Summary
24hpfでゼブラフィッシュの耳胞に直接モルフォを提供する方法が開発されている。耳胞と浸透をもたらすためにエレクトロポレーションの内腔にモルフォのマイクロインジェクションを使用して、我々は脳にモルフォのエフェクトをバイパスし、内耳に固有の効果を得ることができた。
Abstract
近年では、エレクトロポレーションは、眼、脳、およびゼブラフィッシュの体節を含む様々な組織、へのDNA、RNA、およびモルフォの in vivoトランスフェクションのための一般的な手法となっている。遺伝子操作の他の方法に比べてエレクトロポレーションの利点は、特定の組織が電流のアプリケーションによる巨大分子の導入のために、両方の空間的及び時間的に、対象とすることができるということです。ここでは、ゼブラフィッシュの開発内耳の組織にMIFとMIFのようなモルフォをトランスフェクトするためのエレクトロポレーションの使用について説明します。過去の研究では、1から胚に注入MIFモルホリノ- 8細胞期には、広範な形態学的神経系や眼の変化だけでなく、耳をもたらした。開発の後期段階で内耳の組織を標的とすることで、我々は他の組織の影響に起因する二次的効果とは対照的に、発展途上内耳でMIFの主要な効果を決定することができます。後黄斑に関連する神経細胞、神経細胞のプロセス、および毛の細胞の形態を調べるために染色ファロイジンとアセチル化チューブリンを使用することによって、我々はゼブラフィッシュ内耳における標的トランスフェクションのための方法として、エレクトロポレーションの有効性を評価することができた。 24hpf胚の耳小胞は、モルフォとエレクトロポレーションを注射し、その後も治療を受けておらず、または唯一の注入またはエレクトロポレーションされていた胚と比較した。注入とエレクトロポレーションした胚は、有毛細胞数の減少を示したstatoacoustic神経節（SAG）と対照群と比較して少ないSAGのニューロンによる神経支配の減少となりました。我々の結果は、後の段階でotocystsにモルフォの直接配信は、非特異的な神経系1〜8細胞期で配信モルフォの神経堤の影響を回避することを示した。また、脳、神経堤や耳周囲の間充織での主な影響から耳上の二次的な影響を内耳に向けとされていない効果の検討が可能になります。
Protocol
1。エレクトロポレーション用電極の作成
- 適当な長さの75ミクロン径のタングステンワイヤーを（AMシステムズ社Carlsborg、ワシントン州）（約3〜5センチ）カット
- モレックスケーブルコネクタ（ピンスタンプ真鍮）を介してタングステンワイヤーを置いて下さい
- ワイヤーに縮小チューブを密封するためにタングステンワイヤと収縮チューブ付きモレックスケーブルコネクタ（SPC技術、シカゴ、IL）をラップし、ブンゼンのバーナーやヒートガンで熱を適用する
- タングステン線の先端をシャープにする、1.0 N水酸化ナトリウムにワイヤーを浸し（コンラッドら、1993）と、他方の電極としてのペーパークリップを使用して、方形波のエレクトロでワイヤーを電解する。我々が使用する条件は、パルス間で50ミリとそれぞれ持続100 msの5ボルトのパルスである。電極には、15〜20ミクロンの直径にシャープされるべきである
- エレクトロポレーションに使用する前に粘土に押された溝内のトレイに配線してください
2。エレクトロステーションの設定
- テープはマイクロマニピュレータ（世界の精密機器）に75μmのタングステン電極を削った。
- 解剖顕微鏡のステージ（ライカ）の両側に配置マニピュレーター。
- プロテクトCUY - 21 [編集]矩形波エレクトロ（図1）に電極を接続してください。
- エレクトロの電源を入れ、電圧、パルス持続時間、及びパルス数を含む、エレクトロポレーションのパラメータを、設定します。この実験のための最も効果的なパラメータは、それぞれがそれぞれのパルス間で100ミリ秒で、5.0ms続いたthree 13ボルトのパルスであることがわかった。エレクトロポレーションは、胚中の気泡を作成する場合、パルスの長さを減らす。
3。ゼブラフィッシュ耳胞イントゥモルフォのマイクロインジェクション
- 繁殖タンクから収穫のゼブラフィッシュ胚。で胚をインキュベート胚啓発℃で一晩28.5で0.3 PPMメチレンブルー（ウェスター、2005）で培地を。
- サターP - 97電極プラーとガラス針を引っ張る
- ℃の水浴中で37にアガロースゲル基剤（10mMのペトリ皿に魚の水中の1％アガロース）をウォームアップ
- 溶融までの魚の水の熱を1％低融点アガロース（LMPA）と37℃の水浴中で、冷えないように保管してください。
- モルホリノソリューション（GeneTools、コーバリス、OR）とガラスの針を記入し、適切な直径の先端をカット。マイクロマニピュレータ（クーン）に注射針をマウントします。
- 約10μmの針の先端をカットし、先端がモルホリノソリューションの十分な配信を可能にすることを保証するためにミネラルオイルに注入する。
- 24時間のpostfertilization（HPF）で胚をDechorinate、0.3 PPMのメチレンブルー魚の水にMS222（tricaine、シグマ）でそれらを麻酔。
- 便利な均一な分析のための右側面を上にしてアガロースゲルベースの上に3〜5麻酔胚の位置を合わせます
- それぞれの胚を介して1％LMPAの1〜2滴を入れ、所定の場所に胚を固定するために固めることができます
- 耳胞が右側になるようにペトリ皿を回転させる
- 耳胞の内腔に針を置き、添付の窒素タンク（図2）でPV820空気圧PicoPump（世界の精密機器）とモルホリノソリューションを注入する
4。エレクトロポレーションの手順
- すぐに注入した後、エレクトロポレーションステーションに取り付けられた胚を移動する
- 耳胞へのちょうど後方組織への正極を置きますが、浸透しない;耳胞にちょうど前脳に負極を挿入する
- フットペダルを使用するか、スイッチを押すことにより電流を適用する。
- アガロースの魚の水を注ぎ、旋回とガラスピペットでアガロースから胚を削除します。胚を傷つけないように、注意してください。除去が困難な胚の場合は、軽く胚を取り巻くあらゆるLMPAを脱却するために針を使用。
- 場所は、メチレンブルーの魚 の水でプレートの胚および分析のための必要な段階（in situハイブリダイゼーション、etcと微視的anlaysis で 、免疫組織化学的、形態学的）に胚を発生させます。
5。代表的な結果：
図1エレクトロステーション。電極は、シャープ75μmのタングステン線を使用して行われ保護CUY - 21 [編集]矩形波エレクトロにリード線で接続されていました。これらの電極は、マイクロマニピュレータにテープで固定されました。
図2。注入ステーション。すべての胚は、標準化の目的のために右耳に注入した。
図3 3 DPFの胚とアクチンフィラメントのファロイジン染色。 （A）3 DPFの胚injecte制御MOとdは後部黄斑（PM）のファロイジンの強い染色を持っています。 （B）コントロールMOを注入し、エレクトロポレーションされた胚は、注射のみ胚で午後のファロイジン染色の同じようなレベルを持っていた。エレクトロポレーションと一緒にMIF MOの注入は、午後（D）のファロイジン染色の劇的な減少を引き起こした一方（C）単独で耳胞へのMIFのMOとのインジェクションは、ファロイジン染色の低下を引き起こさなかった。 、前黄斑です。
図4 5 DPFの幼虫とアクチンフィラメントのファロイジン染色。標準コントロールモルホリノが（B）に使用されたエレクトロのみインジェクション（）と注入の間に差はなかった。しかし、MIFモルフォとエレクトロポレーションを注入された5 DPFの幼虫は、MIFモルフォ（Cを注入した胚と比べ3 DPFよりもそれほど劇的後黄斑の減少ファロイジン染色（午後）（D）を、、を示した）。 、前黄斑です。
図5 3 DPFにおける胚のアセチル化チューブリン染色。 （A）中の胚は、任意の注射またはエレクトロポレーションを受信しませんでした。 （B）の胚は、エレクトロポレーションがない注射を受信しませんでした。 MIFモルフォと注射とエレクトロポレーション（C、D）の両方を受信する胚は、目に見えて、コントロールと比較してチューブリンの染色を減少していた。 （午後、後部黄斑）。
図6。対照モルホリノ3 DPFにおける胚のアセチル化チューブリン染色。 （A）どんな治療をすることなく胚が後部黄斑（PM）と豊富な神経支配の強力なアセチル化チューブリンの染色を示した。 （B）胚は対照モルホリノを注入。 （C）エンブリオは、エレクトロポレーションで処理した。 （D）制御モルホリノとコントロール胚に注入し、エレクトロポレーションは、治療のコントロールなしに比べて後黄斑と神経支配のアセチル化チューブリンの同じようなレベルがあります。
Discussion
私たちは正常に24 HPFのゼブラフィッシュ胚の耳にアンチセンスオリゴヌクレオチドのMOを導入している。注射とエレクトロポレーション後に発生した胚は生存可能であった。胚のエレクトロポレーションを生き延びた場合、それらは通常の治療を受けておらず、胚に比べて速度だけでなく、唯一の注入した胚とのみエレクトロされていた胚に成長した。
我々は、ファロイジンとアセチル化チューブリンで標識を通して耳の注射とエレクトロポレーション後MIFとMIFのような MOの効果を観察した。後黄斑の感覚有毛細胞のアクチンフィラメントのファロイジン染色は、MIFのそのエレクトロポレーションを示しており、唯一のMOを注入した胚と比較した場合、24 HPF段階でMIFのような MOは、有毛細胞および/ または不動の数値の変化を引き起こした（図3）。有毛細胞の数のこの減少は、Shen らの調査結果と整合的である。（提出）MIFとMIFのようにMOSは球形嚢斑における有毛細胞数の減少を引き起こすこと。このエレクトロポレーションを示すMOSとエレクトロポレーションを注入した胚における毛細胞数の減少は、それによって耳胞にのみ注入された胚に比べて形態学的効果の程度を増加させる、細胞膜を横切ってMOを移動するには助けることができる。 statoacoustic神経節の形態の変化は、アセチル化チューブリン染色で観察された。 statoacoustic神経節から神経支配の程度は、神経突起（図5）の分岐減少ショーを注入し、エレクトロポレーションした胚として、影響を受けていた。アセチル化チューブリンの染色が大幅に注入し、エレクトロポレーションした両方の胚に減少するため、また、神経節細胞および/または神経節細胞数の減少の結露をそこに減少させることもできます。 MIFは、神経系の開発（鈴木ら 、2004）ために重要であることが示されているので、エレクトロポレーション後に見られる変化は、MIFとMIFのような神経芽細胞へのMOソリューションの増加トランスフェクションの結果である可能性があります。
直接開発組織へのアンチセンスオリゴモルフォのエレクトロポレーションは、胚に、両方の空間的及び時間的に、その組織の開発中に遺伝子の発現を制御するのに便利なツールです。内耳の組織にMIFとMIFのような MOのエレクトロポレーションは、後黄斑とstatoacoustic神経節の両方の異常形態をもたらした。何の治療を受けておらず、胚を持つかのどちらかのみを注入されているか、あるいは唯一のエレクトロした胚と比較して注入し、エレクトロポレーションされていた胚の後部黄斑の感覚有毛細胞数の減少があった。 statoacoustic神経節から後部感覚パッチの神経支配の程度の低下とSAGの大きさもあった。エレクトロポレーションは、所望の組織で、特定のDNA、RNA、またはMOの主効果を観察し、他の組織上の二次的影響からこれらを区別すること、脳、神経堤とを含むことの利点と、特定の組織に巨大分子をトランスフェクションするための貴重な方法です。内耳の開発に関する耳周囲の間充織（Baraldとケリー、2004）。
Disclosures
記事の生産は、ビデオとテキストに記載されている試薬を生成する遺伝子のツール、LLCによって後援されています。
Acknowledgments
この作品は、KFBの難聴の研究財団からYcをSとNSF（IOS 0930096）への補助金によって支えられている。
KFB：NIH / NINDCD 2 RO1 DC04184、 3R01DC004184 - 08W1 、NSF DBI 0832862、NSF IOS 0930096
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sutter P-97 electrode puller | Equipment | |||
| PV820 Pneumatic PicoPump | Equipment | World Precision Instruments, Inc. | ||
| M3301L Manual Micromanipulator | Equipment | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Leica S6D stereomicroscope | Equipment | |||
| Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator | Equipment | |||
| Olympus FV500 confocal microscope | Equipment | |||
| 0.01 inch Platinum Wire | Supply | A-M Systems | 711000 | |
| Shrink Tubing | Supply | Newark Inc | 03F3172 | |
| Socket Crimp Terminal | Supply | Digi-Key | 82PECT-ND | |
| Capillaries | Supply | Stoelting Co. | 50613 | |
| Modeling clay | Supply | |||
| Plastic 100 mm Petri dishes | Supply | Falcon BD | ||
| 6 well plastic plates | Supply | Falcon BD | ||
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References
- Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).
- Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development. J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).
- Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. From placode to polarization: new tunes in inner ear development. Development. 131, 4119-4135 (2004).
