PH kan iets veranderen tijdens het instellen van osmolariteit, is dit ok is, is het belangrijker dat de osmolariteit is in de juiste range (317-323).
Steriliseren passage door 0.22 urn filter.
Maak 20 ml porties en op te slaan voor maximaal twee-drie weken bij 4 ° C.
Gluatamine voorraad: voor te bereiden op een concentratie van 200 mM en bewaar bij -20 ° C in porties van 2,5 mL.
Ascorbinezuur voorraad: voor te bereiden op een concentratie van 25% (w / v) en opgeslagen bij -20 ° C in fracties van 100 pi.
5. Representatieve resultaten:
Slices moet wit kijk onder een dissectie bereik zonder zwarte vlekken en goed gedefinieerd en onbeschadigd CA1, CA3, en de dentate gyrus regio's. Bacteriële besmetting is gemakkelijk te zien als het verplaatsen zwarte vlekjes op de middellange of troebelheid van het SCM. Bij plaatsing onder de microscoop, moet het oppervlak van het plakje schoon te kijken na 4 dagen in cultuur met een duidelijke en waarneembaar cellichamen. Als er geen duidelijke cellichamen worden gezien en nog veel puin beslaat de oppervlakte na 4 dagen, dan is geen gezonde slice.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode is gebaseerd op de methode eerst beschreven door Stoppini et al.. Elf en biedt een snelle manier om de cultuur hippocampale slices. Het belangrijkste aspect van dit protocol is het handhaven van plakjes steriel, daarom is het van cruciaal belang voor geschikte steriele technieken te gebruiken en goed te desinfecteren en steriliseren van al het materiaal in contact met het weefsel.
Verschillende serums bronnen kunnen invloed hebben op de kwaliteit van de schijfjes. We raden aan het testen van verschillende partijen de eerste plaats. Indien de verontreiniging is een terugkerend probleem, check incubator en weefselkweek kap voor mogelijke bronnen van besmetting. Correct gebruik van steriele technieken tijdens de hele procedure is essentieel.
De totale tijd van de onthoofding het plaatsen van de plakjes op het membraan en in de incubator mag niet langer dan 1,5 uur. Als de procedure te lang duurt, zal het gevaar voor de gezondheid van de schijfjes.
Het plaatsen van de plakjes op een poreus membraan garanties een goede oxygenatie en voeding via een dunne laag van SCM, dat wordt gevormd door capillariteit. Deze methode kan worden aangepast aan andere hersengebieden op voorwaarde dat de dichtheid van het weefsel een goede oxygenatie en voedingsstoffen penetratie mogelijk maakt. Zo, tissue dichtheid beperkt deze methode om jonge weefsel. Voor de hippocampus, plakjes 300 tot 400 micrometer dik van p6-P7 dieren lijken om de beste resultaten te geven. Dit soort schijfjes kunnen snel worden verkregen met een tissue slicer het verminderen van de tijd het weefsel wordt blootgesteld aan de lucht.
Belangrijk voor wie zich bezighoudt synaptische fysiologie, na een paar dagen in cultuur, heeft al het puin van dode cellen verwijderd zijn, zodat een schoon oppervlak zeer geschikt voor elektrofysiologische of imaging experimenten. Daarnaast blijven organotypische hippocampale slices het ontwikkelen van een normale verbinding die vergelijkbaar zijn met acute plakjes 12. Echter na 2 weken in de cultuur dit normaal connectiviteit verdwijnt als neuronen start de vorming van te veel verbindingen die synaptische activiteit stijgingen in de slice.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door NINDS - NIH R01NS060756
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture inserts | EMD Millipore | PICM03050 | |
| 6 well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue Slicer | Stoelting Co. | 51425/51415 | |
| Microscope | Olympus Corporation | SZX7-ILLD2-100 | |
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T. | 10099-15 | |
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T. | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | |
| Iris Spatula | F.S.T. | 10093-13 | |
| Straight spatula | F.S.T. | 10094-13 | |
| Rounded spoon micro spatula | VWR international | 57949-039 | |
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Sciences | 72946 | |
| Dissecting tweezers | Dumont | #2 | |
| Small dissecting scissors | F.S.T. | 14060-10 | |
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | |
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | |
| CaCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4 (1 M) | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | M9272 |
References
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. ntroduction Long-term potentiation and structure of the issue. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).
- Shepherd, G. M. The synaptic organization of the brain. , 5th edn, University Press. Oxford. (2004).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Malinow, R. Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105, 331-343 (2001).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Esteban, J. A. PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity. Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).
- Mainen, Z. F. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18, 231-239 (1999).
- Barria, A., Malinow, R. Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses. Neuron. 35, 345-353 (2002).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Simoni, A. D. e, Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
