Summary
在24hpf的斑马鱼otocyst morpholinos直接传递到一个方法来已经研制成功。管腔奥迪的囊泡和电的影响渗透到使用morpholinos显微注射，我们能够绕过morpholinos对大脑的影响，并获得具体到内耳的影响。
Abstract
近年来，电已成为一个流行的技术，在体内DNA，RNA和morpholinos的转成各种组织，包括斑马鱼眼，脑，体节。电超过其他的基因操纵方法的优点是，特定的组织，可以有针对性的，在空间和时间的大分子通过引入电流的应用，。在这里，我们描述了使用电穿孔转染发展的斑马鱼的内耳组织中的 MIF和MIF像morpholinos。在过去的研究中，MIF啉注射到胚胎在1 - 8 -细胞期，在广泛的形态学变化，在神经系统和眼睛，以及耳朵。针对内耳组织在开发的后期阶段，我们可以判断在发展中国家内耳MIF的主要作用，而不是次要的影响，可能会导致其他组织的影响。通过使用鬼笔环肽和乙酰化的微管蛋白染色，研究神经元，神经元突起，和毛细胞后黄斑的形态，我们能够在斑马鱼的内耳有针对性的转染的方法，以评估电穿孔的疗效。奥迪囊泡24hpf胚胎注射morpholinos和电穿孔和当时相比，已经收到任何治疗或只已注射或电穿孔胚胎。注射和电穿孔胚胎表明在毛细胞数目减少，降低statoacoustic节（SAG）和更少的凹陷与对照组相比，神经元的神经支配。我们的研究结果表明，在稍后阶段otocysts morpholinos直接传递到避免非特异性的神经系统和神经嵴的影响，在1-8细胞阶段交付morpholinos。它还允许考试定向到内耳和耳朵上的大脑，神经嵴或periotic间质细胞的主要作用不是二次效应的影响。
Protocol
1。为电穿孔电极
- 剪下适当长度的直径为75微米的钨丝（AM系统公司Carlsborg，WA）（约3-5厘米）
- 将通过电缆莫仕连接器（针加盖黄铜）的钨丝
- 余音钨丝和Molex公司热缩管（SPC技术，芝加哥，IL）和适用于本生灯或热枪热密封萎缩管电线电缆连接器
- 为了加强钨丝尖端，电线浸入1.0 1N氢氧化钠（康拉德等，1993），使用文件夹作为另一个电极，电解线与方波Electroporator的。我们使用的条件是5个50伏的脉冲每期100毫秒和50毫秒脉冲之间。电极应加强以一个直径15-20微米
- 请在一个托盘内的电线，压成泥，在使用前在电的沟槽
2。设置电穿孔站
- 磁带削尖75μm的钨电极micromanipulators（世界精密仪器）。
- 在解剖显微镜阶段（徕卡）两侧的广场micromanipulators。
- 连接电极保护CUY - 21编辑方波Electroporator（图1）。
- 打开electroporator设立电参数，包括电压，脉冲宽度和脉冲数。被发现三个13伏的脉冲持续时间为5.0ms，100ms的每个脉冲之间，这个实验的最有效的参数。如果电在胚胎创建气泡，降低脉冲的长度。
3。 Morpholinos显微注射到斑马鱼奥迪囊泡
- 从养殖池的收获斑马鱼的胚胎。在胚胎胚胎孵育中期提高0.3 PPM的亚甲蓝（韦斯特，2005年）在28.5 ° C过夜。
- 与萨特的P - 97电极拉马拉玻璃针
- 热身琼脂糖凝胶基地（鱼水的1％琼脂糖凝胶在10毫米培养皿）至37 ° C水浴中
- 烧热1％的低熔点琼脂糖（LMPA）鱼水，直到融化，并保持在37℃水浴保温。
- 填写与吗啉溶液（GeneTools，科瓦利斯，或）玻璃针和削减适当直径的尖端。装载到一个显微（库恩）的注射针头。
- 切约10微米的针尖注入矿物油，以确保针尖允许足够吗啉的解决方案交付。
- Dechorinate胚胎在受精后24小时（HPF）和麻醉MS222（tricaine，Sigma公司），在0.3 PPM的亚甲蓝鱼水。
- 琼脂糖凝胶基地，为方便统一的分析与右侧对齐到3至5麻醉胚胎
- 在每个胚胎中放置1至2滴1％LMPA，让固化修复的胚胎
- 旋转的培养皿中，使奥迪囊泡右侧
- 针放入奥迪囊泡腔注入啉的解决方案与PV820气动PicoPump（世界精密仪器），一个附加的氮气罐（图2）
4。电穿孔程序
- 将安装的电车站后，立即注射胚胎
- 放置到组织后的奥迪囊泡的正极，但不穿透;负电极插入大脑前奥迪囊泡
- 应用目前使用脚踏开关或按下一个开关。
- 琼脂糖倒入鱼水和删除从琼脂糖纷飞和玻璃吸管的胚胎。使用谨慎不破坏胚胎。对于难以去除的胚胎，用针轻轻地打破任何LMPA周围的胚胎。
- 在一盘与亚甲基蓝鱼水和提高胚胎所需的分析阶段（形态学，免疫组化，原位杂交等和微观anlaysis，）的地点胚胎。
5。代表性的成果：
图1电穿孔站。用削尖的75μm的钨丝电极，通过导线连接到保护CUY - 21编辑方波Electroporator。这些电极贴在micromanipulators。
图2。注水站。所有胚胎注入右耳为达到标准化的目的。
图3。鬼笔环肽染色与3 DPF胚胎微丝。 （一）3 DPF胚胎injecteD与控制莫有强烈的鬼笔环肽染色后的黄斑部（分）。 （二）与对照MO，然后注射电穿孔的胚胎在鬼笔环肽染色时，只注射胚胎相似的水平。 （三）与MIF MOS注入仅奥迪囊泡没有引起减少的鬼笔环肽染色，而随着电MIF MOS注射引起的鬼笔环肽染色时（四）显着减少。上午，前黄斑。
图4。鬼笔环肽染色5 DPF幼虫微丝。没有注射之间的区别只（A）和注射用电击时的标准控制啉（二）。然而，与MIF morpholinos和电穿孔注射5 DPF幼虫呈减少的鬼笔环肽染色后的黄斑部（分）（四），虽然低于3 DPF戏剧性，当与MIF morpholinos（比特彗星注入胚胎相比）。上午，前黄斑。
图5。乙酰化微管蛋白染色胚胎3 DPF。胚胎（一）未收到任何注射或电击。电穿孔（二）的胚胎，但没有收到任何注射。接受注射和电（C，D）与MIF morpholinos的胚胎微管蛋白染色明显减少，与对照组相比。 （时，后黄斑区）。
图6。乙酰化微管蛋白染色胚胎与控制啉DPF 3。 （一）未经任何处理的胚胎表现出较强的乙酰化微管蛋白染色后的黄斑部（分）和广泛的支配。 （二）控制啉注射胚胎。 （三）处理与胚胎电只。 （四）控制与控制啉胚胎注射和电穿孔后黄斑和支配的类似乙酰化微管蛋白的水平相比，没有治疗控制。
Discussion
我们已成功引入24 HPF斑马鱼胚胎的耳反义寡核苷酸分子轨道。后注射和电提出的胚胎是可行的。如果胚胎存活的电，他们在正常税率的增长相比，收到了没有治疗，以及只有被注射，只有被电穿孔胚胎的胚胎的胚胎。
我们观察到耳后注射和电MIF和MIF - MOS的影响，通过与鬼笔环肽和乙酰化的微管蛋白标签。鬼笔环肽染色后黄斑的感觉毛细胞的微丝表示，造成毛细胞和/或纤毛数字的变化，与MOS只注射的胚胎相比，MIF和MIF - 24 - HPF阶段MO电（图3）。这在毛细胞数目的减少是与Shen 等人的研究结果是一致的。（提交），MOS MIF和MIF导致毛细胞数量减少囊状黄斑。在MOS和电穿孔注射证明，电胚胎毛细胞数量减少，可能有助于在移动马鞍山穿过细胞膜，从而增加相比，奥迪囊泡只有注射的胚胎形态的影响程度。通过乙酰化微管蛋白染色中的statoacoustic神经节的形态变化进行观察。由statoacoustic神经节的神经支配程度受到影响，胚胎被注射，电穿孔显示下降的突起（图5）分支。也有可能减少凝结的神经节细胞和/或神经节细胞的数目下降，因为乙酰化微管蛋白染色的显着下降均注射和电穿孔胚胎。由于MIF已被证明是神经系统发育（Suzuki 等，2004）的关键，电后看到的变化可能增加转染的MIF和 MIF像莫入解决的神经母细胞细胞。
电穿孔直接进入一个发展中的组织的反义寡核苷酸morpholinos是一个有用的工具，为控制基因在胚胎期间该组织的发展，在空间和时间，的表达。 MIF和MIF般进入内耳组织的MO电穿孔后黄斑statoacoustic节的形态异常。有一个在的感觉毛细胞的胚胎被注入了，并已经收到了只注射或只电穿孔的胚胎不治疗或胚胎相比，电穿孔后黄斑的数量减少。还有一个statoacoustic节和凹陷的大小后的感觉补丁的支配程度的下降。电穿孔是一种大分子转成特定的组织与观察所需的组织特定的DNA和RNA，或MO的主要影响，并从其他组织的二次效应这些歧视，包括大脑，神经嵴和利益，有价值的方法内耳的发展periotic间质（Barald和凯利，2004年）。
Disclosures
基因工具，有限责任公司生产视频和文字中提到的试剂条生产赞助。
Acknowledgments
这项工作是从耳聋研究基金会Yc进行S和美国国家科学基金会（内部监督办公室0930096）的拨款，以KFB支持。
KFB：美国国立卫生研究院/ NINDCD 2 RO1 DC04184， 3R01DC004184 - 08W1 ，NSF DBI 0832862，美国国家科学基金会IOS 0930096
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sutter P-97 electrode puller | Equipment | |||
| PV820 Pneumatic PicoPump | Equipment | World Precision Instruments, Inc. | ||
| M3301L Manual Micromanipulator | Equipment | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Leica S6D stereomicroscope | Equipment | |||
| Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator | Equipment | |||
| Olympus FV500 confocal microscope | Equipment | |||
| 0.01 inch Platinum Wire | Supply | A-M Systems | 711000 | |
| Shrink Tubing | Supply | Newark Inc | 03F3172 | |
| Socket Crimp Terminal | Supply | Digi-Key | 82PECT-ND | |
| Capillaries | Supply | Stoelting Co. | 50613 | |
| Modeling clay | Supply | |||
| Plastic 100 mm Petri dishes | Supply | Falcon BD | ||
| 6 well plastic plates | Supply | Falcon BD | ||
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References
- Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).
- Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development. J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).
- Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. From placode to polarization: new tunes in inner ear development. Development. 131, 4119-4135 (2004).
