Summary
Biz diğer beyin bölgelerine kolayca adapte edilebilir Organotipik hipokampal dilim hazırlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Beyin dilimlerini bir arayüz oluşturmak için izin gözenekli membranlar ve kültür ortamı üzerine koydu. Bu yöntem, kültür 2 hafta kadar hipokampus brüt mimarisi korur.
Abstract
Hipokampus, limbik sistemin bir bileşeni, uzun süreli hafıza ve mekansal navigasyon 1 önemli roller oynar. Hipokampal nöron bağlantıları güçlü aktivasyon kısa bir süre sonra gücünü değiştirebilirsiniz. Uzun vadeli potansiyasyonu (LTP) olarak bilinen bu fenomen, saatler veya günler sürebilir ve öğrenme ve hafıza 2 için en iyi aday mekanizması haline gelmiştir. Buna ek olarak, 3 hipokampus iyi tanımlanmış anatomi ve bağlantı sinaptik iletim ve sinaptik plastisite 4 çalışmada klasik bir model sistem yaptı.
Hipokampal sinaps fizyolojisi anlayışımız büyüdü ve moleküler oyuncular tespit oldu, sinaptik proteinlerin işlemek için zorunlu bir ihtiyaç haline geldi. Organotipik hipokampal kültürler kolay gen manipülasyon ve hassas farmakolojik müdahale imkanı sunan ancak sinaptik organizasyon korumak, rutin kültür ayrışmış nöronlar yöntemleri daha natüralist bağlamında sinaps fonksiyonu anlamak için kritik.
Burada diğer beyin bölgelerine kolayca adapte edilebilir hipokampal dilim hazırlamak ve kültür bir yöntem mevcut. Bu yöntem viral enfeksiyon 5,6 veya biolistics 7 gibi farklı yaklaşımlar kullanarak genetik manipülasyon dilimleri için kolay erişim sağlar. Buna ek olarak, dilim kolayca biyokimyasal testleri 8 için geri olabilir, ya da görüntüleme 9 veya elektrofizyolojik deneylerde 10 mikroskoplar aktarılır.
Protocol
1. Hipokampal Dilimleri Hazırlama Başlamadan Önce.
- Teflon levha bir parça yerleştirerek yeni bir bıçak montaj doku dilimleme makinesi hazırlayın.
- % 70 etanol ile silin ve doku kültürü (TC) kaput diseksiyon mikroskobu içine yerleştirilmiş. Davlumbaz, mikroskop, doku dilimleme makinesi ve UV ışığı ile 15 dakika boyunca tüm diseksiyon aletleri sterilize edin.
- Altı iyi TC tabak hazırlayın. Her bir kuyunun 750 mcL dilim kültür ortamı (SCM), başına iyi yer ve hücre kültürü ekler ekleyin. Membranlar altında kabarcıklar ile iyice ıslak emin olun. 35 kuvöz tabak yerleştirin ° C kadar gerekli% 5 CO 2 ile gaz verilerek.
- 100 ml beher içine 50 ml düşük Na + ACSF (çözüm diseksiyon) dökün ve buz-tuz karışımı yerleştirin. Kabarcık düşük Na + ACSF% 5 CO 2 /% 95 O 2 ile renk değişimleri ve ACSF, dondurulmuş ve sıvı solüsyonu (10-20 dakika) bir bulamaç karışımı oluşturana kadar .
- P5-P7 sıçan yavru alın. Kadar üç yavrular kullanılabilir.
2. Hipokampal Dilimleri hazırlanması.
- Hayvan başkanı, keskin bir yardımcı program makas ile kesin. Cildi kesin ve kafatası maruz. Sonra küçük makas ile sagital sütür boyunca interaural hat boyunca yan yana gelen kesme ve kafatası açın. Kemik ve beyin maruz kaldırarak kolaylaştırmak için ön yan yana isteğe bağlı kesim yapılabilir. Yuvarlak bir kaşık mikro spatula ile hızlı bir şekilde beyin kepçe ve yaklaşık 1 dakika süreyle soğuk çözüm diseksiyon bulamaç yerleştirin. 60 mm bir tabağa buz soğuk diseksiyon çözüm ~ 10 ml dökün ve beher çanak beyin transferi. Beyin çözüm diseksiyon ile kaplanmış olmalıdır.
- Altında mikroskop diseksiyon: Yer beyin ve 60 mm çanak alt basıldığında diseksiyon forseps ile orta hat tutun. Ortabeyin bırakarak hemisferlerin ayrı hipokampus kesme aleti kullanın. Hippocampi sonra her yarımkürede maruz kalmaktadır. Sonra yavaşça aracı diseksiyon hipokampus hipokampus kepçe. Hipokampus tamamen izole etmek ve mümkün olduğunca temiz diseksiyon iğnesi kullanın.
- Snipped P1000 filtre pipet ucu hafifçe hipokampus aspirat ve doku dilimleme makinesi teflon levha aktarmak. Konkav hipokampus yerleştirin.
- Koronal bölümleri almak ve aşırı sıvı drenaj hippocampi dik bıçak hizalayın.
- Hippocampi her 400 mikron dilimleyin.
- ~ 10 ml soğuk SCM, dilimleme makinesi, başka bir snipped P1000 filtre ucu ve soğuk SCM kullanarak hippocampi dilimlenmiş bir 60 mm bulaşık ve transfer içine dökün. Kabarcıklar yapmak kaçının.
- Iris spatula ve düz bir spatula yardımıyla hafifçe birbirinden dilim ayırın.
- Iyi tanımlanmış ve hasarsız hasarlı dilim dilim ayırın.
3. Hipokampal Dilimleri Kültür
- Inkübatör SCM ve hücre kültürü ekler ile altı kuyucuğu getirin. Başka bir snipped P1000 filtre ucu yardımı ile tek tek dilimler, membran üzerine aktarın. Membran başına 4-5 dilimleri yerleştirin. Dilimleri eklemek duvar ya yakın ya da birbirlerine yakın yerleştirmek için dikkatli olun. Gerektiğinde ayrı dilim iris spatula kullanın. Aşırı orta çıkarın. Membran bir dilim mümkün olduğunca az dokunun.
- Geri inkübatör plaka ve kültür 35 ° C ve% 5 CO 2 taşıyın.
- SCM Pasteur pipeti ile aspire TC kaput içinde SCM her 48 saat değiştirin. Taze önceden ısıtılmış SCM de ortalama 750 mcL ekleyin. Membranın altında kabarcıklar oluşur emin olun.
4. Çözümler
- Düşük Na + ACSF - dilim kültürlere Diseksiyon Çözüm
Deiyonize ve steril H 2 O eklemek için:500 ml için 1000 ml için Final Konsantrasyon CaCl 2 (1 M) 0,5 mL 1 ml 1 mM D-glikoz 0,901 g 1,802 g 10 mM KCl 0,149 g 0,298 g 4 mM MgCl 2 (1 M) 2.5 mL 5 ml 5 mM NaHCO 3 1.092 g 2.184 g 26 mm Sakaroz 40 g 80 g 234 mm DPBS Fenol Kırmızı Çözüm% 0.5 0,5 mL 1 ml % 0.1 v / v
Mix ~ 30 dk.
Steril0.22μm filtre geçişi tarafından ize
4 ° C artık 2 aydan az 50 ml alikotları ve mağaza olun. - Dilim Kültür Orta (SCM)
500 ml için 1000 ml için Final Konsantrasyon MEM Eagle orta 4.2 g 8.4 g 8.4 g / l At serum ısı inaktive 100 mL 200 mL % 20 L-Glutamin (200 mM) 2.5 mL 5 ml 1 mM CaCl 2 (1 M) 0,5 mL 1 ml 1 mM MgSO 4 (1 M) 1 ml 2 mL 2 mM İnsülin (1 mg / ml), 0.01 N HCl içinde çözünmüş 0,5 mL 1 ml 1 mg / l Askorbik Asit, çözüm (% 25 w / v) 0.024 ml 0.048 ml 0,00125% D-glikoz 1.16g 2.32g 13 mm NaHCO 3 0.22g 0.44g 5.2 mM HEPES 3.58g 7.16g 30 mm
Iyice eriyene kadar karıştırın ve oda sıcaklığına getirmek.
1 N NaOH ile pH 7,27-7,28 için ayarlayın.
Ölçü ozmolarite. Deiyonize ve sterilize H 2 O. ile 320 mmol / kg ayarlayın Yaklaşık 25-40 ml eklemek için bekliyoruz. Ozmolarite yeniden kontrol edin.
Ozmolarite ayarlayarak, *** pH biraz değişebilir, bu tamam, ozmolarite doğru aralığı (317-323) olduğunu daha önemlidir.
0.22 mikron filtre geçişi ile sterilize edin.
20 ml alikotları ve mağaza olun az iki-üç hafta kadar 4 ° C
Gluatamine stok: -20 ° C'de 2.5 mL hacimde 200 mM ve mağaza bir konsantrasyon hazırlamak.
Askorbik asit stoğu:% 25 (w / v) 'lik bir konsantrasyon hazırlamak ve 100 mcL hacimde -20 ° C'de saklanır.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Dilimler diseksiyon kapsamında beyaz, siyah noktalar olmadan bakmak ve iyi tanımlanmış ve hasarsız CA1, CA3 ve dentat girus bölgelerinin. Bakteriyel kontaminasyon kolayca SCM orta veya bulanıklık hareket eden siyah lekeler olarak görülür. Mikroskop altında konulduğunda, dilim yüzey açık ve ayırt edilir hücre organları ile 4 gün sonra kültür temiz görünmelidir. Net hücre gövdeleri görülür ve çok enkaz 4 gün sonra yüzeyini kaplayan, daha sonra sağlıklı bir dilim değildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem 11 ilk Stoppini ve ark tarafından tanımlanan yöntem ve kültür hipokampal dilimleri hızlı bir şekilde sunuyor. Bu protokolün en önemli yönü dilim steril korumak için, bu nedenle uygun steril teknikler kullanmak ve düzgün doku ile temas eden tüm malzeme dezenfekte ve sterilize etmek için kritik öneme sahiptir.
Farklı serumlar kaynakları dilimleri kalitesini etkileyebilir. Biz ilk birkaç toplu test tavsiye ederiz. Kontaminasyon tekrarlayan bir sorun ise, inkübatör ve muhtemel kirlilik kaynakları için doku kültürü kaputu kontrol edin. Tüm prosedürü sırasında steril tekniklerin uygun kullanımı esastır.
Dekapitasyon membran ve inkübatör dilimleri yerleştirerek için toplam süre 1.5 saatten daha uzun olmamalıdır. Prosedür çok uzun sürerse, dilim sağlığı tehlikeye sokacaktır.
SCM kapilarite tarafından oluşturulan ince bir tabaka ile gözenekli bir membran garantiler uygun oksijenasyon ve beslenme dilim yerleştirilmesi. Bu yöntem doku yoğunluğu, uygun oksijenasyon ve besin penetrasyon sağlar koşuluyla diğer beyin bölgelerine adapte edilebilir. Böylece, doku yoğunluğu genç doku için bu yöntemi sınırlar. Hipokampus, p6 p7 hayvanlar 300-400 mikron kalınlığında dilimler en iyi sonuçlar verecek gibi görünüyor. Dilim Bu tür hızla azalan doku havaya maruz kaldığı zaman bir doku dilimleme makinesi ile elde edilebilir.
Kültürün bir kaç gün sonra, sinaptik fizyolojisi eğitimi önemlisi, ölü hücreleri tüm enkaz elektrofizyolojik veya görüntüleme deneyleri için temiz bir yüzey son derece uygundur bırakarak kaldırılır olmuştur. Buna ek olarak, Organotipik hipokampal dilim akut dilim 12 karşılaştırılabilir normal bağlantı geliştirmeye devam. Ancak nöronlar dilim sinaptik aktiviteyi artırır çok sayıda bağlantı oluşturan başlangıç olarak 2 hafta sonra bu normal bir kültür bağlantısı kaybolur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NINDS tarafından finanse edildi - NIH R01NS060756
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture inserts | EMD Millipore | PICM03050 | |
| 6 well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue Slicer | Stoelting Co. | 51425/51415 | |
| Microscope | Olympus Corporation | SZX7-ILLD2-100 | |
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T. | 10099-15 | |
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T. | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | |
| Iris Spatula | F.S.T. | 10093-13 | |
| Straight spatula | F.S.T. | 10094-13 | |
| Rounded spoon micro spatula | VWR international | 57949-039 | |
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Sciences | 72946 | |
| Dissecting tweezers | Dumont | #2 | |
| Small dissecting scissors | F.S.T. | 14060-10 | |
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | |
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | |
| CaCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4 (1 M) | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | M9272 |
References
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. ntroduction Long-term potentiation and structure of the issue. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).
- Shepherd, G. M. The synaptic organization of the brain. , 5th edn, University Press. Oxford. (2004).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Malinow, R. Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105, 331-343 (2001).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Esteban, J. A. PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity. Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).
- Mainen, Z. F. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18, 231-239 (1999).
- Barria, A., Malinow, R. Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses. Neuron. 35, 345-353 (2002).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Simoni, A. D. e, Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
