Summary
Nós descrevemos um método para preparar organotípicas fatias do hipocampo que pode ser facilmente adaptado a outras regiões do cérebro. Fatias de cérebro são colocadas em membranas porosas e meios de cultura está autorizado a formar uma interface. Este método preserva a arquitetura bruta do hipocampo para até duas semanas em cultura.
Abstract
O hipocampo, um componente do sistema límbico, desempenha um papel importante na memória de longo prazo e navegação espacial 1. Neurônios do hipocampo pode modificar a força de suas conexões, após breves períodos de forte ativação. Esse fenômeno, conhecido como potenciação de longa duração (LTP) pode durar horas ou dias e tornou-se o mecanismo melhor candidato para o aprendizado ea memória 2. Além disso, a anatomia bem definidos e conectividade do hipocampo 3 tornou um sistema modelo clássico para estudar a transmissão sináptica e 4 plasticidade sináptica.
Como nossa compreensão da fisiologia das sinapses do hipocampo cresceu e jogadores molecular tornou-se identificado, a necessidade de manipular proteínas sinápticas tornou-se imperativo. Organotípicas culturas hipocampais oferecer a possibilidade de manipulação genética fácil e intervenção farmacológica, mas precisa manter a organização sináptica que é fundamental para a compreensão da função sinapse em um contexto mais naturalista do que rotina métodos cultura dissociada neurônios.
Aqui apresentamos um método para preparar e cultura fatias do hipocampo que pode ser facilmente adaptado a outras regiões do cérebro. Este método permite fácil acesso às fatias para a manipulação genética usando abordagens diferentes, como infecção viral ou 5,6 Biolistics 7. Além disso, as fatias podem ser facilmente recuperados para ensaios bioquímicos 8, ou transferidos para microscópios para imagens de 9 ou 10 experimentos eletrofisiológicos.
Protocol
1. Antes de iniciar a preparação de fatias do hipocampo.
- Prepare o slicer tecido, colocando um pedaço de folha de teflon e montagem de uma nova lâmina.
- Limpe a cultura de tecidos capô (TC) com etanol 70% e definir o interior microscópio de dissecação. Esterilizar o capô, microscópio, slicer tecido e todos os instrumentos de dissecação por 15 minutos com a luz UV.
- Preparar seis pratos bem TC. Adicionar 750 mL da cultura de mídia fatia (SCM) por bem e colocar insere cultura de células em cada poço. Certifique-se que as membranas são completamente molhado com nenhuma bolha por baixo. Coloque as placas em estufa a 35 ° C gaseados com 5% de CO 2 até necessário.
- Despeje 50 mL baixo Na + ACSF (dissecando solução) em um copo de 100 ml e coloque-o no gelo sal-mix. A bolha baixo Na + ACSF com 5% de CO 2 / 95% O 2 até que muda de cor e formas ACSF uma mistura de chorume de solução congelada e líquidos (10-20 min).
- Obter um rato P5-P7 filhote. Até três filhotes podem ser usados.
2. Preparação fatias do hipocampo.
- Cortar a cabeça do animal com uma tesoura afiada utilitário. Cortar a pele e expor o crânio. Abrir o crânio, cortando de lado a lado ao longo da linha interaural e depois ao longo da sutura sagital com uma tesoura pequena. Um corte opcional de lado a lado na frente pode ser feito para facilitar a remoção dos ossos e da exposição do cérebro. Retire o cérebro rapidamente com uma espátula colher arredondada micro e colocá-lo na pasta de dissecar solução para refrigerar para ~ 1 minuto. Despeje ~ 10 mL de solução gelada de dissecação em um prato de 60 mm e transferir o cérebro do copo ao prato. O cérebro deve ser coberto com dissecação solução.
- Sob o microscópio de dissecação: Coloque o cérebro e mantê-lo na linha média com a pinça de dissecação pressionado para o fundo do prato de 60 mm. Use a ferramenta de hipocampo de dissecação para separar os hemisférios deixando de fora o mesencéfalo. O hipocampo são expostos em cada hemisfério. Então suavemente colher o hipocampo com o hipocampo dissecar ferramenta. Use a agulha de dissecação para isolar completamente o hipocampo e limpá-lo, tanto quanto possível.
- Usando uma ponta de um snipped P1000 ponteira de filtro, aspirar cuidadosamente o hipocampo e transferi-lo para a folha de Teflon na slicer tecido. Posição do hipocampo em seu lado côncavo.
- Alinhar o hipocampo perpendicular à lâmina para obtenção de cortes coronal e drenar o excesso de líquido.
- Corte o hipocampo cada mM 400.
- Despeje ~ 10 mL frio SCM em um prato de 60 mm e de transferência de fatias do hipocampo slicer usando outro snipped P1000 ponta de filtro e frio SCM. Evite fazer bolhas.
- Com a ajuda de uma espátula de íris e uma espátula reta separar delicadamente as fatias do outro.
- Separe fatias bem definidos e sem danos de fatias danificado.
3. Cultura fatias do hipocampo
- Trazer as placas de seis bem com SCM e inserções de cultura de células da incubadora. Com a ajuda de uma outra ponta P1000 snipped filtro, transferência de fatias individuais para a membrana. Coloque fatias de 4-5 por membrana. Tenha cuidado para não colocar as fatias ou perto da parede inserir ou próximos uns dos outros. Quando necessário, use uma espátula de íris em fatias separadas. Remova o meio de excesso. Toque fatias tão pouco quanto possível uma vez que estão na membrana.
- Mova placa de volta para incubadora e cultura a 35 ° CO C e 5% 2.
- Alterar SCM cada 48 horas no interior do capô TC por aspiração do SCM com uma pipeta Pasteur. Adicionar 750 mL de produtos frescos pré-aquecido SCM por poço. Verifique se não há bolhas são formadas sob a membrana.
4. Soluções
- Baixa Na + ACSF - Solução Dissecting para culturas fatia
Para deionizada e estéril H 2 O add:Para 500 mL Para 1000 mL Concentração Final CaCl 2 (1 M) 0,5 mL 1 mL 1 mM D-Glicose 0,901 g 1,802 g 10 mM KCl 0,149 g 0,298 g 4 mM MgCl 2 (1 M) 2,5 mL 5 mL 5 mM NaHCO 3 1,092 g 2,184 g 26 mM Sacarose 40 g 80 g 234 mM Solução Vermelho de fenol 0,5% em DPBS 0,5 mL 1 mL 0,1% v / v
Mix ~ 30 min
Sterilize pela passagem através de filtro de 0.22μm
Fazer 50 mL alíquotas e armazenar a 4 ° C no máximo dois meses. - Médio fatia Cultura (SCM)
Para 500 mL Para 1000 mL Concentração Final MEM de Eagle médio 4,2 g 8,4 g 8,4 g / l Cavalo de calor soro inativado 100 mL 200 mL 20% L-Glutamina (200 mM) 2,5 mL 5 mL 1 mM CaCl 2 (1 M) 0,5 mL 1 mL 1 mM MgSO 4 (1 M) 1 mL 2 mL 2 mM Insulina (1 mg / mL), dissolvido em HCl 0,01 N 0,5 mL 1 mL 1 mg / l Ácido ascórbico, solução (25% w / v) 0,024 mL 0,048 mL 0,00125% D-Glicose 1,16 g 2.32g 13 mM NaHCO 3 0.22g 0.44g 5,2 mM Hepes 3.58g 7.16g 30 mM
Misture até ficar bem dissolvido e trazer à temperatura ambiente.
Ajustar o pH a 7,27-7,28 com NaOH 1 N
Osmolaridade medida. Ajuste a 320 mmol / kg com deionizada e esterilizados H 2 O. Espera adicionar aproximadamente 25-40 mL. Verifique osmolaridade novamente.
*** PH pode mudar um pouco durante o ajuste da osmolaridade, isso é ok, é mais importante que a osmolaridade está na faixa correta (317-323).
Esterilizar em passagem pelo filtro de 0,22 mM.
Faça 20 mL alíquotas e armazenar por até 2-3 semanas a 4 ° C.
Gluatamine estoque: prepare a uma concentração de 200 mM e armazenar a -20 ° C em alíquotas de 2,5 mL.
Estoque de ácido ascórbico: prepare a uma concentração de 25% (w / v) e armazenadas a -20 ° C em alíquotas de 100 mL.
5. Resultados representativos:
Fatias deve olhar branco sob um escopo dissecar sem manchas negras e bem definidas e sem danos CA1, CA3, e regiões do giro denteado. Contaminação bacteriana é facilmente visto como movendo pintas pretas no meio ou turvação da SCM. Quando colocado sob o microscópio, a superfície da fatia deve olhar limpo após 4 dias em cultura, com corpos celulares claro e perceptivelmente. Se nenhum corpo de células claras são vistas e detritos muito cobre a superfície após 4 dias, então não é uma fatia saudável.
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Discussion
Este método é baseado no método descrito pela primeira vez por Stoppini et al. 11 e oferece uma forma rápida de fatias do hipocampo cultura. O aspecto mais importante deste protocolo é para manter fatias de estéril e por isso é fundamental para o uso adequado de técnicas estéreis e adequadamente desinfectar e esterilizar todo o material em contato com o tecido.
Fontes diferentes soros podem influenciar a qualidade das fatias. É aconselhável testar vários lotes em primeiro lugar. Se a contaminação é um problema recorrente, verifique incubadora e capuz de cultura de tecidos para possíveis fontes de contaminação. Uso adequado de técnicas estéreis durante todo o procedimento é essencial.
O tempo total de decapitação de colocar as fatias na membrana e na incubadora não deve ter mais de 1,5 horas. Se o procedimento leva muito tempo, vai comprometer a saúde das fatias.
Colocar as fatias em uma porosa oxigenação garantias membrana adequada e nutrição através de uma fina camada de SCM, que é formado por capilaridade. Este método pode ser adaptado para outras regiões do cérebro, desde que a densidade do tecido permite a oxigenação adequada e penetração de nutrientes. Assim, a densidade do tecido limita este método para tecidos jovens. Para hipocampo, fatias de 300-400 mm de espessura de p7-p6 animais parecem dar melhores resultados. Este tipo de fatias podem rapidamente ser obtida com um cortador de tecidos diminuindo o tempo o tecido é exposto ao ar.
Importante para aqueles que estudam fisiologia sináptica, depois de alguns dias em cultura, todos os restos de células mortas foi removido, deixando uma superfície limpa altamente adequado para experimentos eletrofisiológicos e de imagem. Além disso, organotípicas fatias do hipocampo continuar a desenvolver a conectividade normal, comparável com fatias aguda 12. No entanto, após duas semanas em cultura essa conectividade normal desaparece como os neurônios começam a se formar muitas conexões que a atividade sináptica aumenta na fatia.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NINDS - NIH R01NS060756
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture inserts | EMD Millipore | PICM03050 | |
| 6 well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue Slicer | Stoelting Co. | 51425/51415 | |
| Microscope | Olympus Corporation | SZX7-ILLD2-100 | |
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T. | 10099-15 | |
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T. | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | |
| Iris Spatula | F.S.T. | 10093-13 | |
| Straight spatula | F.S.T. | 10094-13 | |
| Rounded spoon micro spatula | VWR international | 57949-039 | |
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Sciences | 72946 | |
| Dissecting tweezers | Dumont | #2 | |
| Small dissecting scissors | F.S.T. | 14060-10 | |
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | |
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | |
| CaCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4 (1 M) | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | M9272 |
References
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