Direkt Leverans av MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst med injektion och elektroporation Påverkar Inner Ear utveckling

Summary

En metod för att leverera morpholinos direkt i zebrafisk otocyst på 24hpf har utvecklats. Använda mikroinjektion av morpholinos in i lumen öron vesikler och elektroporation att genomföra penetration, kunde vi kringgå effekten av morpholinos på hjärnan och få effekter som är specifika för innerörat.

Abstract

På senare år har elektroporation blivit en populär teknik för in vivo transfektion av DNA, RNA och morpholinos i olika vävnader, inklusive ögat, hjärnan och somites av zebrafisk. Fördelen med elektroporation jämfört med andra metoder för genetisk manipulation är att specifika vävnader kan riktas både rumsligt och tidsmässigt, för införandet av makromolekyler genom tillämpning av elektrisk ström. Här beskriver vi användandet av elektroporation för transfecting MIF och MIF-liknande morpholinos in i vävnader i utvecklingsländerna innerörat i zebrafisk. I tidigare studier, MIF morpholino sprutas in embryon vid 1 - till 8-cells skede resulterade i omfattande morfologiska förändringar i nervsystemet och ögat samt örat. Genom att rikta vävnader i innerörat vid senare stadier i utvecklingen, kan vi bestämma de primära effekterna av MIF i utvecklingsländerna innerörat, i motsats till sekundära effekter som kan uppstå påverkan av andra vävnader. Genom att använda phalloidin och acetylerade tubulin färgning för att studera morfologi av nervceller, neuronala processer och celler hår i samband med den bakre gula fläcken, kunde vi bedöma effekten av elektroporation som en metod för riktade transfektion i zebrafisk innerörat. Den öron blåsor i 24hpf embryon injicerades med morpholinos och electroporated och har sedan jämförts med embryon som hade fått någon behandling eller hade endast injiceras eller electroporated. Embryon som injicerats och electroporated visade en minskning i antal hår cell, minskade innervation av statoacoustic ganglion (SAG) och färre nervceller SAG jämfört med kontrollgrupper. Våra resultat visade att direkt leverans av morpholinos i otocysts i senare skeden undviker de icke-specifika nervsystemet och neurala effekter krönet av morpholinos levereras på 1-8 cellen scenen. Den tillåter också undersökning av effekter som riktar sig till innerörat och inte sekundära effekter på örat från primära effekter på hjärnan, neural crest eller periotic mesenkym.

Protocol

1. Göra Elektroder för elektroporation

1. Klipp 75 ìm tråddiameter volfram (AM Systems, Inc. Carlsborg, WA) av lämplig längd (ca 3-5 cm)
2. Sätt volfram tråd genom molex kabel-kontakt (stift stämplade mässing)
3. Wrap volfram ledningar och molex kabel-kontakt med krympslang (SPC TECHNOLOGY, Chicago, IL) och hetta med Bunsenbrännare eller värmepistol för att täta krymper slangen till tråd
4. Att vässa spetsen av volfram tråd, doppa kabeln i 1,0 N natriumhydroxid (Conrad et al. 1993) och med hjälp av ett gem som den andra elektroden, electrolyze kabeln med en fyrkantvåg Electroporator. Villkoren vi använder är fem 50-volts pulser vardera 100 ms med 50 ms mellan pulser. Elektroder bör skärpas till en diameter på 15-20 ìm
5. Håll trådarna i ett fack inom spår pressas in modellera före användning i elektroporering

2. Konfigurera elektroporation Station

1. Tejp vässade 75μm volframelektroder till micromanipulators (World precisionsinstrument).
2. Placera micromanipulators på vardera sidan av dissekera mikroskop scenen (Leica).
3. Anslut elektroderna till ett Skydda CUY-21 Redigera Square Wave Electroporator (Figur 1).
4. Slå på electroporator och ställa in parametrar för elektroporation, inklusive spänning, pulslängd och antal pulser. Den mest effektiva parametrarna för detta experiment visade sig vara tre 13-volts pulser som var och varade 5.0ms, med 100 ms mellan varje puls. Om elektroporation skapar luftbubblor i embryot, minska pulslängd.

3. Mikroinjektion av Morpholinos Into Zebrafish öron Blås

1. Harvest zebrafisk embryon från en uppfödning tank. Inkubera embryona i embryot medvetenhet medium med 0,3 ppm metylenblått (Westerfield, 2005) vid 28,5 ° C över natten.
2. Dra glas nålar med en Sutter P-97 elektrod avdragare
3. Värm upp en agarosgel bas (1% agaros i fisk vatten i en 10 mm petriskål) till 37 ° C i ett vattenbad
4. Heat 1% låg smältpunkt agaros (LMPA) i fisk vatten tills smält och hålla det varmt i 37 ° C vattenbad.
5. Fyll ett glas nål med morpholino lösning (GeneTools, Corvallis, OR) och skär tips till lämplig diameter. Montera injektionsnål på en mikromanipulator (Kuhn).
6. Klipp nålspetsen till cirka 10 mikrometer och injicera i mineralolja för att se till att spetsen gör tillräckligt leverans av morpholino lösning.
7. Dechorinate embryon vid 24 timmar postfertilization (HPF) och söva dem med MS222 (tricaine, Sigma) i 0,3 ppm metylenblått fiskevatten.
8. Rikta 3 till 5 sövda embryon på agarosgel basen med rätt sida upp för bekväm enhetliga analys
9. Sätt 1 2 droppar 1% LMPA över varje embryo och låt stelna för att fixera embryot på plats
10. Rotera petriskål så att öron vesikler är på höger sida
11. Placera nålen i lumen i öron vesikler och injicera morpholino lösning med en PV820 Pneumatisk PicoPump (World precisionsinstrument) med en bifogad kväve tanken (Figur 2)

4. Elektroporation Förfarande

1. Flytta monterad embryon till elektroporation stationen omedelbart efter injektion
2. Placera den positiva elektroden på vävnaden strax posteriort om öron vesikler, men inte tränga in, sätter den negativa elektroden i hjärnan precis främre till öron vesikler
3. Använd aktuella med en fotpedal eller genom att trycka på en strömbrytare.
4. Häll fisken vatten på agaros och ta bort embryon från agaros med virvlande och ett glas pipett. Var försiktig att inte skada embryona. För embryon som är svåra att ta bort, använd en nål för att försiktigt bryta bort alla LMPA omger embryot.
5. Placera embryon i en tallrik med metylenblått fiskevatten och höja embryon till önskad steg för analys (morfologiska, immunhistokemisk, in situ hybridisering, etc och mikroskopiska anlaysis).

5. Representativa resultat:

Figur 1. Elektroporation station. Elektroder gjordes med hjälp av vässade 75μm Volfram ledningar och ansluts med leder till ett Skydda CUY-21 Redigera Square Wave Electroporator. Dessa elektroder tejpas till micromanipulators.

Figur 2. Injection station. Alla embryon injiceras i höger öra för standardiseringen.

Figur 3. Phalloidin färgning av aktin filament med 3 DPF embryon. (A) 3 DPF embryot injected med kontroll MO har starka färgning av phalloidin i den bakre gula fläcken (pm). (B) embryo som injicerades med kontroll MO och sedan electroporated hade liknande nivåer av phalloidin färgning i pm i injektion embryon. (C) Injektion med MIF MOS i öron vesikler ensam inte orsakade minskning av phalloidin färgning, medan injektion av mif MOS tillsammans med elektroporation orsakat en dramatisk minskning av phalloidin färgning i pm (D). am, främre makula.

Figur 4. Phalloidin färgning av aktin filament med 5 DPF larver. Det var ingen skillnad mellan injektion (A) och injektion med elektroporation när standarden kontroll morpholino användes (B). Visade dock 5 DPF larver som injicerades med MIF morpholinos och electroporated minskat phalloidin färgning i den bakre gula fläcken (pm) (D), dock mindre dramatisk än 3 DPF, jämfört med embryo som injicerades med MIF morpholinos bara (C ). am, främre makula.

Figur 5. Acetylerat tubulin färgning av embryon vid 3 DPF. Embryot i (A) fick ingen injektion eller elektroporation. Embryot i (B) electroporated men fick ingen injektion. Embryon som fick både insprutning och elektroporation (C, D) med MIF morpholinos hade synbart minskat tubulin färgning jämfört med kontroller. (PM, bakre gula fläcken).

Figur 6. Acetylerat tubulin färgning av embryon vid 3 DPF med kontroll morpholino. (A) Embryo utan någon behandling visade stark acetylerade tubulin färgning i den bakre gula fläcken (pm) och omfattande innervation. (B) Embryo injiceras med kontroll morpholino. (C) Embryo behandlas med elektroporation bara. (D) Kontroll embryo med kontroll morpholino injiceras och electroporated har liknande nivåer av acetylerade tubulin i den bakre gula fläcken och innervationen jämfört med ingen behandling kontroll.

Discussion

Vi har framgångsrikt infört MOS antisense oligonukleotid i örat av 24 HPF zebrafisk embryo. Embryon som togs upp efter injektion och elektroporation var lönsamma. Om embryona överlevde elektroporation, växte på en normal priser jämfört med embryon som hade fått någon behandling, liksom embryon som bara hade injicerats och embryon som bara hade electroporated.

Vi observerade effekterna av MIF och MIF-liknande MOS efter örat injektion och elektroporation genom märkning med phalloidin och acetylerade tubulin. Phalloidin färgning av aktin filament i sensoriska hårceller i bakre gula fläcken visar att elektroporation i MIF och MIF-liknande MO vid 24-HPF steg orsakade förändringar i hårceller och / eller siffror sinneshår jämfört med embryon som bara injicerades med MOS (Figur 3). Denna minskning av antalet hårceller ligger i linje med resultaten av Shen et al. (In) som MOS till MIF och MIF-liknande orsaka en minskning av antalet hårceller i saccular makula. Minskningen i antalet hårceller i embryon som injicerades med MOS och electroporated visa att elektroporation får stöd i att flytta MOS över cellmembranen, vilket ökar omfattningen av morfologiska effekter jämfört med embryon där öron vesikler var bara injiceras. Förändringar i morfologi statoacoustic ganglion observerades genom acetylerade tubulin färgning. Omfattningen av innervation av statoacoustic ganglion påverkades, eftersom embryon som injiceras och electroporated visar minskad förgrening av neurites (Figur 5). Det kan också vara nedsatt kondensering av ganglieceller och / eller minskat antal ganglion celler, eftersom acetylerad tubulin färgningen är betydligt minskat i embryon som var både injiceras och electroporated. Eftersom MIF har visat sig vara avgörande för nervsystemets utveckling (Suzuki et al., 2004) kan förändringar ses efter elektroporation vara ett resultat av ökad transfektion av MIF och MIF-liknande MO lösning i neuroblast cellerna.

Elektroporation av antisens oligo morpholinos direkt i ett u-vävnad är ett användbart verktyg för att kontrollera uttrycket av en gen under den vävnad utveckling, både rumsligt och tidsmässigt, i embryot. Elektroporation av MIF och MIF-liknande MOS i vävnaden i innerörat resulterade i onormal morfologi av både bakre gula fläcken och statoacoustic ganglion. Det var en minskning av antalet av sensoriska hårceller i den bakre gula fläcken med embryon som hade injicerats och electroporated i jämförelse med embryon som hade fått någon behandling eller med embryon som antingen hade endast injiceras eller bara electroporated. Det fanns också en minskning i graden av innervation av den bakre sensoriska lapp med statoacoustic ganglion och storleken på SAG. Elektroporation är en värdefull metod för transfecting makromolekyler till specifika vävnader, med fördel för att observera de primära effekterna av just DNA, RNA eller MO i önskad vävnad och diskriminera dessa från sekundära effekter på andra vävnader, inklusive hjärnan, neural crest och periotic mesenkym på innerörats utveckling (Barald och Kelley, 2004).

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Sutter P-97 electrode puller	Equipment
PV820 Pneumatic PicoPump	Equipment	World Precision Instruments, Inc.
M3301L Manual Micromanipulator	Equipment	World Precision Instruments, Inc.
Leica S6D stereomicroscope	Equipment
Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator	Equipment
Olympus FV500 confocal microscope	Equipment
0.01 inch Platinum Wire	Supply	A-M Systems	711000
Shrink Tubing	Supply	Newark Inc	03F3172
Socket Crimp Terminal	Supply	Digi-Key	82PECT-ND
Capillaries	Supply	Stoelting Co.	50613
Modeling clay	Supply
Plastic 100 mm Petri dishes	Supply	Falcon BD
6 well plastic plates	Supply	Falcon BD
MOs: 0.3 mM of a combination of for mif, mif-like MO1, and mif-like MO2 was used. Mif MO is complimentary to the start codon of zebrafish mif mRNA: 5’-acatcggcatgactgcgacagagat-3’. Two MOs were used for mif-like. mif-like MO1 is complimentary to the translational start site: 5’-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3’, while mif-like MO2 derived from AS sequence at the intron1/exon 2 boundary: 5’-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC-3’. Control MO was the scrambled nucleotide sequence from Gene Tools: 5’-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA- 3’. methylene blue (0.3 ppm) in fish water MS222 (tricaine, Sigma; 0.64 mM in fish water) Low-melting point agarose (LMPA; Roche) phenol red (Sigma) Anti-acetylated tubulin (Sigma) Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse second antibody (Molecular probes) Texas red-phalloidin (Molecular probes)