ホイール実行中のアクティビティを使用して、マウスの概日リズムと急性ライト応答を測定する

Abstract

^1、2概日リズムは約24時間の期間（：：近似および日当日概-年頃）を介して生理機能、そのサイクルです。彼らは私たちの睡眠/覚醒サイクルとホルモンの分泌のタイミングを取る責任があります。このタイミングは正確に24時間ではないので、それは光入力で太陽の日に同期されます。これは、網膜からの環境光の明暗周期^3-7の脳や末梢組織の他の地域で、周辺クロックを同期させるマスターのペースメーカーとして機能する視交叉上核（SCN）への光の入力によって行われます。この環境光暗サイクルのリズムのアラインメントは、生存⁸の不可欠な正しい時間的ニッチ、に特定の生理学的イベントを開催。例えば、マウスは、日中寝ると夜にアクティブになります。日の光や暗い部分のいずれかに活動を統合するこの機能は、概日photoentrainmentと呼ばれ、概日時計⁹に光入力が必要です。夜にマウスの活動は、特にホイールの回転の存在下で堅牢です。この動作を測定することは、概日システムの機能性だけでなく、このシステムへの光入力を評価するために使用できる低侵襲な方法です。ここにカバーされるメソッドは、概日時計、このシステムに入力される光だけでなく、車輪実行動作上の光の直接の影響を調べるために使用されます。

Protocol

1。機器のセットアップ

1. どんな行動実験をセットアップするときに動物のグループの準備は非常に重要です。ホイール実行中のアクティビティのために、すべてのマウスが一致した男性、年齢にする必要があります、と兄妹交配から、可能であれば。約3ヶ月理想的には若いマウスは、ホイール実行中のアクティビティに使用されます。
2. 車輪の上の任意の動物を配置する前に、部屋は完全にセットアップする必要があります。これは、1輪1輪回転プローブ、各ケージの底でマウスの寝具の少量と2週間のための十分な食料と水を各ケージの準備が含まれています。
3. ホイール動作してケージをセットアップするときに部屋の照明は、それはあなたがそれぞれのケージに均一な照明を取得していることを確認するために各ケ​​ージで光強度を測定することが重要である、非常に重要である。さらに、光源を選択する際に、測定波長：450nm - 650nmのカバーする広いスペクトルを持ついずれかに見える。多くの企業がこの基準を満たしている"日の光"または"フルスペクトル"蛍光灯を、提供しています。 （図1参照）

2。実験のセットアップ

1. ホイール動作してケージにマウスを導入する際に、密接にそれらは以前の下に収容された明/暗サイクルに一致する光周期で行ってください。
2. 均等に良いすべてのグループに対して同じような環境を確保するためにマウスを配布してみてください。例えば、このような単一の棚のような特定の領域でマウスの1つのグループのすべてをクラスタ化することを控える。これは誤って追加の変数を導入することもできます。
3. どんな光のサイクルの乱れを作ったり、活性を測定する前に、新しいケージ、そしてホイールに順応するのに約一週間のマウスを与える必要があります。一週間後にホイール上で実行されていない任意のマウスは、ケージから削除し、別のマウスに置き換える必要があります。
4. 一度安定してホイール上で実行されている動物のコホートを持って、あなたは別の仮説をテストするための明/暗サイクルのセットアップを開始することができます。様々な光のサイクルはパート3で詳しく説明されています。

3。実験的なアッセイ

1. アッセイphotoentrainmentに、12時間の光の中で住宅のマウスから始めます：12時間暗のサイクルを。ライトは午前7:00 - 午後7:00〜オフまま午後：これの例は7:00 AM - 7からの点灯となります。さらに、周期の12時間の光の部分の光強度を下げると、photoentrainmentための光感度の違いを公開します。マウスは、光強度を変更する前にphotoentrainとする二週間与えられるべきである。 （図2）
2. photoentrainmentのさらなる態様は、新しい光/暗サイクルに再調整または再同調概日リズムにできることです。これは、マウスが点灯し、前に、オンまたはオフにするようなに収容されていることを明/暗サイクルを進めることによって調べることができます。一般的に、ライトサイクルは6時間で進んでいる、例えば、代わりに午前7時 - 7のライトサイクルの：00、それは1:00 - 1になります：00。これはまた、光周期を遅らせることで調べることができます。マウスは5〜7日で、通常、再同調することができます。 （図3）
3. これらのパラダイムは、しかし、完全に内因性の概日時計の機能を評価しないでください。恒暗条件での住宅のマウスもフリーランニング期間として知られている内因性の概日周期を測定するために使用することができます。このような野生型のマウスなどの夜行性の動物では、内因性の期間は、彼らが毎日少し前のホイール上で実行し始めることを意味する24時間未満です。 （図2）この期間の正確な時間は異なるマウス系統間で若干異なります。 BALB / CJマウスでは¹⁰ 22.5時間のときに例えば、C57マウスのフリーランニング期間は約23.3時間です。
4. 恒暗条件でフリーランニング期間を判断した後、概日システムに入力される光は、位相シフトを使って調べることができます。位相シフトは、概日時計をシフトする急性光パルスの能力です。一定の暗さに収容したマウスの活動期の間に、この光パルスは、次の日には活性の発現を測定し、位相シフトは（1000lux 15分）短光パルスを投与することによって達成することができます。 （図4）これまでの研究では、光は^11を与えている何時間に基づいてシフト量と方向を表す応答曲線（と呼ばれる位相応答曲線^）、12を生産している。 8時間活動の開始（CT20）の後に与えられた同じ光のパルスがつながる間、例えば、4時間の活動の開始（CT16）の後に与えられた15分間、1000ルクスの光パルスは、活動の2時間の遅延につながる2時間前まで。 （図4）
5. ホイール実行中のアクティビティへの光の直接影​​響をテストするには、光パルスはアクティブ/暗期中にマウスに投与することができます。この時の光の存在は、ホイールランニングの活性を阻害することになります。この光パルスの長さが変化することができますが、我々は、暗期の開始後2時間から3時間のパルスが最も有益であることを見出した。 （図5）いくつかのケースでは、それは前にこのテストの活動を統合するために役立つことが、あなたが簡単に16時間の光にこの光周期を変更することでこれを行うことができます：光パルスの投与前8時間暗のサイクル一週間。
6. 光が直接活動を実行している車輪のこの阻害は、ウルトラディアン（T7）光サイクル^13を使用することで概日サイクルのあらゆる段階で調べることができます。このサイクルは3.5H光で構成されています：1第¹³週の間、3.5時間は暗い。マウスは、光パルスは、この1週間の治療の過程で概日周期のすべてのポイントで落下することができますphotoentrainすることはできません。 （図6）
7. 恒暗条件と同様に、一定の光の中で住宅のマウスは、特徴的なフリーランニング期間を明らかにする。しかし、この期間は、一定の暗さに見られる期間よりも長くなります。一定の光の中で自走期間の長さは、積極的に光強度¹⁴と相関している、光の量が増加するので、フリーランニング期間の長さをくれるので。 （図7）しかし、マウスは26時間を超えて期間を示すことはめったにありません。代わりに、明るい光のもとで、彼らの活動は、不整脈になります。このような理由から、それはあなたが一定の光の中で期間の長さを比較する場合、光強度が重要な考慮事項です。
8. これらの光摂動を実行するために決定するときは、前のライトサイクルは概日リズムに影響を与えることができることを覚えておいてください。このような理由から、それは最初の最も穏やかな治療から始めて、徐々に厳しい光の治療に移行するのが最善です。例えば、photoentrainmentアッセイ、恒暗、および位相シフトは、すべて非常にマイルドであり、長期的影響につながるしていないようだ。一方、T7のサイクルと一定の光は非常に強烈な光のトリートメントで、不整脈につながることができますし、実験の終わりのために予約してください。

4。データの分析

1. ホイールランニングの活動が収集され、車輪の回転数は、ビン、一定期間内に発生している。このビンやサンプリング間隔は、一般的に10分です。データは、各ビン内で車輪の回転数を示すExcelスプレッドシートに表示することができます。これは、車輪の回転数を定量し、比較するのに役立ちます。データは、各ビンの活動の量をヒストグラムのような黒いバーの高さで表されることによりactogramとして表示することができます。 （図2）
2. 活動の開始は、支配的な活動の試合の開始として定義されています。正確なパラメータは、個々の間で異なる可能性がありますが、一般的に、我々は30分以上続く活動の最初の試合を探します。
3. photoentrainにマウスの能​​力を分析するために、見することができるいくつかの対策があります。 photoentrainedするマウスを検討するために使用される一般的な方法は、マウスの活性の発現と光だけでなく、暗期に限定されているマウスの活動の大きな割合のオフセットの間に安定した関係の観察である。
4. 明/暗サイクルの事前に再飛散を見たときの明/暗サイクルの遅れに再飛散を調べるときに、オフセット活動が最も有益である一方活性の発現は、ほとんどの情報を提供します。マウスは、通常、車輪の実行中のアクティビティでは、明/暗サイクルの6時間前または遅延するために完全に再同調するために5〜7日かかります。特に事前に対応して、マウスの再混入を考慮するには、活性の発現とオフセット光との間の安定した関係を観察する必要があります。この関係は、光周期の前進の前に観察された、少なくとも3日間持続すべきものと類似しているはずです。 （図3）
5. 両方恒暗及び一定の光の中で期間を計算するには、活動のオンセットは、2週間のために決定され、回帰直線を装備する必要があります。前述のように一定の光の期間が24時間よりも大きくなる一方、野生型マウスでは、一定の暗所で期間が24時間未満になります。 （図2および図7）
6. 光パルスは、次のシフトを計算する場合、光パルスの後の前に少なくとも5日間と5日間のアクティビティのオンセットにフィッティングの回帰直線から始めます。位相シフトの大きさを決定するためにこれら二つの回帰直線との差を計算します。 （図4）

5。代表的な結果

レコードを実行しているホイール​​を見たときには、それぞれのマウスで連続運転の数時間を見ると期待してください。マウスは夜行性なので、これは実行中、または活動期、明/暗サイクルの存在下で暗期と相関する。一定の条件で実行している無料のマウスはまた、彼らのフリーランニングリズムの活動期を代表する持続的な活動のこの限定期間を持つことになります。一定の暗さで、これは、24時間よりも短く、一定の光になります。24時間を超える。活性の発現（CT16）後の15分1000luxの光パルス4時間の管理は、この光パルスは、次の日に、遅延アクティビティの開始になります。

図1：代表的な光のスペクトルA.。太陽によって生成される光スペクトルが広いと光スペクトルの視覚的な部分である400nmのと700nmの間の相対的に公平である。 B.青の範囲の低強度で、その赤いバイアスにつながる赤外域における白熱光のピークのスペクトル。 C.標準的な蛍光灯は、目に"白"に表示される光の離散的なピークで構成されています。 D.は、しかし、昼光蛍光灯は高い広いスペクトルと離散周波数のピークを持っている。結果は白熱電球のようにホットではないが、平均的な蛍光灯よりも広いスペクトルを持つ光源です。

図2：サーカディアンphotoentrainment。 actogramは連続した日がy軸にプロットされ、そして時間がx軸上にプロットされている単一のマウスからのアクティビティのグラフである。黒いバーは、車輪の回転数を表し、背景は明/暗サイクルの指示を与えるためにシェーディングされます。暗サイクル：日1-8、マウスは午前12時12分光に収容されています。この時間の間に、マウスはライトのオフセットで起動され、暗期にもその活動を統合。光フェーズの間、活動は最小限に抑えられます。 9日目に、ライトが一定の暗闇の中でマウスを残し、オフになっています。ライトサイクルがなければ、その内因性の時間で実行されているクロックで結果概日時計、への入力はありません。見てわかるように、活動は毎日前のこの動物の内因性の時計が24時間未満であることを示すが開始されます。

図3：再飛散 。再飛散のパラダイムは、新しい光のサイクルに調整する概日時計を強制的にスラッシュあるいはバックライトサイクルをシフト伴います。この例では、サイクルは9日目に6時間を進めており、その後20日目に6時間を遅らせた。両方の状況では、数日間は、再飛散フルに必要とされている、しかし、運動の方向に応じて効果が発現またはオフセット時間のどちらかでより顕著である。

図4：光の短いパルスに応答して、概日リズムのシフト 。一定の暗さに収納A.動物が24時間より短い周期でフリーラン。 8日目に、15分1000ルクスの光パルスは、活性の発現（CT16）の後に4時間を与えられます。次の日に、活動の開始時間のシフトが観察される。位相シフトは、動物の予測発症の時間（前の光パルスに彼らの活動から決定）と、彼らは実際に光パルスは、次の日に実行を開始する時間の差である。
マウスのB.位相応答曲線は、特定の概日時間に短い光パルスに応じて発生するシフト量と方向を示しています。主観的昼（CT0 - 12）中に光パルスはデッドゾーンと呼ばれる重要なシフトを誘導することはできません。 CT12 - 19から、位相遅れがCT16での光パルスに応答して発生するピーク遅延を誘導することができる。 CT 19と24の間、活動のリズムは、ピークの進歩はCT20に光パルスに応答して発生した光パルスに応答して進めてまいります。

図5：ホイールランニングの活性を阻害または夜間に光パルスに応答してマスクされている 。この例では、光周期は16時間光です：8H暗いと活動を統合。 3時間の光パルスは、ライトが4日目のオフに行く2時間後に始まります。この時間の間に、直接活性を阻害する光の能力を示す、ホイールランニングの活動はほとんどないです。活動は、光パルスに続いて再開されます。

図6：T7のライトサイクルは概日サイクル全体での光パルスにマウスを公開するために使用されます 。 T7サイクルは暗いの3.5時間が続く光の3.5時間で構成されています。このサイクルでは、マウスは、概日リズムを維持するしかし彼らはまた、光パルス中に車輪実行中のアクティビティのマスキングが表示されます。光時の活動量は、概日時間によってバイアスされていないマスクの測定のための暗い中に、活動の量と比較することができます。

図7：一定の光の中で延長期間

Discussion

概日リズムは歴史を通して様々な生物で測定し、記録されています。我々は、特にマウスでの活動リズムを記録するための方法を説明しているが、この手法は簡単にそのような多くの場合、概日の研究で使用されているハムスターやラットなど他のげっ歯類でリズムを測定するように変更することができます。しかし、他の生物の再同調にfreerunning期間と時間が異なります。マウスではそれが24時間未満の間、例えば、一定の暗闇の中でハムスターのfreerunning期間は、24.0時間です。あなたが車輪実行中のアクティビティに適していない生物、で作業している状況で、同じ光のパラダイムの多くは、しかし異なった生理的リズムが見れるべき、使用することができます。ほとんど同じような措置は、一般的な活動です。ヒト、サル、イヌでは、研究者はしばしば、個々の移動量を測定するactigraphyを、使用してください。ヒトでは、体温とメラトニンの分泌は、一般的に測定され、両方のシフト^、15、16同調し直すことができる段階の能力が概日リズムを、有することが示されている。

我々は離散的な出現として、これらの生理的リズムを考える一方で、彼らは非常に相互接続されています。動物の活動リズムは体温リズムと密接に重畳表示することと睡眠リズムの逆であることができる。さらに、多くの場合、概日相のマーカーとして使用されるメラトニンの分泌は、密接にヒトの通常の睡眠リズムに似ています。これらのサイクルがそう織り交ぜるされているため、一つの研究では、通知などの結果を予測することができます。例えば、光暗サイクルの暗い部分をアウトも活動を実行する連続的なホイールを示したNPAS2変異マウスは、、後にスリープ欠陥¹⁷について調べた。これらのマウスは、減少が暗期、通常の"昼寝タイム"中に発生すると、以下の全体的な眠りに発見された。

ホイール実行中のアクティビティでは、概日リズムを調べるために、比較的非侵襲的な方法を提供します。上述のパラダイムは、概日行動の詳細な分析を完了するために使用することができます。さらに、このような一定の暗闇の中でphotoentrainmentや住宅などのパラダイムは、サーカディアン表現型の初期調査としての前に、睡眠の分析など、より濃縮された研究に使用することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
11.5 cm running wheels	Mini Mitter
Vital View Software for Data Acquisition	Mini Mitter
Clock lab for data analysis	Actimetrics