Mess-und Circadian Akute Licht Responses in Mäuse mit Rad Laufen Activity

Abstract

Zirkadianen Rhythmen sind die physiologischen Funktionen dieses Zyklus über einen Zeitraum von ca. 24 Stunden (zirkadianen-circa: ungefähr und diem: Tag) ^{1, 2.} Sie sind verantwortlich für Timing unseren Schlaf / Wach-Zyklen und Hormonausschüttung. Seit diesem Zeitpunkt ist nicht genau 24-Stunden, ist es der Sonnentag durch Licht-Eingang synchronisiert. Dies geschieht über photic Eingangssignale aus der Retina, die suprachiasmatischen Nukleus (SCN), die als Master-Schrittmacher synchronisiert periphere Uhren in anderen Regionen des Gehirns und des peripheren Gewebe auf die Umwelt Hell-Dunkel-Zyklus ^3-7 dient erreicht. Die Ausrichtung der Rhythmen dieser Umgebungslicht Dunkel-Zyklus organisiert besondere physiologische Ereignisse um die korrekte zeitliche Nische, die entscheidend für das Überleben ⁸ ist. Zum Beispiel, Schlaf-Mäuse im Laufe des Tages und der Nacht aktiv. Diese Fähigkeit, die Aktivität zu konsolidieren, um die hellen oder dunklen Teil des Tages entweder als zirkadiane photoentrainment bezeichnet und erfordert Lichtsignale an die circadiane Uhr ^9. Die Aktivität der Mäuse in der Nacht ist besonders in Gegenwart eines Laufrades robust. Messen dieses Verhalten ist eine minimal-invasive Methode, die verwendet werden, um die Funktionalität des circadianen Systems sowie Licht-Eingang zu diesem System bewertet werden können. Methoden, die hier abgedeckt werden verwendet, um die innere Uhr, Licht-Eingang zu diesem System, sowie der direkte Einfluss von Licht auf Rad Laufverhalten zu untersuchen.

Protocol

1. Aufstellbedingungen

1. Vorbereitung von Tiergruppen ist sehr wichtig, beim Einrichten einer Verhaltenstherapie zu experimentieren. Für Rad läuft Aktivität, alle Mäuse männlich sein müssen, abgestimmt Alter, und wenn möglich von Geschwister Paarungen. Idealerweise jüngeren Mäusen, ca. 3 Monate alt, sind für Rad-Laufen-Aktivität verwendet.
2. Vor Inbetriebnahme alle Tiere auf Rädern, muss der Raum komplett eingerichtet werden. Dies umfasst die Vorbereitung jeder Käfig mit 1 Rad, 1 Radumdrehung Sonde, eine kleine Menge von Maus Betten in den Boden jedes Käfigs und ausreichend Nahrung und Wasser für 2 Wochen.
3. Raumbeleuchtung ist sehr wichtig, beim Einrichten Rad läuft Käfigen ist es wichtig, die Lichtintensität an jedem Käfig zu messen, um sicherzustellen, dass Sie auch eine gleichmäßige Ausleuchtung in jeden Käfig. Darüber hinaus bei der Auswahl einer Lichtquelle, einer mit einem breiten Spektrum abdecken 450nm-650nm zu suchen. Viele Firmen bieten "Tageslicht" oder "full spectrum" Leuchtstoffröhren, die dieses Kriterium erfüllen. (Siehe Abbildung 1)

2. Versuchsaufbau

1. Bei der Einführung von Mäusen, das Rad läuft Käfig, tun dies in einem Licht-Zyklus, die genau dem Licht / Dunkel-Zyklus sie zuvor unter untergebracht waren.
2. Versuchen Sie gleichmäßig zu verteilen Mäusen besser zu gewährleisten ähnlichen Umgebungen für alle Gruppen. Zum Beispiel von Clustering alle von einer Gruppe von Mäusen in einem bestimmten Bereich wie einem Regal zu unterlassen. Dies könnte versehentlich Einführung eine zusätzliche Variable.
3. Bevor Sie Lichtzyklus Störungen oder Messung der Aktivität, sollten Sie geben Mäusen etwa eine Woche auf den neuen Käfig gewöhnen, und das Rad. Alle Mäuse, die nicht ausgeführt werden, auf die Räder nach einer Woche sollte aus dem Käfig entfernt und ersetzt werden mit einer anderen Maus.
4. Sobald Sie eine Gruppe von Tieren stabil auf Rädern haben, können Sie die Einrichtung Licht / Dunkel-Zyklen zu verschiedenen Hypothesen zu testen. Die verschiedenen Licht-Zyklen sind im Detail in Teil 3 behandelt.

3. Versuchsansätzen

1. Um Assay photoentrainment, durch das Gehäuse Mäusen starten in einem 12 h Licht: 12 h Dunkel-Zyklus. Ein Beispiel hierfür wäre Lichter werden auf von 7:00 Uhr-7: 00pm, während die Lichter ausgeschaltet bleiben von 7.00 Uhr bis 07.00 Uhr. Darüber hinaus wird Absenkung der Lichtintensität für die 12 h Licht des Zyklus aussetzen Unterschiede in Lichtempfindlichkeit für photoentrainment. Mäuse sollte eine Frist von zwei Wochen bis photoentrain und vor dem Wechsel Lichtintensitäten. (Abbildung 2)
2. Ein weiterer Aspekt der photoentrainment ist die Fähigkeit, neu zu justieren oder wieder mitnehmen zirkadianen Rhythmen zu einem neuen Licht / Dunkel-Zyklus. Dies kann durch Vorschieben des Hell / Dunkel-Zyklus, dass Mäuse, so dass die Lichter ein-und ausschalten früher untergebracht sind untersucht werden. Häufig, Licht-Zyklen von 6 Stunden sind fortschrittliche, z. B. statt einer Licht-Zyklus von 07.00 Uhr-7: 00pm, wäre es 01.00 Uhr-1: 00pm. Dies kann auch durch eine Verzögerung des Licht-Zyklus untersucht werden. Mäuse sind in der Regel in der Lage, wieder mitzureißen in 5-7 Tagen. (Abbildung 3)
3. Diese Paradigmen jedoch nicht, eine umfassende Beurteilung der Funktionalität der endogenen circadianen Uhr. Housing Mäuse in konstanter Dunkelheit lassen sich die endogenen circadianen Periode auch als freie Laufzeit bekannt zu messen. In nachtaktive Tiere wie Wildtyp-Mäusen ist die endogene Zeitraum von weniger als 24 Stunden bedeutet, dass sie beginnen, auf dem Rad läuft etwas früher jeden Tag. (Abbildung 2) Der genaue Zeitpunkt dieser Zeit variiert leicht zwischen den verschiedenen Mausstämmen. Zum Beispiel ist die kostenlose Laufzeit von C57 Mäusen etwa 23,3 Stunden, während in BALB / cJ Mäusen 22,5 Stunden beträgt ^10.
4. Nach der Bestimmung des frei laufenden Periode in konstanten Dunkelheit Licht an die circadiane System kann durch Phasenverschiebung untersucht werden. Phasenverschiebung ist die Fähigkeit einer akuten Lichtpuls auf die circadiane Uhr zu verschieben. Während der aktiven Phase der Mäuse in konstanter Dunkelheit gehalten und die Messung der Beginn der Tätigkeit auf den Tagen nach dieser Lichtpuls; Phasenverschiebung kann durch die Verabreichung eines kurzen Lichtimpuls (1000lux 15 Minuten) erreicht werden. (Abbildung 4) Frühere Studien haben Wirkungs-Kurven (sog. Phase-Wirkungs-Kurven), dass der Betrag und Richtung der Verschiebung auf das, was Zeit ist das Licht ^{11, 12} hervorrufen beschreiben produziert. Zum Beispiel kann ein 15 Minuten, 1000 lux Lichtpuls 4 Stunden nach Beginn der Tätigkeit (CT16) gegeben wird, um eine 2-stündige Verspätung in Aktivität führen, während die gleiche Lichtpuls 8 Stunden nach Beginn der Tätigkeit (CT20) gegeben führen zu einem 2 Stunden voraus. (Abbildung 4)
5. Um zu testen, die direkte Wirkung von Licht auf Rad läuft Aktivität kann ein Lichtimpuls auf Mäuse während der dunklen / aktive Phase verabreicht werden. Die Anwesenheit von Licht in dieser Zeit hemmt Rad-Laufen Aktivität. Während die Länge dieser Lichtpuls kann variieren, haben wir festgestellt, dass ein 3-Stunden-Impuls beginnend 2 Stunden nach dem Beginn der dunklen Phase sehr informativ ist. (Abbildung 5) In einigen Fällen kann es sinnvoll sein, um die Aktivität vor der Prüfung zu konsolidieren, können Sie dies ganz einfach, indem Sie diese Licht-Zyklus zu einem 16 h Licht: 8 h Dunkel-Zyklus 1 Woche vor der Verabreichung des Lichtpulses.
6. Diese Hemmung der Rad läuft Aktivität direkt durch Licht kann in allen Phasen des circadianen Zyklus mit Hilfe eines ultradiane (T7) Licht-Zyklus ¹³ untersucht werden. Dieser Zyklus besteht aus 3.5h Licht: 3,5 h dunkel für die Dauer von 1 Woche ^13. Mäuse sind nicht in der Lage photoentrain ermöglicht Lichtpulse an allen Punkten in der circadianen Zyklus fallen im Laufe dieser 1-wöchigen Behandlung. (Abbildung 6)
7. Ähnlich wie bei konstanter Dunkelheit wird der Wohnungsbau-Mäuse in konstantes Licht zeigen eine charakteristische, frei laufende Periode. Allerdings wird diese Frist länger sein als der Zeitraum, in konstanter Dunkelheit gefunden. Die Länge der freien Laufzeit in konstantes Licht ist positiv mit der Lichtintensität ¹⁴ korreliert, als die Menge an Licht, nimmt auch die frei herumlaufenden Periodenlänge. (Abbildung 7) jedoch nur selten Mäusen zeigen Perioden von mehr als 26 Stunden. Stattdessen unter hellem Licht, wird ihre Tätigkeit zu Rhythmusstörungen. Aus diesem Grund ist es Lichtintensität ist eine wichtige Überlegung, wenn Sie Periodenlänge in konstantes Licht vergleichen wollen.
8. Bei der Entscheidung, welche um diese leichten Störungen führen, denken Sie daran, dass vor Licht Zyklen können zirkadianen Rhythmen beeinflussen. Aus diesem Grund ist es am besten mit dem mildesten Behandlungen zum ersten Mal starten und schrittweise zu schwereren Licht Behandlungen zu bewegen. Zum Beispiel sind photoentrainment Assays konstant dunkel, und Phasenverschiebungen alle sehr mild und scheinen nicht zu langfristigen Effekten führen. Auf der anderen Seite sind die T7-Zyklus und konstantes Licht sehr grelles Licht Behandlungen und kann zu Herzrhythmusstörungen führen und sollte für das Ende des Experiments reserviert werden.

4. Analyse der Daten

1. Rad-Laufen Tätigkeit gesammelt und die Anzahl der Radumdrehungen, die innerhalb eines bestimmten Zeitraums binned. Das bin oder Abtastintervall wird üblicherweise 10-Minuten. Die Daten können in eine Excel-Tabelle zeigt die Anzahl der Radumdrehungen innerhalb jedes Fach angezeigt werden. Dies kann nützlich sein für die Quantifizierung und Vergleich Radumdrehungen. Die Daten können auch als Aktogramm wodurch die Menge der Aktivität in jedem Fach in der Höhe von einem schwarzen Balken wie ein Histogramm angezeigt werden. (Abbildung 2)
2. Activity Beginn wird als Beginn der Tätigkeit überwiegen Kampf definiert. Die genauen Parameter können zwischen den einzelnen variieren, aber im Allgemeinen, suchen wir nach dem ersten Anfall von Aktivität, die länger als 30 Minuten dauert.
3. Zur Analyse der Fähigkeit der Mäuse zu photoentrain, gibt es mehrere Maßnahmen, die betrachtet werden können. Eine gängige Methode verwendet, um eine Maus zu photoentrained werden prüfen, ist die Beobachtung eines stabilen Beziehung zwischen dem Einsetzen der Maus die Tätigkeit und die von Licht sowie ein großer Prozentsatz der Maus Tätigkeit wird auf die dunkle Phase beschränkt kompensiert.
4. Der Wirkungseintritt bietet die meisten Informationen, wenn man sich re-Entrainment, eine Vorauszahlung der Licht / Dunkel-Zyklus, während die Aktivitäten ausgeglichen ist sehr informativ bei der Prüfung re-Entrainment zu Verzögerungen bei der Hell / Dunkel-Zyklus. Mäuse in der Regel dauern 5-7 Tage komplett neu zu reißen ihre Rad läuft Aktivität zu einem 6-Stunden im Voraus oder Verzögerung der Hell / Dunkel-Zyklus. Zu beachten Maus wieder mitgerissen, vor allem in Reaktion auf einen Vorschuss, sollten Sie beobachten, eine stabile Beziehung zwischen dem Beginn der Tätigkeit und der Offset des Lichts. Dieses Verhältnis sollte ähnlich zu dem, was vor dem Licht-Zyklus voraus beobachtet und sollte mindestens drei Tage andauern. (Abbildung 3)
5. Zur Berechnung der Frist in beide konstant dunkel und konstantes Licht, müssen die Anläufe der Tätigkeit für 2 Wochen bestimmt werden und mit einer Regressionsgeraden. Wie bereits erwähnt, in Wildtyp-Mäusen, wird der Zeitraum in konstanter Dunkelheit weniger als 24 Stunden während der Periode, in konstantes Licht wird größer sein als 24 Stunden. (Abbildungen 2 und 7)
6. Bei der Berechnung der Verschiebung nach einem Lichtpuls, durch den Einbau Regressionsgeraden, um die Aktivität Onsets beginnen für mindestens 5 Tage vor und 5 Tage nach dem Lichtpuls. Berechnen Sie die Differenz zwischen diesen beiden Regressionsgeraden, um die Größe der Phasenverschiebung zu bestimmen. (Abbildung 4)

5. Repräsentative Ergebnisse

Bei der Betrachtung Rad läuft Aufzeichnungen, sollten Sie erwarten, mehrere Stunden im Dauerbetrieb läuft in jeder Maus zu sehen. Da Mäuse nachtaktiv sind, wird diese ausgeführt werden, oder aktive Phase, mit der dunklen Periode in der Gegenwart eines Hell / Dunkel-Zyklus zu korrelieren. Mäuse freilaufend in konstanten Bedingungen wird auch diese beschränkt Periode anhaltender Aktivität, die die aktive Phase der freilaufenden Rhythmus. In konstanter Dunkelheit, wird diese kürzer als 24 Stunden und in konstantes Licht,mehr als 24 Stunden. Die Verabreichung einer 15-minütigen 1000lux Lichtpuls 4 Stunden nach Beginn der Tätigkeit (CT16) wird in verzögerte Aktivität Beginn an den Tagen nach dieser Lichtpuls führen.

Abbildung 1: Repräsentative Lichtspektren A.. Das Lichtspektrum der Sonne erzeugt wird, breiten und relativ unvoreingenommene zwischen 400nm und 700nm, die den visuellen Teil des Lichtspektrums ist. B. Das Spektrum der eine Glühlampe Gipfel im Infrarot-Bereich, die ihre roten Bias führt, mit niedriger Intensität im blauen Bereich. C. Die typische Leuchtstofflampe besteht aus diskreten Gipfel des Lichts, das erscheint "weiß", um das Auge. D. Allerdings haben Tageslicht Leuchtstoffröhren eine höhere breites Spektrum und diskrete Frequenz Gipfel. Das Ergebnis ist eine Lichtquelle, die nicht so heiß wie eine Glühbirne, hat aber ein breiteres Spektrum als eine durchschnittliche Leuchtstofflampe.

Abbildung 2: Circadian photoentrainment. Die Aktogramm ist eine graphische Darstellung der Aktivität von einem einzigen Mausklick in denen aufeinander folgenden Tagen auf der y-Achse aufgetragen sind, und Zeit ist auf der x-Achse aufgetragen. Die schwarzen Balken repräsentieren die Anzahl der Radumdrehungen, und der Hintergrund schattiert, um einen Hinweis auf die Hell / Dunkel-Zyklus geben. Dunkel-Zyklus: An den Tagen 1-8, ist die Maus in einem 12:12 Licht untergebracht. Während dieser Zeit beginnt die Maus läuft an der Ampel Offset-und festigt seine Tätigkeit auf die dunkle Phase. Während die leichte Phase wird die Aktivität minimal. Am Tag 9, sind die Lichter ausgeschaltet, lassen Sie die Maustaste in ständiger Dunkelheit. Ohne Licht-Zyklus, es gibt keinen Eingang auf die circadiane Uhr, die in der Uhr, die auf ihre endogenen Zeit Ergebnisse. Wie Sie sehen können, beginnt Aktivität früher jeden Tag ein Hinweis, dass die endogene Uhr des Tieres weniger als 24 Stunden ist.

Abbildung 3: Re-Entrainment. Re-Entrainment Paradigmen gehört die Verlagerung von der Licht-Zyklus entweder nach vorne oder hinten zwingt die circadiane Uhr auf die neue Licht-Zyklus einstellen. In diesem Beispiel ist der Zyklus 6 Stunden am Tag 9 fortgeschritten und dann verzögert 6 Stunden am Tag 20. In beiden Fällen sind mehrere Tage für die vollständige Re-Entrainment erforderlich, jedoch abhängig von der Richtung der Bewegung ist der Effekt stärker ausgeprägt entweder den Beginn oder Offset-Zeit.

Abbildung 4: Tagesrhythmen Verschiebung in Reaktion auf kurze Lichtimpulse. A. Tiere in konstanter Dunkelheit untergebracht mit einer Zeitspanne von weniger als 24 Stunden frei laufen. Am Tag 8, ist eine 15-minütige 1000-lux Lichtpuls 4 Stunden nach Beginn der Tätigkeit (CT16) gegeben. An den folgenden Tagen, ist eine Verschiebung der Aktivität Beginn Zeit beobachtet. Die Phasenverschiebung ist der Unterschied in der Tiere vorhergesagt onset time (ermittelt aus ihrer Tätigkeit vor dem Lichtpuls) und der Zeit, dass sie tatsächlich beginnen, die auf den Tagen nach dem Lichtpuls.
B. Die Phase Wirkungs-Kurve für Mäuse zeigt den Betrag und Richtung der Verschiebung, die in Reaktion auf einen kurzen Lichtpuls an bestimmten circadianen Zeitpunkten auftreten wird. Ein Lichtpuls während der subjektive Tag (CT0-12) kann nicht induzieren eine signifikante Verschiebung, bezogen auf die tote Zone. Von CT12-19 kann eine Phasenverschiebung mit dem Höhepunkt auftretende Verzögerung in Reaktion auf einen Lichtimpuls bei CT16 induziert werden. Zwischen CT 19 und 24, wird die Aktivität Rhythmus in Reaktion auf einen Lichtimpuls mit der Spitze voraus auftretende Reaktion auf einen Lichtimpuls bei CT20 Voraus.

Abbildung 5: Rad-Laufen Aktivität gehemmt oder maskiert in Reaktion auf einen Lichtimpuls in der Nacht. In diesem Beispiel ist das Licht-Zyklus 16h Licht: 8h dunkel und konsolidiert Aktivität. Eine 3-stündige Lichtpuls beginnt 2 Stunden, nachdem die Lichter erlöschen am Tag 4. Während dieser Zeit gibt es wenig bis gar keine Rad-Laufen Aktivität, welche die Fähigkeit des Lichtes direkt zu hemmen Aktivität. Aktivität nimmt nach dem Lichtpuls.

Abbildung 6: T7 Lichtzyklus wird verwendet, um Mäuse zu Lichtpulse in die circadiane Zyklus aussetzen. Die T7-Zyklus besteht aus 3,5 Stunden von Licht um 3,5 Stunden Dunkelheit folgte. In diesem Zyklus werden die Mäuse halten einen circadianen Rhythmus, aber sie wird auch angezeigt, Maskierung von Rad läuft Aktivität während der Lichtpulse. Die Höhe der Aktivität während das Licht, kann die Höhe der Aktivität während der Dunkelheit für eine Maßnahme der Maskierung, die nicht von der circadianen Zeit vorgespannt ist, verglichen werden.

Abbildung 7: Zeitraum Verlängerung in konstantes Licht

Discussion

Zirkadianen Rhythmen wurden gemessen und aufgezeichnet in verschiedenen Organismen im Laufe der Geschichte. Während wir speziell die Verfahren zur Aufnahme von Aktivität Rhythmen bei Mäusen beschrieben haben, kann diese Technik leicht modifiziert werden, um Rhythmen in andere Nagetiere wie Hamster und Ratten, die oft in zirkadianen Studien eingesetzt zu messen. Allerdings wird die freerunning Zeit und Zeit wieder mitnehmen in andere Organismen variieren. Zum Beispiel ist die freerunning Zeitraum von einem Hamster in konstanter Dunkelheit 24,0 Stunden, während bei Mäusen es weniger als 24 Stunden ist. In der Umstand, dass Sie in einem Organismus, der nicht geeignet ist für Rad-Laufen Tätigkeit arbeiten, können viele der gleichen Licht Paradigmen verwendet werden, jedoch eine unterschiedliche physiologische Rhythmus betrachtet werden sollten. Die entsprechende Maßnahme allgemeine Aktivität. Bei Menschen, Affen und Hunde, Forscher verwenden häufig Aktigraphie, die den Betrag der Bewegung der einzelnen Maßnahmen. Beim Menschen sind die Körpertemperatur und Melatonin-Sekretion auch häufig gemessen und haben beide gezeigt, dass einem zirkadianen Rhythmus, die in der Lage Phasenverschiebung und in der Lage ist, zu re-mitzureißen ^{15, 16.}

Während wir diese physiologischen Rhythmen als diskrete Ereignisse denken, sind sie sehr miteinander verbunden. Die Aktivität Rhythmus eines Tieres kann eng mit dem Körpertemperaturrhythmus überlagert werden und ist der Kehrwert des Schlafrhythmus. Darüber hinaus die Melatonin-Sekretion, die oft als Marker der circadianen Phase verwendet wird, ähnelt dem normalen Schlafrhythmus des Menschen. Da diese Zyklen so miteinander verwoben sind, kann die Studie von einem zu informieren und vorherzusagen Ergebnisse der anderen. Zum Beispiel wurden NPAS2 mutierten Mäusen, die eine kontinuierliche Rad läuft Aktivität obwohl die dunklen Teil eines Licht-Dunkel-Zyklus ergab, später für den Schlaf Mängel ¹⁷ geprüft. Diese Mäuse wurden gefunden zu schlafen insgesamt weniger, mit der Abnahme, die während der dunklen Phase, die normal "nap time".

Rad-Laufen Aktivität bietet eine relativ nicht-invasive Methode zur zirkadianen Rhythmen zu untersuchen. Die Paradigmen oben beschrieben kann eine detaillierte Analyse der zirkadianen Verhalten zu vervollständigen. Darüber hinaus können Paradigmen wie photoentrainment und Wohnen in konstanter Dunkelheit verwendet werden, um als eine erste Bestandsaufnahme der zirkadianen Phänotypen vor konzentrierter Forschung wie Schlaf-Analyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
11.5 cm running wheels	Mini Mitter
Vital View Software for Data Acquisition	Mini Mitter
Clock lab for data analysis	Actimetrics