Summary
Vi beskriver en metod för att förbereda organotypic hippocampus skivor som lätt kan anpassas till andra delar av hjärnan. Hjärnan skivor läggs på porösa membran och mediekulturen tillåts bilda ett gränssnitt. Denna metod bevarar de grova arkitektur hippocampus i upp till 2 veckor i kulturen.
Abstract
Hippocampus, en del av det limbiska systemet spelar en viktig roll i långtidsminnet och rumslig navigering 1. Hippocampus nervceller kan ändra styrkan i deras anslutningar efter korta perioder av stark aktivering. Detta fenomen, som kallas långsiktig potentiering (LTP) kan pågå i timmar eller dagar och har blivit den bästa kandidaten mekanism för inlärning och minne 2. Dessutom har väl definierade anatomi och anslutning av hippocampus 3 gjorde det till en klassisk modell för att studera synaptisk transmission och synaptisk plasticitet 4.
Som vår förståelse av fysiologi hippocampus synapser växte och molekylära spelare blev identifierade, blev ett behov av att manipulera synaptiska proteiner absolut nödvändigt. Organotypic hippocampus kulturer ger möjlighet för enkel genmanipulation och exakt farmakologisk intervention men behålla synaptiska organisation som är avgörande för att förstå synaps fungerar i ett mer naturalistiskt sammanhang än dissocierade rutin kultur nervceller metoder.
Här presenterar vi en metod för att förbereda och kultur hippocampus skivor som lätt kan anpassas till andra delar av hjärnan. Denna metod ger enkel åtkomst till skivor för genetisk manipulation med hjälp av olika metoder såsom virusinfektion 5,6 eller biolistics 7. Dessutom kan skivor lätt återvinnas för biokemiska analyser 8, eller överföras till mikroskop för avbildning 9 eller elektrofysiologiska experiment 10.
Protocol
1. Innan Beredning av hippocampus skivor.
- Förbered vävnaden slicer genom att placera en bit av teflon plåt och montera ett nytt blad.
- Torka vävnadsodling (TC) huva med 70% etanol och ställ dissekera mikroskop insidan. Sterilisera huven, mikroskop, vävnad slicer och alla dissekera instrument i 15 minuter med UV-ljus.
- Förbered sex väl TC plattor. Tillsätt 750 mikroliter media slice kultur (SCM) per brunn och placera cellen infogar kultur i varje brunn. Se till att membranen är genomblött utan bubblor under. Placera plattorna i inkubatorn vid 35 ° C gasade med 5% CO 2 tills det behövs.
- Häll 50 ml låg Na + ACSF (dissekera lösning) i en 100 ml bägare och placera den på is-salt blandningen. Bubble låg Na + ACSF med 5% CO 2 / 95% O 2 tills ändrar färg och ACSF bildar en slurry blandning av fryst och flytande lösning (10-20 min).
- Skaffa en P5-P7 hos råttungar. Upp till tre ungar kan användas.
2. Hippocampus Slices Förberedelser.
- Skär huvudet av djur med vassa verktyg sax. Skär huden och exponera skallen. Öppna skallen genom att klippa från sida till sida längs interaural linjen och sedan längs sagittala suturen med en liten sax. En valfri klippa från sida till sida i fronten kan göras för att underlätta att ta bort ben och exponeringen av hjärnan. Gröp ur hjärnan snabbt med en rundad sked mikro spatel och placera den i slammet i dissekera lösning för att kyla för ~ 1 minut. Häll ~ 10 ml iskall dissekera lösningen på en 60 mm skålen och överför hjärnan från bägaren till skålen. Hjärnan bör täckas med dissekera lösning.
- Enligt dissecting mikroskopet: Placera hjärnan och håll den vid mittlinjen med dissekera pincett pressas mot botten av 60 mm skålen. Använd hippocampus dissekera verktyg för att separera halvkloten utelämna mellanhjärnan. Den hippocampi sedan utsätts för varje halvklotet. Sedan försiktigt scoop hippocampus ut med hippocampus dissekera verktyget. Använd dissecting nål för att helt isolera hippocampus och rengör den så mycket som möjligt.
- Med hjälp av en klippt spetsen på en P1000-filter pipettspets försiktigt aspirera hippocampus och överföra den till Teflon arket på vävnaden slicer. Placera hippocampus på dess konkava sida.
- Rikta in hippocampi vinkelrätt mot bladet för att få koronalt sektioner och avlopp överskott av vätska.
- Skiva hippocampi var 400 ìm.
- Häll ca 10 ml kallt SCM i en 60 mm skålen och överför skivade hippocampi från slicer använda ett annat klippt P1000 filter spets och kalla SCM. Undvik att göra bubblor.
- Med hjälp av en iris spatel och en rak spatel försiktigt separera skivor från varandra.
- Separata väl definierade och oskadade skivor från skadade skivor.
3. Hippocampus Slices Kultur
- Ta med sex-och plattor med SCM och cell infogar kultur från inkubatorn. Med hjälp av en annan klippt P1000 filter spets, överföra enskilda skivor på membranet. Placera 4-5 skivor per membran. Var noga med att inte placera skivor antingen nära skäret vägg eller nära varandra. Vid behov använder iris spatel till separata skivor. Ta bort överflödig medium. Tryck på skivor så lite som möjligt när de är på membranet.
- Flytta plattan tillbaka till inkubatorn och kultur vid 35 ° C och 5% CO 2.
- Ändra SCM var 48 timmar inne i TC huva som aspirerande SCM med en pasteurpipett. Tillsätt 750 mikroliter av färska förvärmda SCM per brunn. Se till att inga bubblor bildas under membranet.
4. Lösningar
- Låg Na + ACSF - Analysera lösning för slice kulturer
Att avjoniserat och sterila H 2 O lägga till:För 500 ml För 1000 ml Slutlig koncentration CaCl 2 (1 M) 0,5 ml 1 ml 1 mM D-Glukos 0,901 g 1,802 g 10 mM KCl 0,149 g 0,298 g 4 mm MgCl 2 (1 M) 2,5 mL 5 ml 5 mM NaHCO 3 1,092 g 2,184 g 26 mm Sackaros 40 g 80 g 234 mm Fenolröttlösning 0,5% i DPBS 0,5 ml 1 ml 0,1% v / v
Blanda ~ 30 min
Sterilize genom passage genom 0.22μm filter
Gör 50 ml-portioner och förvara vid 4 ° C längre än 2 månader. - Slice odlingssubstrat (SCM)
För 500 ml För 1000 ml Slutlig koncentration MEM Eagle medelstora 4,2 g 8,4 g 8,4 g / l Hästserum värmeinaktiverad 100 ml 200 ml 20% L-glutamin (200 mm) 2,5 mL 5 ml 1 mM CaCl 2 (1 M) 0,5 ml 1 ml 1 mM MgSO 4 (1 M) 1 ml 2 ml 2 mM Insulin (1 mg / ml), löst i HCl 0,01 N 0,5 ml 1 ml 1 mg / l Askorbinsyra, lösning (25% w / v) 0,024 mL 0,048 mL 0,00125% D-Glukos 1.16g 2.32g 13 mm NaHCO 3 0.22g 0.44g 5,2 mm Hepes 3.58g 7.16g 30 mM
Blanda tills noggrant upplöst och sätta till rumstemperatur.
Justera pH till 7,27 till 7,28 med 1 N NaOH
Mät osmolaritet. Justera till 320 mmol / kg med avjoniserat och steriliseras H 2 O. Räkna med att lägga ca 25-40 ml. Kontrollera osmolaritet igen.
*** PH kan ändras något vid justering osmolaritet, detta är ok, är det viktigare att osmolaritet är i rätt område (317-323).
Sterilisera genom passage genom 0,22 ìm filter.
Gör 20 ml och lagra upp till två tre veckor vid 4 ° C.
Gluatamine lager: Förbered vid en koncentration av 200 mm och förvara vid -20 ° C i portioner om 2,5 ml.
Askorbinsyra lager: Förbered vid en koncentration på 25% (w / v) och förvaras vid -20 ° C i portioner om 100 mikroliter.
5. Representativa resultat:
Skivor ska se ut vitt under en dissekera räckvidd utan svarta fläckar och väl definierade och oskadade CA1, CA3 och dentate regioner gyrus. Bakteriell kontaminering är lätt ses som rörliga svarta fläckar på medellång eller grumlighet av SCM. När den placeras under mikroskop, skall ytan för den del ser rent efter 4 dagar i kultur med tydliga och märkbart cell organ. Om inga klara cellen kroppar ses och mycket skräp täcker ytan efter 4 dagar, sedan är inte en frisk bit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod är baserad på den metod som först beskrevs av Stoppini et al. Och 11 erbjuder ett snabbt sätt till kultur hippocampus skivor. Den viktigaste aspekten av detta protokoll är att upprätthålla skivor steril, därför är det viktigt att använda lämpliga sterila tekniker och att korrekt desinficera och sterilisera allt material i kontakt med vävnad.
Olika serum källor kan påverka kvaliteten på skivorna. Vi rekommenderar att du provar flera partier först. Om förorening är ett återkommande problem, kontrollera inkubator-och vävnadsodling huva för möjliga smittkällor. Korrekt användning av sterila tekniker under hela förfarandet är viktigt.
Den totala tiden från halshuggning för att placera skivor på membranet och i kuvösen bör vara längre än 1,5 timmar. Om förfarandet tar för lång tid kommer det att äventyra hälsan för skivor.
Placera skivorna på en porös membran garantier ordentlig syresättning och nutrition via ett tunt lager av SCM som bildas av kapillärkraften. Denna metod kan anpassas till andra delar av hjärnan ger att densiteten av vävnaden gör rätt syresättning och näringsämnen penetration. Således begränsar vävnad täthet denna metod för att unga vävnad. För hippocampus, skivor 300-400 ìm tjocka från P6-P7 djur verkar ge bästa resultat. Denna typ av skivor kan snabbt uppnås med en vävnad slicer minskar den tid som vävnaden utsätts för luft.
Viktigt för dem som studerar synaptisk fysiologi, efter några dagar i kultur, har alla skräp från döda celler tagits bort och lämnar en ren yta mycket lämplig för elektrofysiologiska eller avbildning experiment. Dessutom fortsätter organotypic hippocampus skivor utveckla normal uppkoppling jämförbart med akut skivor 12. Men efter 2 veckor i kulturen här normala uppkoppling försvinner som nervceller börja bilda för många anslutningar som ökar synaptisk aktivitet i segmentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av NINDS - NIH R01NS060756
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture inserts | EMD Millipore | PICM03050 | |
| 6 well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue Slicer | Stoelting Co. | 51425/51415 | |
| Microscope | Olympus Corporation | SZX7-ILLD2-100 | |
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T. | 10099-15 | |
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T. | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | |
| Iris Spatula | F.S.T. | 10093-13 | |
| Straight spatula | F.S.T. | 10094-13 | |
| Rounded spoon micro spatula | VWR international | 57949-039 | |
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Sciences | 72946 | |
| Dissecting tweezers | Dumont | #2 | |
| Small dissecting scissors | F.S.T. | 14060-10 | |
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | |
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | |
| CaCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4 (1 M) | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | M9272 |
References
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. ntroduction Long-term potentiation and structure of the issue. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).
- Shepherd, G. M. The synaptic organization of the brain. , 5th edn, University Press. Oxford. (2004).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Malinow, R. Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105, 331-343 (2001).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Esteban, J. A. PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity. Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).
- Mainen, Z. F. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18, 231-239 (1999).
- Barria, A., Malinow, R. Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses. Neuron. 35, 345-353 (2002).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Simoni, A. D. e, Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
