Entrega directa de Morpholinos FOMIN Hacia el otocyst pez cebra por inyección y electroporación afecta el desarrollo del oído interno

Summary

Un método para entregar morfolinos directamente en el pez cebra en otocyst 24hpf se ha desarrollado. Con microinyección de morfolinos en el lumen de la vesícula ótica y la electroporación para llevar a cabo la penetración, hemos sido capaces de evitar el efecto de morfolinos en el cerebro y obtener efectos específicos en el oído interno.

Abstract

En los últimos años, la electroporación se ha convertido en una técnica popular para la transfección in vivo del ADN, el ARN y morfolinos en varios tejidos, incluyendo el ojo, el cerebro y somitas de pez cebra. La ventaja de la electroporación sobre otros métodos de manipulación genética es que los tejidos específicos puede ser objetivo, tanto espacial como temporalmente, para la introducción de las macromoléculas de la aplicación de corriente eléctrica. A continuación se describe el uso de la electroporación para transfectar mif y morfolinos mif-como en los tejidos del oído interno en desarrollo del pez cebra. En estudios anteriores, el FOMIN morfolino se inyectan en embriones en el 1 - al estadio de 8 células resultado en general los cambios morfológicos en el sistema nervioso y los ojos, así como el oído. Al dirigirse a los tejidos del oído interno en las etapas posteriores del desarrollo, podemos determinar los efectos primarios del FOMIN en el oído interno en desarrollo, en comparación con los efectos secundarios que pueden resultar de la influencia de otros tejidos. Mediante el uso de tubulina acetilada y phalloidin tinción para estudiar la morfología de las neuronas, los procesos neuronales y las células del cabello asociada con la mácula posterior, hemos sido capaces de evaluar la eficacia de electroporación como método de transfección dirigida en el oído interno del pez cebra. Las vesículas óticas de los embriones fueron inyectados con 24hpf morfolinos y electroporación y fueron comparados con los embriones que habían recibido ningún tratamiento o sólo se había inyectado o electroporación. Los embriones que fueron inyectados y electroporación mostró una disminución en el número de células de cabello, disminución de la inervación del ganglio statoacoustic (SAG) y menos neuronas SAG en comparación con los grupos control. Nuestros resultados mostraron que la entrega directa de morfolinos en otocysts en etapas posteriores se evita el sistema nervioso no específica y los efectos de la cresta neural de morfolinos en las fases celulares 1-8. También permite el examen de los efectos que se dirigen hacia el oído interno y no los efectos secundarios en el oído de los principales efectos en el cerebro, mesénquima de la cresta neural o periotic.

Protocol

1. Electrodos para la toma de electroporación

1. Cortar 75 m de diámetro de alambre de tungsteno (AM Systems, Inc. Carlsborg, WA) de longitud adecuada (alrededor de 5.3 cm)
2. Poner alambre de tungsteno a través de cable conector molex (latón estampado pin)
3. Envuelva los cables de tungsteno y el conector del cable molex con tubo retráctil (SPC Technology, Chicago, IL) y aplicar calor con quemador Bunsen o una pistola de calor para sellar el tubo de la reducción al cable
4. Para afilar la punta del alambre de tungsteno, sumergir el alambre en hidróxido de sodio 1,0 N (Conrad et al. 1993) y, con un clip en el otro electrodo, electrolizar el alambre con un Electroporador onda cuadrada. Las condiciones que utilizamos son 5 de 50 voltios con una duración de impulsos de 100 ms con 50 ms entre pulsos. Los electrodos deben ser afilados con un diámetro de 15-20 micras
5. Mantenga los cables en una bandeja en las ranuras presionado en arcilla antes de su uso en la electroporación

2. Configurar la estación de electroporación

1. Cinta afilada 75μm electrodos de tungsteno para micromanipulador (instrumentos de precisión Mundial).
2. Micromanipuladores lugar a ambos lados de la platina del microscopio de disección (Leica).
3. Conectar los electrodos a una Proteger CUY-21 Electroporador Edición de onda cuadrada (Figura 1).
4. Encienda el electroporador y establecer parámetros para la electroporación, como el voltaje, la duración del pulso, y el número de pulsos. Los parámetros más eficaces para este experimento se encontró que tres de 13 voltios de pulsos que se prolongó durante cada 5.0ms, con 100 ms entre cada pulso. Si electroporación crea burbujas de aire en el embrión, reducir la duración del pulso.

3. Microinyección de Morpholinos Dentro vesícula ótica pez cebra

1. Embriones de pez cebra de la cosecha de un estanque de cría. Incubar los embriones en el embrión de conciencia medio con 0,3 ppm de azul de metileno (Westerfield, 2005) a 28,5 ° C durante la noche.
2. Tire las agujas de cristal con un extractor de Sutter P-97 electrodos
3. Calentar una base de gel de agarosa (agarosa al 1% en los peces de agua en un 10 mm placa de Petri) a 37 ° C en un baño de agua
4. Calentar 1% de agarosa de bajo punto de fusión (LMPA) en peces de agua hasta que se derrita y mantenerlo caliente en el baño de agua a 37 ° C.
5. Llene una aguja de vidrio con una solución de morfolino (GeneTools, Corvallis, Oregón) y cortar la punta de diámetro apropiado. Monte la aguja de inyección en un micromanipulador (Kuhn).
6. Cortar punta de la aguja de aproximadamente 10 micras y se inyecta en aceite mineral para asegurarse de que la punta permite la entrega suficiente de solución de morfolino.
7. Dechorinate embriones a las 24 horas postfertilización (HPF) y anestesia con MS222 (tricaína, Sigma) en agua 0,3 PPM pescado azul de metileno.
8. Alinear 3 a 5 embriones anestesiado en la base de gel de agarosa con el lado derecho para el análisis uniforme conveniente
9. Ponga 1 a 2 gotas de 1% sobre LMPA cada embrión y dejar solidificar a fijar el embrión en su lugar
10. Gire la placa de Petri para que la vesícula ótica se encuentra en el lado derecho
11. Coloque la aguja en el lumen de la vesícula ótica e inyectar la solución morfolino con un neumático PicoPump PV820 (Instrumentos del Mundo de Precisión) con un tanque de nitrógeno unido (Figura 2)

4. Electroporación procedimiento

1. Mueva los embriones montado en la estación de electroporación inmediatamente después de la inyección
2. Coloque el electrodo positivo en el tejido que está por detrás de la vesícula ótica, pero no penetran, insertar el electrodo negativo en el cerebro, justo por delante de la vesícula ótica
3. Aplicar actual mediante un pedal o pulsar un interruptor.
4. Vierta el agua los peces de agarosa y eliminar los embriones de agarosa con remolinos y una pipeta de vidrio. Tenga cuidado de no dañar los embriones. Para los embriones que son difíciles de eliminar, el uso de una aguja para romper con suavidad a la basura cualquier LMPA que rodea al embrión.
5. Embriones a cabo en un plato con pescado de agua azul de metileno y elevar los embriones a los escenarios deseados para el análisis (morfológico, inmunohistoquímico, en anlaysis hibridación in situ, etc y microscópicas).

5. Los resultados representativos:

Figura 1. Estación de electroporación. Los electrodos se realiza mediante cables de tungsteno afilada 75μm y conectados por cables a una Proteger CUY-21 Electroporador onda Editar Square. Estos electrodos fueron grabadas a micromanipulador.

Figura 2. Estación de inyección. Todos los embriones fueron inyectados en el oído derecho, para fines de normalización.

Figura 3. Faloidina tinción de los filamentos de actina con 3 embriones fdd. (A) El embrión 3 fdd injected con el control de MO tiene una fuerte tinción de phalloidin en la mácula posterior (pm). (B) El embrión que fue inyectado con el control de MO y luego electroporated tenían niveles similares de tinción phalloidin en la tarde en los embriones de inyección única. (C) Inyección de la OM del FOMIN en la vesícula ótica por sí sola no causa la reducción de la tinción phalloidin, mientras que la inyección de MOs FOMIN junto con la electroporación causado una drástica reducción de la tinción phalloidin en la tarde (D). am, mácula anterior.

Figura 4. Manchas faloidina de filamentos de actina con larvas DPF 5. No hubo diferencias entre la inyección única (A) y la inyección con la electroporación, cuando la norma morfolino de control se utilizó (B). Sin embargo, las larvas DPF 5 que fueron inyectados con mif morfolinos y electroporated demostraron una reducción de tinción phalloidin en la mácula posterior (pm) (D), aunque menos pronunciado que tres fdd, cuando se compara con el embrión que fue inyectado con mif morfolinos sólo (C ). am, mácula anterior.

Figura 5. Tinción tubulina acetilada de los embriones a los 3 fdd. El embrión en (A) no recibió ninguna inyección o electroporación. El embrión en (B) se electroporated pero no recibió ninguna inyección. Los embriones que reciben tanto de la inyección y la electroporación (C, D) con mif morfolinos había disminuido visiblemente manchas tubulina en comparación con los controles. (Por la tarde, la mácula posterior).

Figura 6. Tinción tubulina acetilada de los embriones a los 3 fdd con el control de morfolino. (A) de embriones sin ningún tipo de tratamiento mostraron una fuerte tinción tubulina acetilada en la mácula posterior (pm) y la inervación extensa. (B) de embriones inyectados con el control de morfolino. (C) de embriones tratados con la electroporación solamente. (D) de embriones de control con el control de morfolino inyectado y electroporated tiene niveles similares de tubulina acetilada en la mácula y la inervación posterior comparación con el control sin tratamiento.

Discussion

Hemos introducido con éxito MOs oligonucleótidos antisentido en el oído del embrión de pez cebra 24 HPF. Los embriones que se plantearon después de la inyección y la electroporación fueron viables. Si los embriones sobrevivieron a la electroporación, que creció a un ritmo normal, comparado con los embriones que no habían recibido tratamiento, así como los embriones que sólo había sido inyectado y embriones que habían sido sólo electroporación.

Hemos observado los efectos de la MIF y MIF-OM como el oído después de la inyección y la electroporación mediante el etiquetado con phalloidin y tubulina acetilada. Tinción phalloidin de filamentos de actina en las células ciliadas de la mácula posterior indica que la electroporación de MIF y MIF-MO como en la etapa 24 HPF causado cambios en la célula de pelo y / o números de estereocilios en comparación con los embriones que fueron inyectados sólo con el OM (Figura 3). Esta disminución en el número de células de cabello es consistente con los hallazgos de Shen et al. (Presentado) que MOs para MIF y MIF-como causa una reducción en el número de células ciliadas de la mácula sacular. La disminución del número de células de cabello en los embriones que fueron inyectados con OM y electroporated demostrar que la electroporación puede ayudar a mover el OM a través de la membrana celular, lo que aumenta el alcance de los efectos morfológicos en comparación con los embriones en los que se inyectó la vesícula ótica solamente. Los cambios en la morfología del ganglio statoacoustic se observaron mediante la tinción tubulina acetilada. El grado de inervación por el ganglio statoacoustic se vio afectada, ya que los embriones que fueron inyectados y electroporated muestran una disminución en la ramificación de las neuritas (Figura 5). También puede haber disminución de la condensación de las células ganglionares y / o disminución del número de células ganglionares, ya que la tinción tubulina acetilada se redujo significativamente en los embriones que fueron inyectados y electroporación. Debido a que el FOMIN ha demostrado ser fundamental para el desarrollo del sistema nervioso (Suzuki et al., 2004), los cambios observados después de la electroporación puede ser el resultado de la transfección aumento de la MIF y MIF-MO como solución a las células neuroblast.

Electroporación de antisentido oligo morfolinos directamente en un tejido en desarrollo es una herramienta útil para controlar la expresión de un gen durante el desarrollo de ese tejido, tanto espacial como temporalmente, en el embrión. Electroporación de MIF y MIF-como Mos en los tejidos del oído interno como resultado de la morfología anormal de la mácula tanto posterior y el ganglio statoacoustic. Hubo una reducción en el número de células ciliadas de la mácula posterior de los embriones que habían sido inyectados y electroporación en comparación con los embriones que habían recibido ningún tratamiento o con los embriones que habían sido inyectados o sólo electroporated solamente. También hubo una disminución en el grado de inervación de la revisión posterior por el ganglio sensorial statoacoustic y el tamaño de la SAG. La electroporación es un método valioso para la transfección de las macromoléculas en tejidos específicos, con la ventaja de observar los efectos primarios de ese particular de ADN, el ARN, o MO en el tejido deseado y la discriminación de estos efectos secundarios en otros tejidos, incluyendo el cerebro, la cresta neural y mesénquima periotic en el desarrollo del oído interno (Barald y Kelley, 2004).

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Sutter P-97 electrode puller	Equipment
PV820 Pneumatic PicoPump	Equipment	World Precision Instruments, Inc.
M3301L Manual Micromanipulator	Equipment	World Precision Instruments, Inc.
Leica S6D stereomicroscope	Equipment
Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator	Equipment
Olympus FV500 confocal microscope	Equipment
0.01 inch Platinum Wire	Supply	A-M Systems	711000
Shrink Tubing	Supply	Newark Inc	03F3172
Socket Crimp Terminal	Supply	Digi-Key	82PECT-ND
Capillaries	Supply	Stoelting Co.	50613
Modeling clay	Supply
Plastic 100 mm Petri dishes	Supply	Falcon BD
6 well plastic plates	Supply	Falcon BD
MOs: 0.3 mM of a combination of for mif, mif-like MO1, and mif-like MO2 was used. Mif MO is complimentary to the start codon of zebrafish mif mRNA: 5’-acatcggcatgactgcgacagagat-3’. Two MOs were used for mif-like. mif-like MO1 is complimentary to the translational start site: 5’-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3’, while mif-like MO2 derived from AS sequence at the intron1/exon 2 boundary: 5’-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC-3’. Control MO was the scrambled nucleotide sequence from Gene Tools: 5’-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA- 3’. methylene blue (0.3 ppm) in fish water MS222 (tricaine, Sigma; 0.64 mM in fish water) Low-melting point agarose (LMPA; Roche) phenol red (Sigma) Anti-acetylated tubulin (Sigma) Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse second antibody (Molecular probes) Texas red-phalloidin (Molecular probes)