Summary
אנו מתארים שיטה להכין פרוסות בהיפוקמפוס organotypic כי ניתן להתאים בקלות לאזורים אחרים במוח. פרוסות המוח מוטלות על ממברנות נקבוביים התקשורת בתרבות מותר להקים ממשק. שיטה זו משמרת את הארכיטקטורה ברוטו של ההיפוקמפוס עד 2 שבועות בתרבות.
Abstract
ההיפוקמפוס, רכיב של המערכת הלימבית, משחק תפקידים חשובים בזיכרון לטווח ארוך וניווט מרחבי 1. נוירונים בהיפוקמפוס יכול לשנות את עוצמת הקשרים שלהם לאחר תקופות קצרות של הפעלה חזקה. תופעה זו, הידועה בשם potentiation לטווח ארוך (LTP) יכולה להימשך שעות או ימים הפך את המנגנון המועמד הטוב ביותר למידה וזיכרון 2. בנוסף, אנטומיה מוגדר היטב וקישוריות של ההיפוקמפוס 3 הפכה אותה מערכת מודל קלאסי ללמוד הילוכים הסינפטי ו 4 הפלסטיות הסינפטית.
כפי הבנתנו את הפיזיולוגיה של סינפסות בהיפוקמפוס גדל שחקנים מולקולריים הפך מזוהה, צורך לתמרן חלבונים סינפטיים הכרח. תרבויות בהיפוקמפוס Organotypic להציע את האפשרות למניפולציות הגן קל התערבות פרמקולוגית מדויק אבל לשמור על ארגון הסינפטי הוא קריטי להבנת תפקוד הסינפסה בהקשר נטורליסטי יותר בתרבות שיטות שגרתיות נוירונים ניתק.
כאן אנו מציגים שיטה להכין ותרבות פרוסות בהיפוקמפוס, כי ניתן להתאים בקלות לאזורים אחרים במוח. שיטה זו מאפשרת גישה קלה את פרוסות עבור מניפולציה גנטית באמצעות גישות שונות כמו זיהום ויראלי או 5,6 biolistics 7. בנוסף, פרוסות ניתן לשחזר בקלות עבור מבחני ביוכימיים 8, או להעביר מיקרוסקופים הדמיה 9 או בניסויים אלקטרו 10.
Protocol
1. לפני תחילת הכנת פרוסות בהיפוקמפוס.
- הכן את מבצעה רקמה על ידי הנחת פיסת סדין טפלון הרכבה להב חדש.
- נגבו את בתרבית רקמה (TC) ברדס עם אתנול 70% ולהגדיר את בתוך מיקרוסקופ לנתח. לעקר את מכסה המנוע, מיקרוסקופ, מבצעה רקמה וכל המכשירים לנתח במשך 15 דקות עם האור האולטרה סגול.
- הכן ושש צלחות גם TC. הוספת 750 μL תרבות פרוסה התקשורת (SCM) לכל מקום היטב בתרבות מוסיף התא בכל טוב. ודא הקרומים רטובים לחלוטין, ללא בועות מתחת. מקמי את הצלחות באינקובטור ב 35 מעלות צלזיוס בגז עם 5% CO 2 עד הצורך.
- יוצקים 50 מ"ל נמוך Na + ACSF (לנתח פתרון) לתוך כוס 100 מ"ל ומניחים אותו על תערובת קרח ומלח. הבועה נמוך Na + ACSF עם 5% CO 2 / 95% O 2 עד שינויים בצבע ACSF צורות תערובת slurry של פתרון קפואים נוזלי (10-20 דקות).
- קבל עכברוש P5-P7 הגור. עד שלושה גורים ניתן להשתמש.
2. הכנת פרוסות בהיפוקמפוס.
- חותכים את הראש של החיה במספריים חדים השירות. חותכים את העור ולחשוף את הגולגולת. פתח את הגולגולת על ידי חיתוך מצד לצד לאורך קו interaural ואז לאורך תפר sagittal במספריים קטנים. לחתוך אופציונלי מצד לצד בחזית ניתן להקל על הסרת העצמות החשיפה של המוח. סקופ את המוח במהירות עם מרית כף מעוגלות מיקרו למקם אותו slurry של ביתור פתרון צמרמורת במשך דקה 1 ~. יוצקים ~ 10 מ"ל של תמיסת קרים לנתח לצלחת 60 מ"מ ולהעביר את המוח מן הכוס אל הצלחת. המוח צריך להיות מכוסה לנתח פתרון.
- תחת מיקרוסקופ הניתוחים: מניחים את המוח להחזיק אותו קו האמצע עם מלקחיים לנתח נלחץ אל החלק התחתון של צלחת 60 מ"מ. השתמש בכלי ההיפוקמפוס לנתח כדי להפריד את האונות עוזב את המוח התיכון. Hippocampi חשופים אז על כל האונה. ואז בעדינות סקופ ההיפוקמפוס עם ההיפוקמפוס לנתח הכלי. השתמש איזמל המנתחים לחלוטין לבודד את ההיפוקמפוס לנקות אותו כמה שיותר.
- בעזרת קצה קיצצו של טיפ P1000 פיפטה לסנן, לשאוב בעדינות ההיפוקמפוס ולהעביר אותו גיליון טפלון על מבצעה את הרקמה. מקם את ההיפוקמפוס בצד הקעור שלה.
- יישר את בניצב hippocampi ללהב להשיג חלקים העטרה ומסננים עודפי נוזלים.
- פורסים את hippocampi כל 400 מיקרומטר.
- יוצקים ~ 10 מ"ל קר SCM לצלוחית 60 מ"מ ולהעביר פרוס hippocampi של מבצעה באמצעות אחר קיצצו P1000 קצה לסנן קר SCM. הימנע עושה בועות.
- בעזרת מרית איריס מרית ישר בעדינות להפריד את הפרוסות זו מזו.
- הפרד פרוסות מוגדר היטב ניזוק מן פרוסות פגום.
3. תרבות Slices בהיפוקמפוס
- תביאו את שש גם צלחות עם SCM ותרבות מוסיף התא מן החממה. בעזרת קצה אחר P1000 קיצצו לסנן, להעביר את פרוסות בודדות על הממברנה. מניחים פרוסות 4-5 לכל הממברנה. היזהר שלא במקום הפרוסות או קרוב לקיר להוסיף או קרובים זה לזה. בעת הצורך, להשתמש במרית בקשתית פרוסות נפרדות. הסר בינוני עודף. מגע פרוסות מעט ככל האפשר פעם הם על הממברנה.
- העברה צלחת חזרה חממה ותרבות ב 35 ° C ו 5% CO 2.
- שנה SCM כל 48 שעות בתוך מכסה המנוע על ידי TC aspirating SCM עם פיפטה פסטר. הוספת 750 μL של טרי מראש חימם SCM לכל טוב. ודא שאין בועות נוצרות תחת הממברנה.
4. פתרונות
- נמוכה Na + ACSF - פתרון הביתור עבור תרבויות פרוסה
כדי deionized וסטרילי H 2 O להוסיף:עבור 500 מ"ל עבור מ"ל 1000 הריכוז הסופי CaCl 2 (1 ז) 0.5 מ"ל 1 מ"ל 1 mM D-גלוקוז 0.901 גרם 1.802 גרם 10 mM KCl 0.149 גרם 0.298 גרם 4 מ"מ MgCl 2 (1 ז) 2.5 מ"ל 5 מ"ל 5 מ"מ NaHCO 3 1.092 גרם 2.184 גרם 26 מ"מ סוכרוז 40 גרם 80 גרם 234 mM הפתרון האדום פנול 0.5% ב DPBS 0.5 מ"ל 1 מ"ל 0.1% v / v
מערבבים ~ 30 דקות
Sterilize על ידי מעבר דרך מסנן 0.22μm
בצע 50 מ"ל aliquots ולאחסן ב 4 ° C לא יותר מ 2 חודשים. - תרבות Slice בינוני (SCM)
עבור 500 מ"ל עבור מ"ל 1000 הריכוז הסופי ממ הנשר בינוני 4.2 גרם 8.4 גרם 8.4 g / l סוס חום בסרום מומת 100 מ"ל 200 מ"ל 20% L-גלוטמין (200 מ"מ) 2.5 מ"ל 5 מ"ל 1 mM CaCl 2 (1 ז) 0.5 מ"ל 1 מ"ל 1 mM MgSO 4 (1 מ ') 1 מ"ל 2 מ"ל 2 מ"מ אינסולין (1 מ"ג / מ"ל), מומס HCl 0.01 N 0.5 מ"ל 1 מ"ל 1 מ"ג / ליטר חומצה אסקורבית, פתרון (25% w / v) .024 מ"ל .048 מ"ל 0.00125% D-גלוקוז 1.16g 2.32g 13 מ"מ NaHCO 3 0.22g 0.44g 5.2 mM Hepes 3.58g 7.16g 30 מ"מ
מערבבים עד שהיא נמסה היטב ומביאים לטמפרטורת החדר.
התאם את ה-pH 7.27-7.28 עם 1 N NaOH
מדוד osmolarity. התאם עד 320 מילימול / ק"ג עם deionized ו מעוקרים H 2 O. מצפים להוסיף כ 25-40 מ"ל. בדוק osmolarity שוב.
*** PH עשוי להשתנות מעט תוך התאמת osmolarity, זה בסדר, חשוב יותר כי osmolarity נמצאת בטווח הנכון (317-323).
לעקר ע"י מעבר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.
בצע 20 מ"ל aliquots ולאחסן עד 2-3 שבועות 4 ° C.
מניות Gluatamine: להכין בריכוז של 200 מ"מ ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס aliquots של 2.5 מ"ל.
חומצה אסקורבית המניות: להכין בריכוז של 25% (w / v) המאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס aliquots של μL 100.
5. נציג תוצאות:
Slices צריך להיראות לבן תחת בהיקף לנתח בלי כתמים שחורים ומוגדרים היטב CA1 ניזוק, CA3, ואזורים gyrus משוננת. זיהום חיידקי נתפסת בקלות כמו כתמים שחורים נעים בטווח הבינוני או עכירות של SCM. כאשר הניח מתחת למיקרוסקופ, את פני השטח של הפרוסה צריך להיראות נקי אחרי 4 ימים בתרבות עם גופי התא ברורה ניכר בו. אם לא ברור גופי התא נראים ופסולת הרבה המכסה את פני השטח לאחר 4 ימים, אז לא פרוסה בריא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה זו מבוססת על השיטה שתוארה לראשונה על ידי Stoppini et al. 11 ומציע בצורה מהירה פרוסות תרבות בהיפוקמפוס. ההיבט החשוב ביותר של פרוטוקול זה היא לשמור על פרוסות סטרילי ולכן זה קריטי להשתמש בטכניקות סטרילי המתאים כראוי לחיטוי לעקר את כל החומר במגע עם רקמות.
מקורות שונים serums יכולים להשפיע על איכות הפרוסות. אנו ממליצים על בדיקות קבוצות הראשונות. אם הזיהום הוא בעיה חוזרת, לבדוק החממה בתרבית רקמה מכסה המנוע של מקורות אפשריים של זיהום. שימוש נכון בטכניקות סטריליות במהלך ההליך כולו היא חיונית.
הזמן הכולל של עריפת ראש הצבת את הפרוסות על הממברנה ואת בחממה צריך להיות לא יותר מ 1.5 שעות. אם התהליך לוקח יותר מדי זמן, זה יהיה לסכן את בריאותם של הפרוסות.
הנחת פרוסות על חמצון הממברנה אחריות נקבובי תזונה נכונה באמצעות שכבה דקה של SCM כי הוא נוצר על ידי קפילריות. שיטה זו ניתן להתאים באזורי מוח אחרים בתנאי הצפיפות של הרקמה מאפשר חמצון תקין החדירה מזין. לכן, צפיפות רקמת גבולות בשיטה זו רקמת צעירים. עבור בהיפוקמפוס, פרוסות 300-400 מיקרומטר עבה P7 מ-P6 החיות נראה לתת תוצאות מיטביות. סוג זה של פרוסות יכול במהירות לקבל עם מבצעה רקמה צמצום הזמן רקמת חשוף לאוויר.
חשוב עבור הלומדים פיזיולוגיה הסינפטי, אחרי כמה ימים בתרבות, כל פסולת מן התאים המתים הוסר, משאיר משטח נקי מתאים במיוחד עבור ניסויים אלקטרו או הדמיה. בנוסף, פרוסות בהיפוקמפוס organotypic להמשיך לפתח קישוריות נורמלי להשוות פרוסות חריפה 12. זאת לאחר 2 שבועות בתרבות זו קישוריות נורמלי נעלם כמו הנוירונים מתחילים ויוצרים קשרים רבים מדי אשר מגביר פעילות סינפטית של הפרוסה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי NINDS - NIH R01NS060756
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture inserts | EMD Millipore | PICM03050 | |
| 6 well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue Slicer | Stoelting Co. | 51425/51415 | |
| Microscope | Olympus Corporation | SZX7-ILLD2-100 | |
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T. | 10099-15 | |
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T. | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | |
| Iris Spatula | F.S.T. | 10093-13 | |
| Straight spatula | F.S.T. | 10094-13 | |
| Rounded spoon micro spatula | VWR international | 57949-039 | |
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Sciences | 72946 | |
| Dissecting tweezers | Dumont | #2 | |
| Small dissecting scissors | F.S.T. | 14060-10 | |
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | |
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | |
| CaCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4 (1 M) | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | M9272 |
References
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. ntroduction Long-term potentiation and structure of the issue. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).
- Shepherd, G. M. The synaptic organization of the brain. , 5th edn, University Press. Oxford. (2004).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Malinow, R. Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105, 331-343 (2001).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Esteban, J. A. PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity. Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).
- Mainen, Z. F. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18, 231-239 (1999).
- Barria, A., Malinow, R. Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses. Neuron. 35, 345-353 (2002).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Simoni, A. D. e, Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
