Summary
وقد تم تطوير طريقة لإيصال morpholinos مباشرة في otocyst الزرد في 24hpf. microinjection به من morpholinos في تجويف الحويصلة الأذنية وelectroporation لإحداث الاختراق ، وكنا قادرين على تجاوز تأثير morpholinos على الدماغ والحصول على آثار محددة على الأذن الداخلية.
Abstract
في السنوات الأخيرة ، أصبح electroporation تقنية الشعبية لترنسفكأيشن في الجسم الحي من الحمض النووي ، والجيش الملكي النيبالي ، وmorpholinos في الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك العين ، والدماغ ، وsomites من الزرد. ميزة electroporation خلال وسائل أخرى للتلاعب الجيني يمكن أن تكون مستهدفة أنسجة معينة ، مكانيا وزمنيا ، لإدخال الجزيئات الكبيرة من تطبيق التيار الكهربائي. نحن هنا وصف استخدام electroporation لtransfecting MIF MIF وmorpholinos تشبه في أنسجة الأذن الداخلية النامية من الزرد. في دراسات سابقة ، MIF morpholino تحقن الأجنة في 1 -- 8 خلايا المرحلة أسفرت عن تغيرات شكلية على نطاق واسع في الجهاز العصبي والعين ، وكذلك الأذن. من خلال استهداف أنسجة الأذن الداخلية في مراحل لاحقة في عملية التنمية ، يمكننا تحديد الآثار الأولية لMIF في الأذن الداخلية النامية ، بالمقارنة مع الآثار الثانوية التي قد تنجم عن تأثير الأنسجة الأخرى. باستخدام تويولين phalloidin الأسيتيل وتلطيخ لدراسة مورفولوجية الخلايا العصبية ، والعمليات العصبية ، والخلايا المرتبطة الشعر البقعة الخلفي ، كنا قادرين على تقييم فعالية electroporation كطريقة لترنسفكأيشن المستهدفة في الأذن الداخلية الزرد. تم حقن الحويصلات أذني الأجنة 24hpf مع morpholinos وelectroporated وتمت مقارنة ثم إلى الأجنة التي لم تتلق العلاج أو حقنت فقط أو electroporated. وأظهرت الأجنة التي تم حقنها وelectroporated انخفاض في أعداد خلايا الشعر ، وانخفاض تعصيب من العقدة statoacoustic (SAG) ، وعدد أقل من الخلايا العصبية SAG مقارنة مع مجموعات المراقبة. وأظهرت نتائجنا ان النقل المباشر للmorpholinos في otocysts في مراحل لاحقة يتجنب نظام غير محددة العصبي والآثار العصبية للقمة morpholinos ألقاها في مرحلة الخلية 1-8. أنها تسمح أيضا دراسة التأثيرات التي توجه إلى الأذن الداخلية ، وليس الآثار الثانوية على الأذن من الآثار الأولية في الدماغ ، أو اللحمة المتوسطة قمة العصبية المحيطة بالأذن.
Protocol
1. لصنع أقطاب Electroporation
- قطع أسلاك قطرها 75 ميكرومتر التنغستن (AM سيستمز Carlsborg ، WA) بطول مناسب (حوالي 3-5 سم)
- وضع سلك التنغستن من خلال كابل موصل MOLEX (النحاس ختمها دبوس)
- أسلاك التنجستين التفاف وMOLEX موصل كابل مع الأنابيب يتقلص (SPC تكنولوجيا في شيكاغو ، IL) وتطبيق الحرارة مع الشعلة بنسن أو بندقية الحرارة لختم الأنابيب تقلص إلى سلك
- لشحذ غيض من سلك التنجستن ، وتراجع في السلك هيدروكسيد الصوديوم 1.0 N (كونراد وآخرون 1993) ، واستخدام ورقة كليب باعتبارها القطب الآخر ، electrolyze السلك مع Electroporator الموجة مربعة. الشروط التي نستخدمها هي 5 50 فولت لكل البقول دائم 100 مللي ثانية مع 50 مللي في ما بين البقوليات. وينبغي شحذ أقطاب ليبلغ قطرها 15-20 ميكرون
- الحفاظ على الأسلاك في صينية داخل أخاديد الضغط في الصلصال قبل استخدامها في electroporation
2. انشاء محطة Electroporation
- شحذ الشريط التنغستن الأقطاب 75μm إلى micromanipulators (الصكوك العالمية الدقة).
- micromanipulators مكان على جانبي المسرح مجهر تشريح (لايكا).
- توصيل الأقطاب الكهربائية إلى حماية Electroporator تحرير CUY - 21 الموج سكوير (الشكل 1).
- بدوره على electroporator وإعداد معلمات لelectroporation ، بما في ذلك الجهد ، ومدة النبضة ، وعدد من البقول. تم العثور على المعلمات الأكثر فعالية لهذه التجربة إلى ثلاثة 13 فولت لكل البقول التي استمرت لمدة 5.0ms ، مع 100ms بين كل نبضة. إذا electroporation يخلق فقاعات الهواء في الجنين ، والحد من طول النبض.
3. Microinjection من Morpholinos في الحويصلة الأذنية اسماك الزرد
- حصاد الأجنة الزرد من خزان التربية. احتضان الأجنة في جنين لرفع المتوسط بنسبة 0.3 PPM الميثيلين الأزرق (Westerfield ، 2005) على 28،5 درجة مئوية خلال الليل.
- سحب الإبر الزجاج مع مجتذب سوتر P - 97 مسرى
- الاحماء الجل agarose قاعدة (1 ٪ agarose في أسماك المياه في طبق بتري مم 10) إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي
- حرارة منخفضة بنسبة 1 ٪ نقطة ذوبان agarose (LMPA) في أسماك المياه حتى ذاب وابقائه في حمام دافئ ° 37 C المياه.
- شغل الإبرة الزجاج بمحلول morpholino (GeneTools ، كورفاليس ، OR) وقطع رأس إلى القطر المناسب. جبل حقن الإبرة في الصعود إلى micromanipulator (كن).
- قطع طرف الإبرة إلى ما يقرب من 10 ميكرومتر وتحقن الزيوت المعدنية للتأكد من أن يسمح طرف تسليم ما يكفي من حل morpholino.
- Dechorinate postfertilization أجنة في 24 ساعة (HPF) وتخدير لهم MS222 (tricaine ، سيجما) في 0.3 الماء الميثيلين PPM السمك الأزرق.
- محاذاة 3-5 أجنة تخدير على قاعدة هلام agarose مع الجانب الأيمن للحصول على تحليل موحد مريحة
- وضع 1-2 قطرات من LMPA 1 ٪ أكثر من كل جنين والسماح لترسيخ الإصلاح في مكان الجنين
- تدوير طبق بتري بحيث الحويصلة الأذنية هو على الجانب الأيمن
- مكان الإبرة في تجويف الحويصلة الأذنية وحقن محلول morpholino مع هوائي PicoPump PV820 (الآلات الدقيقة الدولي) مع دبابة النيتروجين المرفقة (الشكل 2)
4. Electroporation الداخلي
- نقل الأجنة لنصرة محطة electroporation فورا بعد الحقن
- مكان القطب الموجب على النسيج الخلفي عادل للحويصلة الأذن ، ولكن لا اختراق لا ؛ إدراج القطب السالب في الدماغ الأمامية فقط إلى الحويصلة الأذنية
- تطبيق الحالي باستخدام دواسة الأقدام أو عن طريق دفع التبديل.
- صب الماء على الأسماك وإزالة agarose أجنة من agarose مع دوامات وماصة الزجاج. توخي الحذر حتى لا نضر الأجنة. للأجنة التي من الصعب إزالتها ، واستخدام إبرة لكسر بلطف بعيدا أي LMPA المحيطة الجنين.
- أجنة مكان في اللوحة مع المياه الزرقاء الميثيلين الأسماك ورفع الأجنة إلى المراحل المطلوبة للتحليل (المورفولوجية ، المناعى ، في anlaysis التهجين ، الخ ، والمجهرية الموقع).
5. ممثل النتائج :
الشكل 1. محطة Electroporation. أدلى به أقطاب شحذ أسلاك التنجستن 75μm ومتصلة بواسطة يؤدي إلى حماية Electroporator تحرير CUY - 21 الموج سكوير. وقد سجلت هذه الأقطاب لmicromanipulators.
الشكل 2. محطة حقن. تم حقن جميع الأجنة في الأذن اليمنى لأغراض التوحيد.
تلطيخ Phalloidin الرقم 3. من شعيرات أكتين مع أجنة DPF 3. (A) وinjecte الجنين 3 DPFد MO مع سيطرة قوية من تلطيخ وphalloidin في البقعة الخلفي (بعد الظهر). (ب) وكان الجنين الذي تم حقنه بمادة MO التحكم ثم electroporated مستويات مماثلة من تلطيخ phalloidin في الظهر في أجنة الحقن فقط. (C) مع المنظمات الأعضاء لم حقن MIF في الحويصلة الأذنية وحده لا يؤدي الحد من تلطيخ phalloidin ، في حين حقن MIF جنبا إلى جنب مع المنظمات الأعضاء electroporation أدى إلى انخفاض هائل من تلطيخ phalloidin في مساء (D). صباحا ، البقعة الأمامي.
الشكل 4. Phalloidin تلون شعيرات أكتين مع يرقات DPF 5. لم يكن هناك فرق بين الحقن فقط (A) ، والحقن مع electroporation عندما تم استخدام معيار السيطرة morpholino (B). ومع ذلك ، أظهرت انخفاض اليرقات DPF 5 التي حقنوا morpholinos MIF وتلطيخ electroporated phalloidin في البقعة الخلفي (بعد الظهر) (D) ، وإن كان أقل دراماتيكية من 3 DPF ، بالمقارنة مع الجنين الذي تم حقنه بمادة morpholinos MIF فقط (C ). صباحا ، البقعة الأمامي.
الشكل 5. الأسيتيل تلطيخ تويولين الأجنة في 3 DPF. لم الجنين في الفقرة (أ) لم تتلق أي حقن أو electroporation. وكان electroporated الجنين في (B) لكنها لم تتلق الحقن. وكان كل من الأجنة تلقي الحقن وelectroporation (C ، D) مع تراجع واضح morpholinos MIF تلطيخ تويولين مقارنة بالمجموعة الضابطة. (م ، البقعة الخلفي).
الشكل 6. الأسيتيل تلطيخ تويولين الأجنة في 3 DPF مع morpholino السيطرة. (أ) أظهرت الأجنة دون أي علاج قوي تلطيخ تويولين الأسيتيل في البقعة الخلفي (الظهر) وتعصيب واسعة النطاق. (ب) مع حقن الأجنة morpholino السيطرة. (C) الأجنة تعامل مع electroporation فقط. (D) مع مراقبة الجنين morpholino التحكم وحقن electroporated ومستويات مماثلة من تويولين الأسيتيل في البقعة الخلفي وتعصيب مقارنة تحكم معاملة لا.
Discussion
قدمنا بنجاح المنظمات الأعضاء قليل النوكليوتيد العقاقير في أذن الجنين 24 الزرد HPF. والأجنة التي أثيرت بعد الحقن وelectroporation قابلة للحياة. إذا نجا من أجنة electroporation ، وأنها نمت بمعدلات طبيعية مقارنة الأجنة التي لم تتلق العلاج ، وكذلك الأجنة التي لم تحظ حقن والأجنة التي لم تحظ electroporated.
لاحظنا آثار MIF MIF والمنظمات الأعضاء تشبه الأذن وبعد الحقن عن طريق وضع العلامات electroporation مع phalloidin وتويولين الأسيتيل. Phalloidin تلون شعيرات الأكتين في الخلايا الحسية من الشعر البقعة الخلفية يشير إلى أن من electroporation MIF MIF ومثل MO في المرحلة ال 24 HPF تسبب تغيرات في الخلية الشعر و / أو أرقام أهداب ساكنة عند مقارنة الأجنة التي حقنت فقط مع المنظمات الأعضاء (الشكل 3). هذا الانخفاض في عدد خلايا الشعر ويتسق مع نتائج شين وآخرون (المقدمة) أن المنظمات الأعضاء في MIF MIF وشبيهة تؤدي إلى انخفاض في عدد خلايا الشعر في البقعة الكييس. قد تناقص أعداد الخلايا الشعر في الأجنة التي حقنوا المنظمات الأعضاء وelectroporated تثبت أن electroporation مساعدة في تحريك المنظمات الأعضاء عبر غشاء الخلية ، وبالتالي زيادة حجم التأثيرات المورفولوجية بالمقارنة إلى الأجنة التي تم حقن فقط الحويصلة الأذنية. وقد لوحظت تغييرات في التشكل من خلال تلطيخ العقدة statoacoustic تويولين الأسيتيل. وقد تأثر حجم تعصيب من العقدة statoacoustic ، والأجنة التي تم حقنها وelectroporated تظهر انخفاض المتفرعة من neurites (الشكل 5). قد يكون هناك أيضا انخفاض التكثيف من الخلايا العقدية و / أو انخفاض عدد خلايا العقدة ، وذلك لأن انخفاض كبير في تلطيخ تويولين الأسيتيل في الأجنة التي كانت على حد سواء وحقن electroporated. لأنه قد ثبت لMIF ستكون حاسمة لتطوير النظام العصبي (سوزوكي وآخرون ، 2004) ، قد شهدت تغييرات بعد electroporation يكون نتيجة لزيادة ترنسفكأيشن من MIF MIF والشبيهة. MO حل في الخلايا neuroblast
Electroporation بنسبة ضئيلة من morpholinos العقاقير مباشرة في الأنسجة النامية هو أداة مفيدة للسيطرة على التعبير عن الجينات أثناء تطور الأنسجة ، سواء مكانيا وزمانيا ، في جنين. نتج من Electroporation MIF MIF ومثل المنظمات الأعضاء في أنسجة الأذن الداخلية في التشكل غير طبيعية من البقعة الخلفية على حد سواء ، والعقدة statoacoustic. كان هناك انخفاض في عدد خلايا الشعر الحسية في البقعة الخلفي في الأجنة التي تم حقنها في وelectroporated مقارنة مع الأجنة التي لم يتلق أي علاج ، أو الأجنة التي إما تم حقنه فقط أو electroporated فقط. كان هناك أيضا انخفاض في درجة التعصيب من تصحيح الحسي الخلفي من العقدة statoacoustic وحجم SAG. Electroporation هي طريقة قيمة لtransfecting الجزيئات في أنسجة معينة ، مع الاستفادة من رصد الآثار الأولية لهذا الحمض النووي وجه الخصوص ، RNA ، أو MO في النسيج المطلوب ، وتميز هذه من آثار ثانوية على الأنسجة الأخرى ، بما في ذلك المخ ، والعرف العصبي المحيطة بالأذن اللحمة المتوسطة في التنمية الأذن الداخلية (Barald وكيلي ، 2004).
Disclosures
وقد رعت انتاج المقالة أدوات الجينات ، LLC الذين ينتجون الكواشف المذكورة في الفيديو والنص.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة أبحاث الصمم إلى S YC وجبهة الخلاص الوطني في (IOS 0930096) لKFB.
KFB : المعاهد الوطنية للصحة / 2 NINDCD RO1 DC04184 ، 3R01DC004184 - 08W1 NSF ، DBI 0832862 ، 0930096 NSF IOS
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sutter P-97 electrode puller | Equipment | |||
| PV820 Pneumatic PicoPump | Equipment | World Precision Instruments, Inc. | ||
| M3301L Manual Micromanipulator | Equipment | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Leica S6D stereomicroscope | Equipment | |||
| Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator | Equipment | |||
| Olympus FV500 confocal microscope | Equipment | |||
| 0.01 inch Platinum Wire | Supply | A-M Systems | 711000 | |
| Shrink Tubing | Supply | Newark Inc | 03F3172 | |
| Socket Crimp Terminal | Supply | Digi-Key | 82PECT-ND | |
| Capillaries | Supply | Stoelting Co. | 50613 | |
| Modeling clay | Supply | |||
| Plastic 100 mm Petri dishes | Supply | Falcon BD | ||
| 6 well plastic plates | Supply | Falcon BD | ||
|
||||
References
- Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).
- Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development. J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).
- Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. From placode to polarization: new tunes in inner ear development. Development. 131, 4119-4135 (2004).
