Direkte Lieferung von MIF Morpholinos Into the Zebrafisch Otocyst durch Injektion und Elektroporation Beeinflusst Inner Ear Entwicklung

Summary

Eine Methode, um Morpholinos direkt liefern in der Zebrafisch otocyst bei 24hpf entwickelt worden. Mit Mikroinjektion von Morpholinos in das Lumen des otic Vesikel und Elektroporation, um das Eindringen Effekt, konnten wir die Wirkung von Morpholinos auf das Gehirn zu umgehen und erhalten Wirkungen, die spezifisch an das Innenohr.

Abstract

In den letzten Jahren hat Elektroporation zu einer beliebten Methode zur in-vivo-Transfektion von DNA, RNA und Morpholinos in verschiedenen Geweben, einschließlich der Augen, des Gehirns und Somiten der Zebrafisch. Der Vorteil der Elektroporation gegenüber anderen Methoden der genetischen Manipulation ist, dass bestimmte Gewebe gezielt können, sowohl räumlich als auch zeitlich, denn die Einführung von Makromolekülen durch die Anwendung von elektrischem Strom. Hier beschreiben wir den Einsatz der Elektroporation zur Transfektion von MIF und MIF-like Morpholinos in das Gewebe des sich entwickelnden Innenohr des Zebrafisch. In früheren Studien, mif Morpholino in Embryonen im 1 eingespritzt - bis 8-Zell-Stadium führte zu weit verbreiteten morphologischen Veränderungen im Nervensystem und Auge sowie das Ohr. Durch die Ausrichtung der Gewebe des Innenohrs in späteren Phasen in der Entwicklung, können wir die primären Auswirkungen von MIF in den Entwicklungsländern Innenohr zu bestimmen, um sekundäre Effekte, die sich aus dem Einfluss von anderen Geweben führen kann entgegengesetzt. Durch die Verwendung von Phalloidin und acetyliertes Tubulin-Färbung, um die Morphologie von Neuronen, neuronale Prozesse und Haarzellen mit der hinteren Makula verbunden Studie konnten wir die Wirksamkeit der Elektroporation als Methode zur gezielten Transfektion in der Zebrafisch Innenohr zu beurteilen. Die otic Vesikel 24hpf Embryonen wurden mit Morpholinos und elektroporiert injiziert und wurden dann zu Embryonen, die keine Behandlung erhalten hatten oder bisher nur gespritzt oder elektroporiert verglichen. Embryonen, die injiziert und wurden elektroporiert zeigten eine Abnahme der Haarzelle Zahlen, verringerte Innervation durch die statoacoustic Ganglion (SAG) und weniger SAG Neuronen im Vergleich mit Kontrollgruppen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die direkte Lieferung von Morpholinos in otocysts in späteren Stadien der unspezifischen Nervensystem und Neuralleiste Auswirkungen Morpholinos am 1-8 Zell-Stadium geliefert vermeidet. Darüber hinaus ermöglicht die Untersuchung von Effekten, die an das Innenohr und nicht sekundäre Effekte auf das Ohr von primären Auswirkungen auf das Gehirn, Neuralleiste oder periotischen Mesenchym gerichtet sind.

Protocol

1. Herstellung von Elektroden für die Elektroporation

1. Cut 75 um Durchmesser Wolframdraht (AM Systems, Inc. Carlsborg, WA) von geeigneter Länge (ca. 3-5 cm)
2. Put Wolframdraht durch Molex Stecker (Pin gestempelt Messing)
3. Wrap Wolframdrähten und Molex Stecker mit Schrumpfschlauch (SPC Technology, Chicago, IL) und erwärmt mit Bunsenbrenner oder Heißluftpistole zum Schrumpfen Schlauch an den Drahtplombe
4. Zum Schärfen der Spitze der Wolfram-Draht-, Tauch-den Draht in 1,0 N Natriumhydroxid (Conrad et al. 1993) und mit Hilfe einer Büroklammer als die andere Elektrode, Elektrolyse der Draht mit einer Rechteck Electroporator. Die Bedingungen, die wir benutzen sind 5 50-Volt Impulse einer Dauer von jeweils 100 ms mit 50 ms in zwischen den Impulsen. Die Elektroden sollten zu einem Durchmesser von 15-20 um geschärft werden
5. Halten Sie die Drähte in einem Fach in Nuten in Modelliermasse vor in Elektroporation verwenden gedrückt

2. Set Up Elektroporation Bahnhof

1. Band geschärft 75 um Wolfram Elektroden Mikromanipulatoren (World Precision Instruments).
2. Legen Sie Mikromanipulatoren auf beiden Seiten des Präpariermikroskop Stufe (Leica).
3. Verbinden Sie die Elektroden mit einem Protect CUY-21 Bearbeiten Square Wave Electroporator (Abbildung 1).
4. Schalten Sie den Elektroporator und SET UP-Parameter für die Elektroporation, einschließlich Spannung, Pulsdauer und die Anzahl der Impulse. Die effektivste Parameter für dieses Experiment wurde festgestellt, dass drei 13-Volt-Impulse, die jeweils für 5.0ms dauerte, mit 100ms zwischen jedem Puls werden. Wenn Elektroporation erzeugt Luftblasen im Embryo, reduzieren Sie die Impulslänge.

3. Mikroinjektion von Morpholinos in Zebrafische Otic Vesicle

1. Ernte Zebrafischembryonen aus einem Aufzuchtbecken. Inkubieren Sie die Embryonen in Embryo-raising-Medium mit 0,3 ppm Methylenblau (Westerfield, 2005) bei 28,5 ° C über Nacht.
2. Pull Glasnadeln mit einem Sutter P-97-Elektrode puller
3. Warm up ein Agarosegel Basis (1% Agarose in Fisch Wasser in einer 10 mm Petrischale) auf 37 ° C im Wasserbad
4. Heat 1% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt (LMPA) in Fisch Wasser, bis sie geschmolzen und warm halten in der 37 ° C Wasserbad.
5. Füllen Sie ein Glas Nadel mit einem Morpholino-Lösung (GeneTools, Corvallis, OR) und schneiden Sie die Spitze zu entsprechenden Durchmesser. Montieren Sie die Injektionsnadel auf einem Mikromanipulator (Kuhn).
6. Cut Nadelspitze zu etwa 10 um und injizieren in Mineralöl, um sicherzustellen, dass die Spitze reicht Lieferung von Morpholino-Lösung ermöglicht.
7. Dechorinate Embryonen nach 24 Stunden der Befruchtung (HPF) und betäuben sie mit MS222 (Tricaine, Sigma) in 0,3 ppm Methylenblau Fisch Wasser.
8. Richten Sie 3 bis 5 betäubt Embryonen auf das Agarosegel Basis mit der rechten Seite bis zur komfortablen einheitliche Analyse
9. Setzen Sie 1 bis 2 Tropfen 1% LMPA über jeden Embryo und lassen Sie sich verfestigen, um den Embryo zu fixieren
10. Drehen Sie die Petrischale, so dass die otic Vesikel ist auf der rechten Seite
11. Setzen Sie die Nadel in das Lumen des otic Vesikel und injizieren Sie die Morpholino-Lösung mit einem PV820 Pneumatische PicoPump (World Precision Instruments) mit einer angehängten Stickstofftank (Abbildung 2)

4. Elektroporation Procedure

1. Bewegen Sie den montierten Embryonen in die Elektroporation Station unmittelbar nach der Injektion
2. Legen Sie die positive Elektrode auf das Gewebe direkt hinter dem Ohr-Vesikel, aber nicht durchdringen; legen Sie die negative Elektrode in das Gehirn unmittelbar vor dem otic Vesikel
3. Wenden Sie muss mit einem Fußpedal oder durch Drücken eines Schalters.
4. Gießen Fisch Wasser auf Agarose und entfernen Embryonen aus Agarose mit wirbelnden und einer Glaspipette. Seien Sie vorsichtig, nicht auf die Embryonen Schaden. Bei Embryonen, die nur schwer zu entfernen sind, mit einer Nadel vorsichtig brechen alle LMPA Umgebung des Embryos.
5. Legen Embryonen in einem Teller mit Methylenblau Fisch Wasser und erhöhen die Embryonen zu wünschen Stadien für die Analyse (morphologische, immunhistochemische, in-situ-Hybridisierung, etc und mikroskopische anlaysis).

5. Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1. Elektroporation Station. Elektroden wurden mit geschärften 75 Mikrometern Wolframdrähte und verbunden durch führt zu einer Protect CUY-21 Bearbeiten Square Wave Electroporator. Diese Elektroden wurden Mikromanipulatoren abgeklebt.

Abbildung 2. Injection-Station. Alle Embryonen wurden in das rechte Ohr für die Standardisierung Zwecke injiziert.

Abbildung 3. Phalloidin-Färbung von Aktin-Filamenten mit 3 dpf Embryonen. (A) Die 3 dpf Embryo injected mit Kontroll-MO hat eine starke Färbung von Phalloidin in der hinteren Makula (pm). (B) Der Embryo, die mit Kontroll-MO injiziert wurde und dann elektroporiert hatte ähnliches Niveau Phalloidin-Färbung in pm in der Injektion nur Embryonen. (C) Injektion mit mif MOs in die otic Vesikel allein nicht die Ursache für Reduzierung der Phalloidin-Färbung, während die Injektion von mif MOs zusammen mit Elektroporation führte zu einer dramatischen Reduzierung der Phalloidin-Färbung in der Uhr (D). bin, anterior Makula.

Abbildung 4. Phalloidin-Färbung von Aktin-Filamenten mit 5 dpf Larven. Es gab keinen Unterschied zwischen Injektion nur (A) und Injektion mit Elektroporation, wenn die Standard-Steuerung Morpholino verwendet wurde (B). Jedoch zeigte die 5 dpf Larven, die mit mif Morpholinos und elektroporiert injiziert wurden Phalloidin-Färbung in der hinteren Makula (pm) (D), wenn auch weniger dramatisch als 3 dpf, wenn sie mit dem Embryo, der mit mif Morpholinos nur (C injiziert wurde im Vergleich reduziert ). bin, anterior Makula.

Abbildung 5. Acetylierte Tubulin-Färbung von Embryonen bei 3 dpf. Der Embryo in (A) erhielten keine Injektion oder Elektroporation. Der Embryo in (B) wurde durch Elektroporation, erhielt aber keine Injektion. Embryonen erhalten sowohl der Injektion und Elektroporation (C, D) mit mif Morpholinos hatte sichtlich abgenommen Tubulin-Färbung im Vergleich zur Kontrollgruppe. (Pm, posterior Makula).

Abbildung 6. Acetylierte Tubulin-Färbung von Embryonen bei 3 dpf mit Kontroll-Morpholino. (A) Embryo ohne Behandlung zeigte eine starke acetyliertes Tubulin-Färbung in der hinteren Makula (pm) und umfangreiche Innervation. (B) Embryo mit Kontroll-Morpholino injiziert. (C) Embryo mit Elektroporation nur behandelt. (D) Control Embryo mit Kontrolle Morpholino injiziert und Elektroporation hat ähnliche Ebenen der acetylierten Tubulin in den hinteren Makula und Innervation im Vergleich zu den nicht behandelten Kontrollgruppe.

Discussion

Wir haben erfolgreich Antisense-Oligonukleotid MOs in das Ohr des 24 hpf Zebrafischembryo eingeführt. Embryonen, die nach der Injektion und Elektroporation erhöht wurden lebensfähig. Wenn die Embryonen überlebten die Elektroporation, wuchsen sie zu normalen Tarifen im Vergleich zu Embryonen, die keine Behandlung, sowie Embryonen, die nur injiziert worden war und Embryonen, die erst seit elektroporiert erhalten hatte.

Wir beobachteten die Wirkung von MIF und MIF-like MOs nach Ohr Injektion und Elektroporation durch die Kennzeichnung mit Phalloidin und acetyliertes Tubulin. Phalloidin-Färbung von Aktin-Filamenten in sensorischen Haarzellen des hinteren Makula zeigt an, dass die Elektroporation von MIF und MIF-like MO an der 24-hpf Bühne verursacht Veränderungen in Haarzellen und / oder Stereozilien Zahlen, wenn Embryonen, die nur mit der MOs injiziert wurden im Vergleich (Abbildung 3). Dieser Rückgang in Haarzellen Zahlen stimmen mit den Ergebnissen von Shen et al. (Submitted), die MOs zu mif und mif-wie eine Reduzierung der Anzahl der Haarzellen in der sackförmigen Makula verursachen. Der Rückgang der Haare Zellzahlen in Embryonen, die mit MOs und elektroporiert injiziert wurden zeigen, dass der Elektroporation kann bei der Bewegung der MOs durch die Zellmembran Hilfe, wodurch das Ausmaß der morphologischen Auswirkungen bei Embryonen, in denen die otic Vesikel nur injiziert wurde verglichen. Änderungen in der Morphologie der statoacoustic Ganglion wurden durch acetyliertes Tubulin-Färbung beobachtet. Das Ausmaß der Innervation durch die statoacoustic ganglion betroffen war, als Embryonen, die injiziert und wurden elektroporiert zeigen verringerte Verzweigung der Neuriten (Abbildung 5). Es kann auch Kondensation der Ganglienzellen und / oder eine verringerte Zahl von Ganglienzellen verringert werden, weil die acetylierten Tubulin-Färbung ist deutlich in Embryonen, die sowohl injiziert wurden und Elektroporation verringert. Da mif gezeigt worden ist, kritisch zu sein für die Entwicklung des Nervensystems (Suzuki et al., 2004), können die Änderungen nach der Elektroporation gesehen das Ergebnis der erhöhten Transfektion der mif und mif-like MO-Lösung in den Neuroblasten Zellen werden.

Elektroporation von Antisense-Oligo Morpholinos direkt in ein Entwicklungsland Gewebe ist ein nützliches Werkzeug für die Steuerung der Expression eines Gens in das Gewebe der Entwicklung, sowohl räumlich als auch zeitlich, in den Embryo. Elektroporation von MIF und MIF-like MOs in das Gewebe des Innenohrs ergab anormale Morphologie der beiden hinteren Makula und die statoacoustic Ganglion. Es wurde eine Reduktion in der Anzahl der Haarzellen in der hinteren Makula in Embryonen, die injiziert worden war und im Vergleich mit Embryonen, die keine Behandlung erhalten hatten oder mit Embryonen, die entweder war nur gespritzt oder nur elektroporiert elektroporiert. Es gab auch eine Abnahme der Grad der Innervation der hinteren sensorischen Patch von der statoacoustic Ganglion und die Größe der SAG. Elektroporation ist eine wertvolle Methode zur Transfektion von Makromolekülen in bestimmten Geweben, mit dem Vorteil der Beobachtung der primären Auswirkungen des jeweiligen DNA, RNA, oder MO in das gewünschte Gewebe und diskriminierende diese von Nebenwirkungen auf andere Gewebe einschließlich des Gehirns, Neuralleiste und periotischen Mesenchym am Innenohr Entwicklung (Barald und Kelley, 2004).

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Sutter P-97 electrode puller	Equipment
PV820 Pneumatic PicoPump	Equipment	World Precision Instruments, Inc.
M3301L Manual Micromanipulator	Equipment	World Precision Instruments, Inc.
Leica S6D stereomicroscope	Equipment
Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator	Equipment
Olympus FV500 confocal microscope	Equipment
0.01 inch Platinum Wire	Supply	A-M Systems	711000
Shrink Tubing	Supply	Newark Inc	03F3172
Socket Crimp Terminal	Supply	Digi-Key	82PECT-ND
Capillaries	Supply	Stoelting Co.	50613
Modeling clay	Supply
Plastic 100 mm Petri dishes	Supply	Falcon BD
6 well plastic plates	Supply	Falcon BD
MOs: 0.3 mM of a combination of for mif, mif-like MO1, and mif-like MO2 was used. Mif MO is complimentary to the start codon of zebrafish mif mRNA: 5’-acatcggcatgactgcgacagagat-3’. Two MOs were used for mif-like. mif-like MO1 is complimentary to the translational start site: 5’-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3’, while mif-like MO2 derived from AS sequence at the intron1/exon 2 boundary: 5’-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC-3’. Control MO was the scrambled nucleotide sequence from Gene Tools: 5’-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA- 3’. methylene blue (0.3 ppm) in fish water MS222 (tricaine, Sigma; 0.64 mM in fish water) Low-melting point agarose (LMPA; Roche) phenol red (Sigma) Anti-acetylated tubulin (Sigma) Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse second antibody (Molecular probes) Texas red-phalloidin (Molecular probes)