Summary
Morpholinos 24hpf पर zebrafish otocyst में सीधे देने के लिए एक विधि विकसित किया गया है. कान पुटिका और electroporation के लिए पैठ प्रभाव के लुमेन में morpholinos के microinjection का उपयोग, हम morpholinos के प्रभाव मस्तिष्क पर बाईपास और भीतरी कान के लिए विशेष प्रभाव प्राप्त करने में सक्षम थे.
Abstract
हाल के वर्षों में, electroporation आंख, मस्तिष्क, और zebrafish के somites सहित विभिन्न ऊतकों में डीएनए, शाही सेना, और morpholinos के vivo अभिकर्मक के लिए एक लोकप्रिय तकनीक बन गया है. आनुवंशिक हेरफेर के अन्य तरीकों पर electroporation का लाभ यह है कि विशिष्ट ऊतकों, लक्षित किया जा सकता है spatially और अस्थायी दोनों मौजूदा बिजली के आवेदन के द्वारा अणुओं की शुरूआत के लिए. यहाँ हम zebrafish के भीतरी कान के विकास के ऊतकों में mif mif - तरह morpholinos transfecting लिए electroporation के उपयोग का वर्णन . पिछले अध्ययनों में, mif morpholino 1 पर भ्रूण में इंजेक्ट - 8 सेल चरण के लिए तंत्रिका तंत्र और आंखों में बड़े पैमाने पर morphological परिवर्तन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कान में हुई. भीतरी कान के विकास में बाद के चरणों में ऊतकों को लक्षित करके, हम विकासशील भीतरी कान में MIF के प्राथमिक प्रभावों का निर्धारण, माध्यमिक प्रभाव है कि अन्य ऊतकों के प्रभाव से परिणाम हो सकता है के लिए विरोध के रूप में कर सकते हैं. Phalloidin और acetylated न्यूरॉन्स, neuronal प्रक्रियाओं, और बालों के पीछे मैक्युला के साथ जुड़े कोशिकाओं की आकारिकी अध्ययन धुंधला ट्यूबिलिन का उपयोग करके, हम zebrafish भीतरी कान में लक्षित अभिकर्मक के लिए एक विधि के रूप में electroporation की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने में सक्षम थे. 24hpf भ्रूण के कान vesicles morpholinos और electroporated के साथ अंतःक्षिप्त थे और फिर भ्रूण कि कोई उपचार प्राप्त था या केवल एक या इंजेक्शन गया electroporated की तुलना में. भ्रूण कि इंजेक्शन थे और electroporated बाल सेल संख्या में कमी देखी गई, statoacoustic नाड़ीग्रन्थि (शिथिलता) और नियंत्रण समूहों के साथ तुलना में कम शिथिलता न्यूरॉन्स द्वारा innervation की कमी हुई. हमारे नतीजे बताते हैं कि बाद के चरणों में otocysts में morpholinos के प्रत्यक्ष वितरण गैर विशिष्ट तंत्रिका तंत्र और 1-8 सेल स्तर पर वितरित morpholinos के तंत्रिका शिखा प्रभाव से बचा जाता है. यह भी अनुमति देता है कि भीतरी कान और मस्तिष्क, तंत्रिका शिखा या periotic mesenchyme पर प्राथमिक प्रभाव से कान नहीं माध्यमिक प्रभाव के लिए निर्देशित कर रहे हैं प्रभाव की परीक्षा है.
Protocol
1. Electroporation के लिए इलेक्ट्रोड बनाने
- कट 75 सुक्ष्ममापी व्यास उपयुक्त लंबाई के टंगस्टन (AM सिस्टम्स, इंक Carlsborg, WA) तार (लगभग 3-5 सेमी)
- Molex केबल संबंधक (पिन मुद्रांकित पीतल) के माध्यम से तार टंगस्टन रखो
- लपेटें टंगस्टन तारों और टयूबिंग हटना (छठे वेतन आयोग प्रौद्योगिकी, शिकागो, आईएल) और Bunsen बर्नर या गर्मी बंदूक के साथ गर्मी लागू करने के लिए तार करने के लिए सिकुड़ ट्यूबिंग मुहर के साथ Molex केबल संबंधक
- टंगस्टन तार की नोक पैनापन करने के लिए, 1.0 एन सोडियम हीड्राकसीड में तार डुबकी (कॉनरोड एट अल. +१,९९३) और एक अन्य इलेक्ट्रोड के रूप में कागज - क्लिप का उपयोग कर, एक स्क्वायर वेव Electroporator के साथ तार electrolyze. स्थितियों का उपयोग हम 5 50 वोल्ट दालों दालों के बीच एक स्थायी 100 में 50 एमएस के साथ एमएस. इलेक्ट्रोड 15-20 सुक्ष्ममापी की एक व्यास को तेज किया जाना चाहिए
- एक ट्रे में क्ले मॉडलिंग में पूर्व दबाया electroporation में उपयोग करने के लिए grooves के भीतर तार रखें
2. Electroporation स्टेशन सेट
- टेप micromanipulators (विश्व प्रेसिजन उपकरणों) 75μm टंगस्टन इलेक्ट्रोड बढ़ाई.
- विदारक माइक्रोस्कोप मंच (Leica) के दोनों तरफ प्लेस micromanipulators.
- कनेक्ट को सुरक्षित रखें CUY 21-संपादित करें स्क्वायर वेव Electroporator (चित्रा 1) के लिए इलेक्ट्रोड.
- Electroporator पर मुड़ें और electroporation के लिए वोल्टेज स्पंद अवधि और दालों की संख्या सहित पैरामीटर, सेट. इस प्रयोग के लिए सबसे प्रभावी मानकों को तीन 13 वोल्ट दालों जो प्रत्येक 5.0ms के लिए प्रत्येक नाड़ी के बीच में 100ms के साथ चली पाए गए. यदि electroporation भ्रूण में हवाई बुलबुले बनाता है, नाड़ी की लंबाई कम.
3. Morpholinos के Zebrafish कान पुटिका में Microinjection
- हार्वेस्ट एक प्रजनन टैंक से zebrafish भ्रूण. में भ्रूण सेते भ्रूण 0.3 पीपीएम methylene नीले 28.5 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर (Westerfield 2005) के साथ मध्यम जुटाने.
- Sutter P-97 इलेक्ट्रोड खींचने के साथ कांच सुइयों खींचो
- एक agarose जेल आधार (मछली पानी में 1 agarose एक 10 मिमी पेट्री डिश में%) गर्म डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 37
- हीट 1% कम मछली पानी में गलनांक agarose (LMPA) तक पिघल और यह 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म रखने के लिए.
- एक morpholino समाधान (GeneTools, Corvallis, या) के साथ एक गिलास सुई भरें और उचित व्यास टिप कटौती. एक micromanipulator (Kuhn) पर माउंट इंजेक्शन सुई.
- सुई लगभग 10 सुक्ष्ममापी टिप कट और खनिज तेल में इंजेक्षन करने के लिए सुनिश्चित करें कि टिप morpholino समाधान के लिए पर्याप्त वितरण की अनुमति देता है.
- 24 घंटे postfertilization (HPF) भ्रूण Dechorinate और MS222 (tricaine, सिग्मा) के साथ 0.3 पीपीएम methylene नीले मछली पानी में उन्हें anesthetize.
- सुविधाजनक वर्दी विश्लेषण के लिए दाईं ओर के साथ agarose जेल आधार पर 3 से 5 anesthetized भ्रूण संरेखित करें
- प्रत्येक भ्रूण से अधिक 1% LMPA के 1 से 2 बूँदें डाल दो और जगह में भ्रूण ठीक जमना
- सही पक्ष पर इतना है कि कान का पुटिका है पेट्री डिश घुमाएँ
- कान पुटिका के लुमेन में सुई प्लेस और एक PV820 वायवीय PicoPump (विश्व परिशुद्धता उपकरण) के साथ एक संलग्न नाइट्रोजन टैंक (चित्रा 2) के साथ morpholino समाधान इंजेक्षन
4. Electroporation प्रक्रिया
- इंजेक्शन के बाद तुरंत electroporation स्टेशन घुड़सवार भ्रूण हटो
- बस कान पुटिका पीछे ऊतक पर इलेक्ट्रोड सकारात्मक प्लेस, लेकिन घुसना नहीं, सिर्फ कान पुटिका के लिए पूर्वकाल मस्तिष्क में नकारात्मक इलेक्ट्रोड डालने
- एक पैर या एक स्विच धक्का द्वारा पेडल का उपयोग वर्तमान लागू.
- Agarose पर मछली पानी डालो और agarose से घूमता है और एक गिलास विंदुक के साथ भ्रूण को हटाने. सावधानी बरतें भ्रूण को नुकसान नहीं है. भ्रूण कि निकालना मुश्किल कर रहे हैं के लिए, एक सुई का उपयोग करने के लिए धीरे दूर किसी भी भ्रूण आसपास LMPA तोड़.
- Methylene नीले मछली पानी और विश्लेषण के लिए वांछित चरणों (रूपिम, स्वस्थानी संकरण, आदि, और सूक्ष्म anlaysis में immunohistochemical) भ्रूण जुटाने के साथ एक प्लेट में रखें भ्रूण .
5. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1 electroporation स्टेशन. इलेक्ट्रोड तेज 75μm टंगस्टन तारों का उपयोग किया गया था और को सुरक्षित रखें CUY 21 वर्ग तरंग संपादित करें Electroporator की ओर जाता है से जुड़ा है. ये इलेक्ट्रोड micromanipulators टेप थे.
चित्रा 2 इंजेक्शन स्टेशन. सभी भ्रूण मानकीकरण उद्देश्यों के लिए सही कान में इंजेक्शन थे.
चित्रा 3. 3 DPF भ्रूण के साथ actin filaments के Phalloidin धुंधला हो जाना. (ए) 3 DPF भ्रूण injecteनियंत्रण एमओ के साथ घ पीछे मैक्युला (बजे) में phalloidin की मजबूत धुंधला हो जाना है. (बी) में इंजेक्शन केवल भ्रूण में भ्रूण जो नियंत्रण एमओ के साथ अंतःक्षिप्त किया गया था और तब electroporated बजे phalloidin धुंधला के समान स्तर पर था. (सी) mif राज्यमंत्री के साथ कान का पुटिका में अकेले इंजेक्शन phalloidin धुंधला की कमी का कारण नहीं था, जबकि mif राज्यमंत्री electroporation के साथ इंजेक्शन phalloidin धुंधला दोपहर (डी) में एक नाटकीय कमी के कारण होता है. हूँ, पूर्वकाल मैक्युला.
चित्रा 4 5 DPF लार्वा के साथ actin filaments के Phalloidin धुंधला. इंजेक्शन के बीच कोई अंतर ही था (ए) और electroporation के साथ इंजेक्शन जब मानक नियंत्रण morpholino (बी) का इस्तेमाल किया गया था. हालांकि, 5 DPF लार्वा कि mif morpholinos और electroporated के साथ अंतःक्षिप्त थे पीछे मैक्युला (बजे) (डी) में phalloidin धुंधला हो जाना, हालांकि कम 3 DPF की तुलना में नाटकीय, जब भ्रूण है कि mif केवल morpholinos (सी इंजेक्शन के साथ किया गया था के साथ तुलना में कम दिखाया ). हूँ, पूर्वकाल मैक्युला.
5 चित्रा 3 DPF में भ्रूण के acetylated ट्यूबिलिन धुंधला हो जाना. (ए) में भ्रूण किसी भी इंजेक्शन या electroporation प्राप्त नहीं किया. (बी) में भ्रूण electroporated लेकिन कोई इंजेक्शन प्राप्त किया गया था. Mif morpholinos साथ दोनों इंजेक्शन और electroporation (सी, डी) प्राप्त भ्रूण दिख था नियंत्रण की तुलना में कम ट्यूबिलिन धुंधला हो जाना. (बजे, पीछे मैक्युला).
चित्रा 6 के साथ 3 नियंत्रण morpholino DPF पर भ्रूण की acetylated ट्यूबिलिन धुंधला. (ए) किसी भी उपचार के बिना भ्रूण पीछे मैक्युला (बजे) और व्यापक innervation में मजबूत acetylated ट्यूबिलिन धुंधला दिखाया. (बी) भ्रूण नियंत्रण morpholino के साथ अंतःक्षिप्त. (सी) भ्रूण केवल electroporation के साथ इलाज किया. (डी) के साथ नियंत्रण नियंत्रण morpholino भ्रूण इंजेक्शन और electroporated कोई उपचार नियंत्रण की तुलना में पीछे मैक्युला और innervation में acetylated ट्यूबिलिन के समान स्तर है.
Discussion
हम सफलतापूर्वक 24 HPF zebrafish भ्रूण के कान में antisense oligonucleotide राज्यमंत्री शुरू. है कि इंजेक्शन और electroporation के बाद उठाया गया भ्रूण व्यवहार्य थे. यदि भ्रूण electroporation बच गया, वे भ्रूण कि कोई उपचार है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भ्रूण कि केवल इंजेक्शन दिया गया था और भ्रूण कि केवल electroporated किया गया था प्राप्त किया था की तुलना में सामान्य दरों पर वृद्धि हुई.
हम कान इंजेक्शन और electroporation के बाद phalloidin और acetylated ट्यूबिलिन के साथ लेबलिंग के माध्यम से mif mif तरह - राज्यमंत्री के प्रभाव मनाया. पीछे मैक्युला के संवेदी बालों की कोशिकाओं में actin filaments के Phalloidin धुंधला mif mif तरह 24 HPF मंच पर एमओ की है कि electroporation इंगित करता है बाल सेल और / या stereocilia संख्या में परिवर्तन का कारण बनता है जब भ्रूण कि केवल राज्यमंत्री के साथ अंतःक्षिप्त थे की तुलना में (चित्रा 3). बाल सेल संख्या में यह कमी शेन एट अल के निष्कर्षों के साथ संगत है (प्रस्तुत). कि mif और mif की तरह राज्यमंत्री saccular मैक्युला में बालों की कोशिकाओं की संख्या में कमी का कारण है. भ्रूण कि राज्यमंत्री और electroporated के साथ अंतःक्षिप्त थे कि electroporation प्रदर्शित में बाल सेल संख्या में कमी कोशिका झिल्ली भर में राज्यमंत्री बढ़ने में सहायता, जिससे रूपात्मक प्रभाव की हद तक जब भ्रूण जिसमें कान पुटिका ही इंजेक्ट किया गया था की तुलना में बढ़ रही हो सकता है. Statoacoustic नाड़ीग्रन्थि की आकारिकी में परिवर्तन acetylated ट्यूबिलिन धुंधला हो जाना के माध्यम से मनाया गया. statoacoustic नाड़ीग्रन्थि द्वारा innervation की हद तक, भ्रूण है कि इंजेक्शन थे और electroporated शो neurites (चित्रा 5) की शाखाओं में कमी आई के रूप में प्रभावित किया गया था. वहाँ भी ganglionic कोशिकाओं और / या नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के कम संख्या के संक्षेपण कम किया जा सकता है, क्योंकि acetylated ट्यूबिलिन धुंधला भ्रूण कि दोनों अंतःक्षिप्त थे electroporated में काफी कमी आई है. क्योंकि mif तंत्रिका तंत्र के विकास (सुजुकी एट अल., 2004) के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है, electroporation के बाद देखा परिवर्तन की वृद्धि mif और mif की तरह neuroblast कोशिकाओं में एमओ समाधान. अभिकर्मक के परिणाम हो सकता है
एक विकासशील ऊतक में सीधे antisense oligo morpholinos के electroporation है कि ऊतक के विकास के दौरान भ्रूण में दोनों spatially और अस्थायी, जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है. Mif और mif की तरह भीतरी कान के ऊतकों में राज्यमंत्री के electroporation दोनों पीछे मैक्युला और statoacoustic नाड़ीग्रन्थि की असामान्य आकारिकी में हुई. भ्रूण कि इंजेक्ट किया गया था और है कि कोई भी उपचार प्राप्त किया था या भ्रूण कि या तो केवल था इंजेक्शन गया या केवल electroporated के साथ भ्रूण के साथ तुलना में electroporated में पीछे मैक्युला में संवेदी बालों की कोशिकाओं की संख्या में कमी थी. वहाँ भी statoacoustic नाड़ीग्रन्थि और शिथिलता के आकार से पीछे संवेदी पैच के innervation की डिग्री में एक कमी थी. Electroporation विशिष्ट ऊतकों में बड़े अणुओं के साथ, transfecting वांछित ऊतकों में है कि विशेष रूप से डीएनए, शाही सेना, या एमओ के प्राथमिक प्रभाव देख और अन्य ऊतकों पर माध्यमिक प्रभाव से इन भेदभाव, मस्तिष्क, तंत्रिका शिखा और सहित के लाभ के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है भीतरी कान के विकास पर periotic mesenchyme (Barald और Kelley, 2004).
Disclosures
लेख के उत्पादन जीन उपकरण, LLC, जो वीडियो और पाठ में उल्लेख किया अभिकर्मकों उपज के द्वारा प्रायोजित किया गया था.
Acknowledgments
इस काम KFB के लिए बहरापन रिसर्च फाउंडेशन से Yc एस और NSF (0930096 IOS) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
KFB: 2 NIH / NINDCD DC04184 RO1, 3R01DC004184-08W1 , NSF DBI 0832862, NSF IOS 0930096
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sutter P-97 electrode puller | Equipment | |||
| PV820 Pneumatic PicoPump | Equipment | World Precision Instruments, Inc. | ||
| M3301L Manual Micromanipulator | Equipment | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Leica S6D stereomicroscope | Equipment | |||
| Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator | Equipment | |||
| Olympus FV500 confocal microscope | Equipment | |||
| 0.01 inch Platinum Wire | Supply | A-M Systems | 711000 | |
| Shrink Tubing | Supply | Newark Inc | 03F3172 | |
| Socket Crimp Terminal | Supply | Digi-Key | 82PECT-ND | |
| Capillaries | Supply | Stoelting Co. | 50613 | |
| Modeling clay | Supply | |||
| Plastic 100 mm Petri dishes | Supply | Falcon BD | ||
| 6 well plastic plates | Supply | Falcon BD | ||
|
||||
References
- Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).
- Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development. J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).
- Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. From placode to polarization: new tunes in inner ear development. Development. 131, 4119-4135 (2004).
