Summary
Descriviamo un metodo per preparare organotipica fettine di ippocampo che può essere facilmente adattato ad altre regioni del cervello. Sezioni di cervello sono previste sulle membrane porose e terreni di coltura è consentito costituiscono l'interfaccia. Questo metodo consente di mantenere l'architettura lordo dell'ippocampo per un massimo di 2 settimane in cultura.
Abstract
L'ippocampo, un componente del sistema limbico, gioca un ruolo importante nella memoria a lungo termine e la navigazione spaziale 1. Neuroni dell'ippocampo può modificare la forza delle loro connessioni, dopo brevi periodi di forte attivazione. Questo fenomeno, noto come potenziamento a lungo termine (LTP), può durare per ore o giorni ed è diventato il meccanismo miglior candidato per l'apprendimento e la memoria 2. Inoltre, l'anatomia ben definito e connettività dell'ippocampo 3 ha fatto un sistema modello per lo studio classico trasmissione sinaptica e 4 plasticità sinaptica.
Come la nostra comprensione della fisiologia delle sinapsi dell'ippocampo crebbe e giocatori molecolare è stato identificato, la necessità di manipolare proteine sinaptiche è diventato un imperativo. Organotipica culture dell'ippocampo offrono la possibilità di manipolazione genetica facile e preciso l'intervento farmacologico, ma mantenere l'organizzazione sinaptica che è fondamentale per comprendere la funzione sinapsi in un contesto più naturalistico di routine cultura metodi dissociato neuroni.
Qui vi presentiamo un metodo per la preparazione e la cultura fettine di ippocampo, che può essere facilmente adattato ad altre regioni del cervello. Questo metodo permette di raggiungere facilmente le fette di manipolazione genetica utilizzando approcci diversi, come infezioni virali o 5,6 biolistics 7. Inoltre, fette può essere facilmente recuperato per le analisi biochimiche 8, o trasferiti ad microscopi per l'imaging 9 o esperimenti elettrofisiologici 10.
Protocol
1. Prima di avviare la preparazione di fettine di ippocampo.
- Preparare l'affettatrice tessuto mettendo un pezzo di foglio di teflon e montare una nuova lama.
- Pulire la coltura del tessuto (TC) cappuccio con il 70% di etanolo e impostare l'interno microscopio da dissezione. Sterilizzare il cofano, microscopio, affettatrice tessuti e tutti gli strumenti di dissezione per 15 minuti con la luce UV.
- Preparare sei piastre TC. Aggiungere 750 microlitri terreni di coltura slice (SCM) per bene e posto inserti in colture cellulari in ciascun pozzetto. Assicurarsi che le membrane sono completamente bagnato senza bolle sotto. Posizionare le piastre in incubatore a 35 ° C gasati con 5% CO 2 fino al momento dell'uso.
- Versare 50 ml basso Na + ACSF (dissezione soluzione) in un bicchiere da 100 ml e posizionarlo sul ghiaccio-sale mix. Bubble basso Na + ACSF con 5% di CO 2 / 95% O 2 fino ACSF cambia colore e forma un impasto impasto di soluzione congelata e liquidi (10-20 min).
- Prendi un P5-P7 piccoli dei ratti. Fino a tre cuccioli possono essere utilizzati.
2. Dell'ippocampo Fette Preparazione.
- Tagliare la testa dell'animale con le forbici utilità taglienti. Tagliare la pelle ed esporre il cranio. Aprire il cranio, tagliando da un lato all'altro lungo la linea interaurali e poi lungo la sutura sagittale con piccole forbici. Un taglio opzionale da un lato all'altro nella parte anteriore può essere fatto per facilitare la rimozione delle ossa e l'esposizione del cervello. Scoop fuori il cervello rapidamente con una spatola cucchiaio arrotondati micro e posizionarlo nel liquame di dissezione soluzione per raffreddare per circa 1 minuto. Versare circa 10 ml di soluzione ghiacciata dissezione su un piatto di 60 mm e trasferire il cervello dal bicchiere al piatto. Il cervello dovrebbe essere coperto con dissezione soluzione.
- Sotto il microscopio dissezione: Posizionare il cervello e mantenerlo sulla linea mediana con il dissettore premuto fino in fondo del piatto 60 mm. Utilizzare lo strumento ippocampo dissezione per separare gli emisferi lasciando fuori il mesencefalo. Il dell'ippocampo sono quindi esposti su ogni emisfero. Poi dolcemente scoop l'ippocampo con l'ippocampo dissezione strumento. Utilizzare l'ago dissezione per isolare completamente l'ippocampo e pulirlo il più possibile.
- Utilizzando una punta tagliato di un filtro P1000 punta della pipetta, delicatamente aspirato l'ippocampo e trasferirlo al foglio di Teflon per l'affettatrice tessuto. Posizionare l'ippocampo sul lato concavo.
- Allineare la perpendicolare dell'ippocampo alla lama di ottenere sezioni coronali e drenare l'eccesso di liquido.
- Tagliare il dell'ippocampo ogni 400 micron.
- Versare circa 10 ml freddo SCM in un piatto di 60 mm e il trasferimento a fette dell'ippocampo dal affettatrice utilizzando un altro è stato tagliato P1000 filtro punta e freddo SCM. Evitare di fare bolle.
- Con l'aiuto di una spatola di iris e una spatola diritta separare delicatamente le fette le une dalle altre.
- Separare le fette ben definito e non danneggiati da fette danneggiato.
3. Dell'ippocampo Fette Cultura
- Portare a sei pozzetti con SCM e inserti colture cellulari dal termostato. Con l'aiuto di un altro stato tagliato P1000 punta filtro, il trasferimento di singole sezioni sulla membrana. Mettere le fette 4-5 per membrana. Fare attenzione a non mettere le fette sia vicino al muro inserire o vicini gli uni agli altri. Quando necessario, utilizzare spatola iride a fette separate. Rimuovere l'eccesso di media. Tocco fette il meno possibile una volta che sono sulla membrana.
- Spostare la piastra posteriore per incubatrice e cultura a 35 ° C e 5% di CO 2.
- Cambia SCM ogni 48 ore all'interno della cappa di aspirazione TC del CSM con una pipetta Pasteur. Aggiungere 750 ml di fresca pre-riscaldato SCM per bene. Assicurarsi che non bolle si formano sotto la membrana.
4. Soluzioni
- Bassa Na + ACSF - Soluzione Dissezione di culture fetta
Per deionizzata e sterile H 2 O aggiungere:Per 500 ml Per 1000 ml Concentrazione finale CaCl 2 (1 M) 0,5 ml 1 ml 1 mM D-glucosio 0,901 g 1,802 g 10 mM KCl 0,149 g 0,298 g 4 mM MgCl 2 (1 M) 2,5 ml 5 ml 5 mM NaHCO 3 1,092 g 2,184 g 26 mm Saccarosio 40 g 80 g 234 mm Soluzione di rosso fenolo 0,5% nel DPBS 0,5 ml 1 ml 0,1% v / v
Mix ~ 30 min
Sterilize dal passaggio attraverso 0.22μm filtro
Fai aliquote di 50 mL e conservare a 4 ° C non più di 2 mesi. - Fetta terreno di coltura (SCM)
Per 500 ml Per 1000 ml Concentrazione finale MEM di Eagle medium 4,2 g 8,4 g 8,4 g / l Calore siero di cavallo inattivato 100 ml 200 mL 20% L-Glutammina (200 mm) 2,5 ml 5 ml 1 mM CaCl 2 (1 M) 0,5 ml 1 ml 1 mM MgSO 4 (1 M) 1 ml 2 ml 2 mM Insulina (1 mg / mL), disciolto in HCl 0,01 N 0,5 ml 1 ml 1 mg / l Acido ascorbico, soluzione (25% w / v) 0,024 ml 0,048 ml 0,00125% D-glucosio 1.16g 2.32g 13 mm NaHCO 3 0.22g 0.44g 5,2 mm Hepes 3.58g 7.16g 30 mM
Mescolare fino a fondo sciolto e portare a temperatura ambiente.
Regolare il pH a 7,27-7,28 con 1 N NaOH
Misura osmolarità. Regolare a 320 mmol / kg con acqua deionizzata e sterilizzata H 2 O. Aspettatevi di aggiungere circa 25-40 ml. Controllare osmolarità di nuovo.
*** PH possono cambiare leggermente durante la regolazione dell'osmolarità, questo è ok, è più importante che l'osmolarità è nella gamma corretta (317-323).
Sterilizzare il passaggio attraverso filtro 0,22 micron.
Fare 20 aliquote da ml e conservare per un massimo di 2-3 settimane a 4 ° C.
Magazzino Gluatamine: preparare ad una concentrazione di 200 mm e conservare a -20 ° C in aliquote di 2,5 ml.
L'acido ascorbico magazzino: preparare ad una concentrazione del 25% (w / v) e conservati a -20 ° C in aliquote di 100 ul.
5. Rappresentante dei risultati:
Fette dovrebbe apparire bianco sotto una portata dissezione senza macchie nere e ben definite e non danneggiato CA1, CA3 e giro dentato regioni. La contaminazione batterica è facilmente visibile lo spostamento punti neri nel medio o torbidità della SCM. Quando viene posto sotto il microscopio, la superficie della fetta dovrebbe essere pulita dopo 4 giorni di cultura con gli enti a cellule chiare e visibilmente. Se non corpi a cellule chiare sono visti e detriti molto ricopre la superficie dopo 4 giorni, quindi non è una fetta sano.
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Discussion
Questo metodo si basa sul primo metodo descritto da Stoppini et al. 11 e offre un modo rapido a fette cultura dell'ippocampo. L'aspetto più importante di questo protocollo è quello di mantenere fette sterile, quindi è fondamentale utilizzare appropriate tecniche sterili e per disinfettare correttamente e sterilizzare tutto il materiale a contatto con il tessuto.
Diverse fonti sieri possono influenzare la qualità delle fette. Si consiglia di provare diversi lotti per primo. Se la contaminazione è un problema ricorrente, controllare incubatore e la cultura cappuccio di tessuto per possibili fonti di contaminazione. L'uso corretto di tecniche sterili durante l'intera procedura è essenziale.
Il tempo totale di decapitazione a porre le fette sulla membrana e nel incubatore dovrebbe essere più lungo di 1,5 ore. Se la procedura richiede troppo tempo, sarà compromettere la salute delle fette.
Mettere le fette su un ossigenazione a membrana porosa garanzie corretta e la nutrizione tramite un sottile strato di SCM che si forma per capillarità. Questo metodo può essere adattato alle altre regioni del cervello a condizione che la densità del tessuto permette una corretta ossigenazione e la penetrazione dei nutrienti. Così, la densità del tessuto limiti di questo metodo per i tessuti giovani. Per ippocampo, fette di 300-400 micron di spessore da p6-p7 animali sembrano dare i risultati migliori. Questo tipo di fette può rapidamente essere ottenuto con una affettatrice tessuto diminuendo il tempo è esposto il tessuto all'aria.
Importante per coloro che studiano la fisiologia sinaptica, dopo alcuni giorni di cultura, tutti i detriti dalle cellule morte è stato rimosso, lasciando una superficie pulita molto adatto per studi elettrofisiologici o imaging. Inoltre, organotipica fettine di ippocampo continuare lo sviluppo della connettività normale paragonabile a fette acuta 12. Tuttavia, dopo 2 settimane in questa cultura connettività normale scompare come i neuroni cominciano a formare troppe connessioni che aumenta l'attività sinaptica in fetta.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal NINDS - NIH R01NS060756
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture inserts | EMD Millipore | PICM03050 | |
| 6 well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue Slicer | Stoelting Co. | 51425/51415 | |
| Microscope | Olympus Corporation | SZX7-ILLD2-100 | |
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T. | 10099-15 | |
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T. | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | |
| Iris Spatula | F.S.T. | 10093-13 | |
| Straight spatula | F.S.T. | 10094-13 | |
| Rounded spoon micro spatula | VWR international | 57949-039 | |
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Sciences | 72946 | |
| Dissecting tweezers | Dumont | #2 | |
| Small dissecting scissors | F.S.T. | 14060-10 | |
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | |
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | |
| CaCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4 (1 M) | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | M9272 |
References
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