Summary
Крысиной модели острого инфаркта миокарда (ОИМ) полезен для изучения последствий МИ на сердечную патофизиологические и физиологические функции.
Protocol
1. Подготовка рабочей зоны
- Рабочей поверхности сначала подготовленную дезинфекции области с 70% этанола.
- Все хирургические инструменты должны стерилизоваться горячей бусинка стерилизатор до операции (а в отдельных операций между крысой). Эти инструменты включают в себя: хирургическое ножницы (2), щипцы (1), изогнутые щипцы (1), иглодержатель (2), и грудь rectractor.
- Марлевые хлопок и аппликаторы должны быть доступны для того, чтобы управлять кровотечением.
- Отрегулируйте температуру теплокровных системы одеяло (грелку), который будет использоваться для поддержания температуры тела животного при температуре 37 ± 1 ° C, для того, чтобы предотвратить резкое падение температуры тела; размер инфаркта зависит от Длительность окклюзии, а температура тела (Tarnavski и соавт.).
- Перед наркозом, каждое животное получит дозу бупренорфина (0.1-2.5 мг / кг SQ) и carprofen устные таблетки (Римадил, Bioserv таблетки, 1 таблетка) за день до операции. В то время, непосредственно перед началом операции, каждое животное будет снова получить дозу бупренорфина (0.1-2.5 мг / кг SQ).
- Примечание: для исследований, связанных с оценкой функции сердца и ремоделирования сердца в течение определенного периода времени (7 - 28 дней и за ее пределами), доза бупренорфина (0.1-2.5 мг / кг SQ) будет управляться, каждые 6 часов после операции в течение 24-48 часов после операции и carprofen оральных таблеток будет предоставляться один раз в день (см. "послеоперационной реабилитации").
2. Подготовка и интубации крыс
- До введения анестезии, животные будут рассмотрены с целью выявления любых уже существующих условий, которые могут усложнить хирургического результата; медицинский осмотр будет включать в себя визуальный осмотр и измерение частоты сердечных сокращений, частоту дыхания и температуру тела и массы тела.
- Если животные полны решимости быть здоровым, 250-300 грамм крыс-самцов (например, Sprague Dawley) будет взвешен и определение характеристик будут записаны.
- Крысы, то под наркозом с 80 мг / кг фенобарбитала; правильный уровень анестезии проверяется с помощью вывода ответа конечности, применяя давление кровати крысы ногтей (носок-пинча рефлекс) и периодически в течение всей процедуры.
- Бупренорфин (0.1-2.5 мг / кг; SQ) будет проводиться во время операции.
- Бритва электрическая затем используется для бритья меха форме шеи и груди областях. Примечание: для исследований, связанных с оценкой функции сердца и ремоделирования сердца в течение определенного периода времени (7 - 28 дней и за ее пределами), мех должен быть полностью бритая от хирургической области для сохранения стерильности.
- Бритая областях должны быть вымыты и продезинфицированы с бетадин решение следует вытирая области с 70% спирта, это бетадин и кустарников алкоголя и дезинфекции процедура повторяется три раза.
- Наркозом животного помещается в лежачем положении на теплокровных системы одеяло (грелку) с целью поддержания температуры тела.
- Интубация трахеи затем осуществляться сначала тщательно подвергая трахеи, в целях повышения визуализации интубации, сделав 5 мм середины шеи разрез и ретракция мышечных тканей, чуть выше трахеи.
- Это позволяет лучше визуализации для введения эндотрахеальной трубки (полиэтилен размер 90, ПЭ 90), где трубка скошенной по краю для удобства входа через гортань.
- Эндотрахеальная трубка вводится в трахею, с визуализацией помогают с помощью операционного микроскопа стерео, путем тщательного манипулирования языком во время просмотра трахеи и вход эндотрахеальной трубки.
- Механическая вентиляция, то возможен благодаря подключению к эндотрахеальной трубки в Кент Научно вентилятор (ТОПО Dual Mode), езда на велосипеде на 80 вдохов в минуту, дыхательный объем в 1,2 мл на 100 грамм веса тела.
- Стерильной драпировки помещается над крысой, оставив только хирургическое площадь воздействия, что позволяет минимизировать возможное загрязнение во время операции.
- Хирург животных и помощники носить маску, халат и перчатки, не снимая перчаток изменяется между отдельными операции крысы.
3. Переходные левой передней нисходящей (LAD) артерии Лигирование
- Как только устойчивый дыхания установлено, грудь открыта в левой четвертом межреберье, с помощью hemostats или круглые ножницы конца, чтобы открыть пространство, но без разреза тканей, так что риск кровотечения может быть снижена.
- Грудь втягивающим затем позиционируется в четвертом межреберье, с целью распространения ребра так, чтобы левого желудочка (ЛЖ) подвергается, беря максимальное стараясь не повредить легкие.
- Перикард, затем открывается, но остается на месте, если это возможно.
- Проксимальной левой передней нисходящей (LAD) артерии будут определены (рис.-1), с использованием в качествеurgical микроскоп стерео, и LAD затем временно лигируют (или может быть связана с удавкой), используя 6-0 проленовой шва на 30-минутном периоде ишемического (рис.-1), но без экстериоризации сердце.
- Чтобы разрешить сердечной реперфузии, микрохирургические ножницы для резки узел лигатуры (или, выпустив Slipknot), сделанные 6-0 проленовой шва, 30-минут после перевязки ЛАД.
- В фиктивный крыс контроля, процедура идентична, за исключением ЛАД не временно лигировали.
- Отток затем кратко (1-2 секунды) ущипнул прочь на респиратор, чтобы повторно инфляции легких.
- Грудь втягивающим затем удаляется и ребра взяты вместе, используя 2-0 проленовой шва с прервано швом узор.
- Как только ребра закрыты, отток вентилятор вновь кратко (1-2 секунды) ущипнул от обеспечения правильного дыхания.
- Кожа закрыт с помощью 6-0 проленовой шва с непрерывным швом узор.
4. Подтверждение успешного Лигирование артерии LAD
- Правильное перевязки ЛАД будет подтверждена путем наблюдения побледнение ткани миокарда дистальнее шов, а также дисфункция передней стенки; как это наблюдалось в течение переходного перевязки ЛАД.
- Реперфузии будет проверено возвращение красный цвет ткани миокарда и демонстрация некоторых восстановление движения передней стене, как это наблюдалось сразу после перевязки переходных ЛАД.
- Примечание: для исследований, связанных с оценкой функции сердца и ремоделирования сердца в течение определенного периода времени (7 - 28 дней и за ее пределами), эхокардиография будут выполняться 24-часов после ЛАД труб, для того, чтобы определить степень индуцированной инфаркта миокарда. Все животные с левого желудочка фракции укорочения (LV FS) <20%, определяемая по эхокардиографии, а также передние движения стенки в соответствии с дисфункцией миокарда, будут определены и используются для последующей сердечной функции и реконструкции исследований. Шам контрольных крыс должны иметь нормальные LV FS между 40-45% (-дель-Монте и др.).
5. Послеоперационной реабилитации
- Как только операция завершится, стерильные драпировать над животным будут удалены. Температура тела (по ректального термометра), частота дыхания (при визуальном осмотре), частота сердечных сокращений (на учащенное сердцебиение), и аномальные признаки боли, подлежат надзору, пока животное становится амбулаторно.
- Крыса будет удален из вентилятора, а затем поместить в клетку животного и позволили, чтобы оправиться от наркоза. В этой клетке, один конец клетки будут согреты грелку, чтобы крысы искать тепло. Кроме того, вода будет доступна для крыс в течение этого периода наблюдения.
- Если признаки обезвоживания наблюдается после операций, 0,5 мл стерильного физиологического раствора будет внутрибрюшинно (IP).
- Бупренорфин (0.1-2.5 мг / кг; SQ) будет вводиться сразу после операции, а во время послеоперационного восстановления.
- Примечание: для исследований, связанных с оценкой функции сердца и ремоделирования сердца в течение определенного периода времени (7 - 28 дней и за ее пределами), доза бупренорфина (0.1-2.5 мг / кг SQ) будет управляться, каждые 6 часов после операции в течение 24-48 часов после операции. Carprofen устные таблетки (Римадил, Bioserv таблетка) также будет оказана (1-таблетке в день) в течение 48-часов после операции.
6. Гистологическая оценка ишемией
- После завершения 4-часовой период реперфузии, крысы должны быть под наркозом снова с 80 мг / кг фенобарбитала и LAD лигируют еще раз (или удавкой можно retied) (Huang и др. и Kaiser и др.).
- 1 мл 5% Синий Эвана (в фосфатно-солевой буфер), затем вводят в правый желудочек и камеры разрешено заливать для 2-х минут.
- После 2-минут, 1 мл насыщенного раствора хлорида калия, затем вводится в правую камеру желудочка, чтобы остановить сердце от побоев.
- Сердце затем быстро вырезали, встроенные в 2% агарозном фосфатным буферным раствором, а затем секционного в 1-2 мм кубиков.
- Жизнеспособного миокарда затем окрашивали 2% хлорида трифенил тетразолия (ТТК) в течение 20-минут и изображения каждого среза в плен. Изображения затем количественно для того, чтобы определить количество инфарктов области: (1), который не высокого риска (синие участки), (2) область высокого риска (AAR, красные и белые участки), и (3 ) области, которая является инфаркта (белый "неокрашенных" разделов) (рис.-2).
7. Представитель Результаты
Для исследований, связанных с оценкой размера инфаркта и область высокого риска (AAR), синим красителем Эванса и трифенил хлорида тетразолия (ТТК), после 4-часовой реперфузии, правильная перевязка ЛАД может быть подтвержденопутем наблюдения побледнение ткани миокарда дистальнее шов, а также дисфункция передней стенки; как это наблюдалось в течение переходного перевязки ЛАД. Реперфузии может быть проверена путем возвращения красный цвет ткани миокарда и демонстрация некоторых восстановление движения передней стене; наблюдается сразу после перевязки переходных ЛАД. Для исследований, связанных с оценкой функции сердца и ремоделирования сердца в течение определенного периода времени (7 - 28 - дней, и за его пределами), правильная перевязка ишемии реперфузии следует также может быть подтверждено побледнение ткани, дисфункция передней стенке и возвращение красного цвета с некоторым восстановлением движения стенки после реперфузии. Кроме того, нарушения сердечной функции может быть определена эхокардиография выполняется 24-часов после ЛАД труб, для того, чтобы определить степень индуцированной инфаркта миокарда. Все животные с левого желудочка фракции укорочения (LV FS) <20%, определяемая по эхокардиографии, а также передние движения стенки в соответствии с дисфункцией миокарда, будут определены и используются для последующей сердечной функции и реконструкции исследований. Шам контрольных крыс должны иметь нормальные LV FS между 40-45% (-дель-Монте).
Рисунок 1. Принципиальная схема инфаркта миокарда и LAD труб. Принципиальная схема (1) инфаркт миокарда и (2) перевязка левой передней нисходящей желудочка (LAD) артерии использованием шва, используемые для имитации инфаркта миокарда, вызванного чумой образования.
Рисунок 2. Представителю изображения из сердца крысы после ОИМ. Представитель образ сердца крысы показывающий область, в синей (без окклюзии коронарной перфузии область), площадь в красном (окклюзии коронарной перфузии области выделяется область высокого риска (AAR) для миокарда, и области в белый / желтый (зона инфаркта в AAR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Острый инфаркт миокарда (ОИМ) у крыс, также известный как ишемия-реперфузия (ИК), обычно используется для имитации человеческой ремоделирование желудочка приводит к сердечной недостаточности. Прогрессирование дисфункции ЛЖ и сердечной недостаточности на животных моделях (крысы и мыши) аналогична наблюдавшейся в людях, которые поддерживают М.И., выжить, а затем впоследствии развивается сердечная недостаточность (Goldman). Это процедура, описанная одной из версий этой техники, а также содержит дополнительную отмечает, описывающих методологических изменений. Дополнительная такие изменения к острым инфарктом миокарда (ОИМ) процедуры включают продолжительности ишемии и длительность реперфузии. Существуют также вариации относительно хирургическая процедура используется для получения доступа и перевязывать ЛАД. Что касается продолжительности ишемических период, время ЛАД перевязки, чтобы вызвать инфаркт миокарда может быть ограничено остро (30-минут 60-минут, AMI), или, наоборот, ограничение хронически (постоянные; MI). Что касается продолжительности реперфузии после этого начального периода ишемического до инфаркта оценки (то есть последующий период реперфузии), может быть коротким (4-часов до 24 часов), чтобы оценить размер инфаркта и область высокого риска (AAR ) синим красителем Эванса и трифенил хлорида тетразолия (ТТК), или, наоборот, длительная (7-дневная до 28 дней и за ее пределами) с целью оценки функции сердца и реконструкции. Это патологическое ремоделирования сердца (апоптоз, некроз и дисфункции ЛЖ) будет варьироваться в зависимости от выбранной продолжительности ишемии и реперфузии. В качестве альтернативы хирургической процедуры минимально подвергая сердце, чтобы перевязывать ЛАД в четвертом межреберье и без экстериоризации сердца (см. Часть 3: Переходные левой передней нисходящей (LAD) Лигирование артерии), разрез через грудины , для создания большего доступа и видом на сердце, могут быть выполнены. Короче говоря, надрез делается через брюшную кожу груди до середины грудной клетки, после чего грудная клетка открыта до середины грудины. Это частичное торакотомия сопровождается втягивание грудины края с втягивающим. Проксимальной артерии LAD отождествляется с использованием операционного микроскопа, и либо временно лигируют (или может быть связана с удавкой) с помощью 6-0-проленовой шва на 30-минутном периоде ишемического (AMI) или постоянно лигируют с использованием 6-0-проленовой шва (MI). Для AMI процедур, микрохирургические ножницы будут использованы для разрубить узел в лигатура 30-минут после ЛАД труб. Отток затем кратко (1-2 секунды) ущипнул прочь на респиратор, чтобы повторно инфляции легких. Втягивающим удаляется, а ребра сближены и зашивается использованием 2-0 проленовой с прервано швом узор. Как только грудная клетка закрыта, отток кратко ущипнул снова для обеспечения правильного дыхания и кожи закрывают 6-0 проленовой швов с непрерывным швом узор. В целом, острый инфаркт миокарда (ОИМ) животной модели, описанные в этом протоколе имитирует человеческое ишемической болезни сердца и служит важным инструментом, чтобы помочь выяснить молекулярные механизмы сигнализации, участвующих в ремоделирования сердца и сердечной недостаточности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
BKM поддерживается Национальным институтом здоровья (NIH) / Национальная легкого сердца и крови институт (NHLBI) грант (R01-HL085487). MH поддерживается Американской ассоциации сердца Национальный (AHA) Ученый грантов на цели развития (ГРС) и Общества гериатрической кардиологии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ventilator | Kent Scientific | TOPO | TOPO Dual Mode |
| Thermostatic Circulator E103 | Harvard Apparatus | 732802 | |
| Homeothermic Blanket System | Harvard Apparatus | 55-7222F | |
| Stereo Microscope | Nikon Instruments | MMA36300 | SMZ-645 Zoom Stereo Microscope |
| Hot Bead Sterilizer | Harvard Apparatus | 610183 | |
| Electric Shaver | GE Healthcare | ||
| Blades and Handles | Welch Allyn | 690047-1 | Standard (Lamp) Laryngoscope Blades |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14014-17 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11028-15 | |
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12004-18 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Chest Retractor | Fine Science Tools | 17008-07 | |
| Masks | VWR international | 47730-640 | |
| Gauze Sponges | Dermacea | 441205 | |
| Sterile Gloves | Cardinal Health | 2D7203I | |
| PE 90 tubing | BD Biosciences | 427420 | |
| 20 ml Syringe | BD Biosciences | 301625 | |
| 6-0 Prolene Suture | Ethicon Inc. | 8706H | |
| 2-0 Silk Suture | Ethicon Inc. | K873H | |
| Pentobarbital Sodium Injection | OVATION Pharmaceuticals | NDC 67386-501-55 | |
| Povidone-Iodine | NOVAPLUS | V10-8204 | |
| Buprenorphine | Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 |
References
- Hunt, S. A., Baker, D. W., Chin, M. H., Cinquegrani, M. P., Feldmanmd, A. M., Francis, G. S., Ganiats, T. G., Goldstein, S., Gregoratos, G., Jessup, M. L., Noble, R. J., Packer, M., Silver, M. A., Stevenson, L. W. SC.ACC/AHA Guidelines for the Evaluation and Management of Chronic Heart Failure in the Adult: Executive Summary A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines (Committee to Revise the 1995 Guidelines for the Evaluation and Management of Heart Failure). Circulation. 104, 2996-3007 (2001).
- Goldman, S., Raya, T. E. Rat infarct model of myocardial infarction and heart failure. J Card Fail. 1, 169-177 (1995).
- Tarnavski, O., McMullen, J. R., Schinke, M., Nie, Q., Kong, S., &, I. zumo, S, Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiol Genomics. 16, 349-360 (2004).
- Thygesen, K., Alpert, J. S. Universal Definition of Myocardial Infarction. Circulation. 116, 2634-2653 (2007).
- Vasilyev, N., Williams, T., Brennan, M. L., Unzek, S., Zhou, X., Heinecke, J. W., Spitz, D. R., Topol, E. J., Hazen, S. L., Penn, M. S. Myeloperoxidase-generated oxidants modulate left ventricular remodeling but not infarct size after myocardial infarction. Circulation. 112, 2812-2820 (2005).
- McConnell, B. K., Popovic, Z., Mal, N., Lee, K., Bautista, J., Forudi, F., Schwartzman, R., Jin, J. P., Penn, M., Bond, M. Disruption of protein kinase A interaction with A-kinase-anchoring proteins in the heart in vivo: effects on cardiac contractility, protein kinase A phosphorylation, and troponin I proteolysis. J Biol Chem. 284, 1583-1592 (2009).
- Monte, D. el, Butler, F., Boecker, K., Gwathmey, W., K, J., Hajjar, R. J. Novel technique of aortic banding followed by gene transfer during hypertrophy and heart failure. Physiol. Genomics. 9, 49-56 (2002).
- Huang, M. H., Nguyen, V., Wu, Y., Rastogi, S., McConnell, B. K., Wijaya, C., Uretsky, B. F., Poh, K. K., Tan, H. C., Cheng, J., Perin, E., Fujise, K. Synergistic Infarct Size Reduction by Combination Therapy with Milrinone and Esmolol at Early Reperfusion during Acute Myocardial Infarction. American Journal of Physiology. , Forthcoming Forthcoming.
- Kaiser, R. A., Bueno, O. F., Lips, D. J., Doevendans, P. A., Jones, F., Kimball, T. F., Molkentin, J. D. Targeted inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase antagonizes cardiac injury and cell death following ischemia-reperfusion in vivo. J Biol Chem. 279, 15524-15530 (2004).
