Directe levering van MAV Morpholinos Into the zebravis Otocyst door injectie en elektroporatie van invloed op binnenoor Ontwikkeling

Summary

Een methode om rechtstreeks te leveren morpholinos in de zebravis otocyst op 24hpf is ontwikkeld. Met behulp van micro-injectie van morpholinos in het lumen van otic blaasje en elektroporatie tegen penetratie effect, waren we in staat om het effect van morpholinos op de hersenen te omzeilen en de effecten die specifiek zijn voor het binnenoor te verkrijgen.

Abstract

In de afgelopen jaren, is elektroporatie uitgegroeid tot een populaire techniek voor in vivo transfectie van DNA, RNA, en morpholinos in verschillende weefsels, waaronder de ogen, de hersenen en somieten van de zebravis. Het voordeel van elektroporatie ten opzichte van andere methoden van genetische manipulatie is dat de specifieke weefsels kan worden gericht, zowel ruimtelijk als in de tijd, voor de invoering van macromoleculen door de toepassing van elektrische stroom. Hier beschrijven we het gebruik van elektroporatie voor transfecteren MIF en mif-achtige morpholinos in het weefsel van de zich ontwikkelende binnenoor van de zebravis. In eerdere studies, mif morfolino geïnjecteerd in embryo's op de 1 - tot 8-cellig stadium geleid tot grootschalige morfologische veranderingen in het zenuwstelsel en het oog, evenals het oor. Door zich te richten de weefsels van het binnenoor in latere stadia van ontwikkeling, kunnen we bepalen de primaire effecten van de MIF in de ontwikkelingslanden binnenoor, in tegenstelling tot secundaire effecten die kunnen voortvloeien uit de invloed van andere weefsels. Door gebruik te maken phalloidin en geacetyleerd tubuline vlekken op de morfologie van neuronen, neurale processen en haarcellen worden geassocieerd met het achterste macula studie, waren we in staat om de werkzaamheid van elektroporatie te beoordelen als een methode voor gerichte transfectie in de zebravis binnenoor. De blaasjes Otic van 24hpf embryo's werden ingespoten met morpholinos en geëlektroporeerd en werden vervolgens vergeleken met embryo's die waren kregen geen behandeling of waren alleen geïnjecteerd of geëlektroporeerd. Embryo's die werden geïnjecteerd en geëlektroporeerd lieten een afname in haar cel aantallen, verminderd innervatie door de statoacoustic ganglion (SAG) en minder SAG neuronen in vergelijking met controlegroepen. Onze resultaten toonden aan dat de directe levering van morpholinos in otocysts in latere stadia van de niet-specifieke zenuwstelsel en de neurale lijst effecten van morpholinos geleverd op de 1-8 cellig stadium voorkomt. Het staat ook het onderzoek van effecten die zijn gericht op het binnenoor en niet secundaire effecten op het oor van de primaire effecten op de hersenen, neurale lijst of periotic mesenchym.

Protocol

1. Elektroden voor het maken van Elektroporatie

1. Snij 75 micrometer diameter wolfraam draad (AM Systems, Inc Carlsborg, WA) van geschikte lengte (ongeveer 3-5 cm)
2. Zet wolfraam draad door molex connector (pin gestempeld messing)
3. Wrap wolfraam draden en molex connector met krimpkous (CSP-technologie, Chicago, IL) en verwarmen met een bunsenbrander of warmte kanon van de krimpende slang afdichting op de draad
4. Te slijpen van de punt van wolfraam draad, duik de draad in 1,0 N natriumhydroxide (Conrad et al.. 1993) en, met behulp van een paperclip als de andere elektrode, elektrolyse de draad met een blokgolf Electroporator. De voorwaarden die wij gebruiken zijn vijf 50-volt pulsen van telkens 100 ms met 50 ms in tussen de pulsen. Elektroden moeten worden geslepen tot een diameter van 15-20 urn
5. Houd de draden in een lade in groeven geperst in boetseerklei voor gebruik in elektroporatie

2. Set Up Elektroporatie Station

1. Tape 75μm wolframelektroden aangescherpt tot micromanipulators (World precisie-instrumenten).
2. Plaats micromanipulators aan beide zijden van de dissectiemicroscoop fase (Leica).
3. Verbind de elektroden met een Protect CUY-21 Bewerken Square Wave Electroporator (figuur 1).
4. Zet de electroporator en de parameters instellen voor elektroporatie, zoals spanning, pulsduur, en het aantal pulsen. De meest effectieve parameters voor dit experiment bleken te zijn drie 13-volt pulsen die elk geduurd 5.0ms, met 100ms tussen elke puls. Als elektroporatie creëert luchtbellen in het embryo, vermindering van de puls lengte.

3. Micro-injectie van Morpholinos Into zebravis Otic Blaasjes

1. Oogst zebravis embryo's van een kweekbak. Incubeer de embryo's in embryo-raising medium met 0,3 PPM methyleenblauw (Westerfield, 2005) bij 28,5 ° C gedurende de nacht.
2. Trek glas naalden met een Sutter P-97 electrode puller
3. Warming-up een agarosegel basis (1% agarose in vis het water in een 10 mm petrischaal) tot 37 ° C in een waterbad
4. Verhit 1% laag smeltpunt agarose (LMPA) in vis water tot het gesmolten is en warm in de 37 ° C waterbad te houden.
5. Vul een glas met een naald morfolino oplossing (GeneTools, Corvallis, OR) en snijd de tip om juiste diameter. Plaats de injectienaald op een micromanipulator (Kuhn).
6. Gesneden naald tot ongeveer 10 urn en injecteer in minerale olie om ervoor te zorgen dat de punt voldoende afname van morfolino oplossing biedt.
7. Dechorinate embryo's op 24 uur postfertilization (HPF) en verdoven ze met MS222 (tricaïne, Sigma) in 0,3 PPM methyleenblauw vis water.
8. Lijn 3 tot 5 embryo's onder narcose op de agarosegel basis met de juiste kant naar boven voor handige uniforme analyse
9. Doe 1 tot 2 druppels van 1% LMPA over elke embryo en laat stollen voor het embryo vast te zetten
10. Draai de petrischaal, zodat de otic blaasje is aan de rechterkant
11. Plaats de naald in het lumen van de otic blaasje en injecteer de morfolino-oplossing met een PV820 Pneumatische PicoPump (World precisie-instrumenten) met een aangesloten stikstof tank (figuur 2)

4. Elektroporatie Procedure

1. Verplaats de gemonteerde's naar de elektroporatie station onmiddellijk na de injectie
2. Plaats de positieve elektrode op het weefsel juist achter het Otic blaasje, maar dringen niet door, steek de negatieve elektrode in de hersenen net anterieur van de otic blaasje
3. Van toepassing zijn huidige gebruik van een voetpedaal of door op een schakelaar.
4. Giet het water vissen op agarose en verwijder de embryo's van agarose met wervelende en een glazen pipet. Wees voorzichtig dat u de embryo's beschadigen. Voor embryo's die zijn moeilijk te verwijderen, gebruik dan een naald om voorzichtig losmaken een LMPA rond de embryo.
5. Plaatsen embryo's in een plaat met methyleenblauw vis water en verhoog de ​​embryo's om de gewenste stappen voor de analyse (morfologische, immunohistochemische, in situ hybridisatie, etc en microscopische anlaysis).

5. Representatieve resultaten:

Figuur 1. Elektroporatie station. Elektroden werden gemaakt met behulp van geslepen 75μm Tungsten draden en verbonden door leidt tot een Protect CUY-21 Bewerken plein Wave Electroporator. Deze elektroden werden geplakt micromanipulators.

Figuur 2. Injectie station. Alle embryo's werden geïnjecteerd in het rechter oor is voor normalisatie.

Figuur 3. Phalloidin kleuring van actine filamenten met 3 DPF embryo's. (A) De drie DPF embryo injected met controle MO heeft sterke kleuring van phalloidin in het achterste macula (pm). (B) Het embryo dat werd geïnjecteerd met controle MO en daarna geëlectroporeerd vergelijkbare niveaus van phalloidin vlekken had in uur in de injectie alleen embryo's. (C) Injectie met MIF MO's in de otic blaasje alleen niet leiden tot vermindering van de phalloidin vlekken, terwijl de injectie van mif MO's, samen met elektroporatie veroorzaakte een dramatische vermindering van de phalloidin kleuring in de pm (D). am, anterior macula.

Figuur 4. Phalloidin kleuring van actine filamenten met 5 DPF larven. Er was geen verschil tussen de injectie (A) en injectie met elektroporatie wanneer de standaard controle morfolino werd gebruikt (B). Echter, toonde de 5 DPF larven die werden geïnjecteerd met MIF morpholinos en geëlektroporeerd verminderde phalloidin kleuring in het achterste macula (pm) (D), maar minder dramatisch dan 3 DPF, in vergelijking met de embryo dat werd geïnjecteerd met MIF morpholinos alleen (C ). am, anterior macula.

Figuur 5. Geacetyleerd tubuline kleuring van embryo's op 3 DPF. Het embryo in (A) kreeg geen injectie of elektroporatie. Het embryo in (B) was geëlektroporeerd maar kreeg geen injectie. Embryo's die zowel injectie en elektroporatie (C, D) met een MIF morpholinos zienderogen verminderd tubuline vlekken in vergelijking met de controlegroep. (Pm, posterior macula).

Figuur 6. Geacetyleerd tubuline kleuring van embryo's op 3 DPF met controle morfolino. (A) Embryo zonder enige behandeling vertoonde een sterke geacetyleerd tubuline kleuring in het achterste macula (pm) en een uitgebreide innervatie. (B) Embryo geïnjecteerd met controle morfolino. (C) Embryo behandeld met elektroporatie alleen. (D) Controle embryo met controle morfolino geïnjecteerd en geëlektroporeerd heeft een vergelijkbaar niveau van geacetyleerd tubuline in de achterste macula en innervatie in vergelijking met de niet-behandelde controle.

Discussion

We hebben met succes geïntroduceerd antisense oligonucleotide MO's in het oor van de 24 HPF zebravis embryo. Embryo's die zijn gerezen na de injectie en elektroporatie waren levensvatbaar zijn. Als de embryo's overleefde de elektroporatie, groeiden ze tegen normale tarieven in vergelijking met embryo's die waren kreeg geen behandeling, maar ook embryo's die alleen waren geïnjecteerd en embryo's die alleen was geweest geëlektroporeerd.

We de effecten van MIF en MIF-achtige MO's waargenomen na oor injectie en elektroporatie door middel van etikettering met phalloidin en geacetyleerde tubuline. Phalloidin kleuring van actine filamenten in sensorische haarcellen van het achterste macula geeft aan dat elektroporatie van de MIF en MIF-achtige MO bij de 24-HPF stadium veroorzaakt veranderingen in haar cel en / of stereocilia cijfers in vergelijking met embryo's die alleen werden geïnjecteerd met de MO's (Figuur 3). Deze daling in het haar cel aantallen in overeenstemming is met de bevindingen van Shen et al.. (Ingediend) dat MO's te MIF en MIF-achtige leiden tot een vermindering van het aantal van de haarcellen in het zakvormig macula. De afname in haar cel aantallen in embryo's die werden geïnjecteerd met MOS en geëlektroporeerd aantonen dat elektroporatie kunnen helpen bij het verplaatsen van de MO's over het celmembraan, waardoor de omvang van de morfologische effecten in vergelijking met embryo's in de otic blaasje enige was geïnjecteerd. Veranderingen in de morfologie van de statoacoustic ganglion werden waargenomen door geacetyleerde tubuline vlekken. De omvang van innervatie door de statoacoustic ganglion werd beïnvloed, omdat embryo's die werden ingespoten en geëlectroporeerd tonen verminderde vertakking van de neurieten (figuur 5). Er kan ook worden verminderd condensatie van de ganglien-cellen en / of het verminderd aantal ganglioncellen, omdat de geacetyleerde tubuline kleuring is significant verlaagd in embryo's die zowel geïnjecteerd en geëlectroporeerd. Omdat mif is aangetoond kritisch te zijn voor de ontwikkeling van het zenuwstelsel (Suzuki et al.., 2004), kan de veranderingen gezien na elektroporatie het gevolg zijn van verhoogde transfectie van de MAV en MAV-achtige MO oplossing in het neuroblast cellen.

Elektroporatie van antisense oligo morpholinos direct in het ontwikkelen van een weefsel is een nuttig instrument voor het regelen van de expressie van een gen tijdens de ontwikkeling dat weefsel, zowel ruimtelijk als in de tijd, in het embryo. Electroporatie van mif en MIF-achtige MO's in de weefsels van het binnenoor resulteerde in een abnormale morfologie van zowel de achterste macula en de statoacoustic ganglion. Er was een vermindering van het aantal van sensorische haarcellen in het achterste macula in embryo's die waren geïnjecteerd en geëlektroporeerd in vergelijking met embryo's die waren ontvangen geen behandeling of met embryo's die ofwel slechts geïnjecteerd of alleen geëlektroporeerd. Er was ook een daling in de mate van innervatie van de achterste sensorische patch door de statoacoustic ganglion en de grootte van de SAG. Elektroporatie is een waardevolle methode voor transfecteren macromoleculen in specifieke weefsels, met het voordeel van het observeren van de primaire effecten van dat DNA, RNA, of MO in de gewenste weefsel en onderscheid deze van secundaire effecten op andere weefsels, waaronder de hersenen, neurale lijst en periotic mesenchym op binnenoor ontwikkeling (Barald en Kelley, 2004).

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Sutter P-97 electrode puller	Equipment
PV820 Pneumatic PicoPump	Equipment	World Precision Instruments, Inc.
M3301L Manual Micromanipulator	Equipment	World Precision Instruments, Inc.
Leica S6D stereomicroscope	Equipment
Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator	Equipment
Olympus FV500 confocal microscope	Equipment
0.01 inch Platinum Wire	Supply	A-M Systems	711000
Shrink Tubing	Supply	Newark Inc	03F3172
Socket Crimp Terminal	Supply	Digi-Key	82PECT-ND
Capillaries	Supply	Stoelting Co.	50613
Modeling clay	Supply
Plastic 100 mm Petri dishes	Supply	Falcon BD
6 well plastic plates	Supply	Falcon BD
MOs: 0.3 mM of a combination of for mif, mif-like MO1, and mif-like MO2 was used. Mif MO is complimentary to the start codon of zebrafish mif mRNA: 5’-acatcggcatgactgcgacagagat-3’. Two MOs were used for mif-like. mif-like MO1 is complimentary to the translational start site: 5’-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3’, while mif-like MO2 derived from AS sequence at the intron1/exon 2 boundary: 5’-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC-3’. Control MO was the scrambled nucleotide sequence from Gene Tools: 5’-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA- 3’. methylene blue (0.3 ppm) in fish water MS222 (tricaine, Sigma; 0.64 mM in fish water) Low-melting point agarose (LMPA; Roche) phenol red (Sigma) Anti-acetylated tubulin (Sigma) Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse second antibody (Molecular probes) Texas red-phalloidin (Molecular probes)