Summary
Метод доставить morpholinos непосредственно в данио отоцист на 24hpf была разработана. Использование микроинъекции morpholinos в просвет слухового пузыря и электропорации осуществить проникновение, мы смогли обойти влияние morpholinos на мозг и получить эффекты, характерные для внутреннего уха.
Abstract
В последние годы электропорации стала популярная техника для прижизненного трансфекции ДНК, РНК и morpholinos в различные ткани, включая глаза, головной мозг, и сомитов из рыбок данио. Преимущество электропорации по сравнению с другими методами генетических манипуляций в том, что специфические ткани могут быть направлены, как в пространстве и во времени, для введения макромолекул путем применения электрического тока. Здесь мы опишем использование электропорации трансфекции и MIF MIF-как morpholinos в тканях развивающегося внутреннего уха рыбок данио. В прошлых исследованиях, MIF морфолино вводят эмбрионов на 1 - 8-клеточной стадии привело к широкому распространению морфологические изменения нервной системы и глаз, а также ухо. По ориентации ткани внутреннего уха на более поздних стадиях развития, мы можем определить первичный эффект MIF в развивающемся внутреннем ухе, в отличие от вторичных эффектов, которые могут возникнуть в результате влияния других тканях. При использовании фаллоидином и ацетилированного тубулина окрашивания для изучения морфологии нейронов, нейронных процессов, а волосковых клеток связана с задним макулы, мы смогли оценить эффективность электропорации в качестве метода для целевой трансфекции в данио внутреннего уха. Слуховых пузырьках из 24hpf эмбрионы были введены с morpholinos и электропорации, а затем были по сравнению с эмбрионами, которые не получали лечения, либо были только вводили или электропорации. Эмбрионы, которые были введены и электропорации показали снижение численности волосковых клеток, снижение иннервации по statoacoustic ганглии (SAG) и меньше SAG нейронов по сравнению с контрольными группами. Наши результаты показали, что прямые поставки morpholinos в otocysts на более поздних этапах позволяет избежать неспецифической нервной системы и нейронные эффекты гребне morpholinos доставлен в 1-8 клеточной стадии. Она также позволяет исследовать эффекты, которые направлены на внутреннее ухо, а не вторичные эффекты на ухо от первичного воздействия на мозг, нервного гребня или околоушный мезенхимы.
Protocol
1. Создание Электроды для Электропорация
- Вырезать 75 мкм в диаметре вольфрамовой проволоки (AM Systems, Inc Carlsborg, WA) подходящей длины (около 3-5 см)
- Положите вольфрамовой проволоки через кабельный разъем Molex (контакт штамп латунь)
- Оберните вольфрамовой проволоки и Molex разъем кабеля с помощью термоусадочной трубки (SPC технологии, Чикаго, Иллинойс) и нагревать с Бунзена горелки или фена для герметизации сокращение трубки на проводе
- Чтобы заострить кончик вольфрамовой проволоки, погрузите провод в 1,0 гидроксида натрия N (Conrad и соавт. 1993) и, используя скрепки, как другой электрод, электролиза провод с площади Electroporator Wave. Условиях мы используем, 5 50-вольтовая импульсов продолжительностью 100 мс с 50 мс между импульсами. Электроды должны быть заточены, чтобы диаметр 15-20 мкм
- Держите провода в лоток в пазы вдавливается в пластилин до использования в электропорации
2. Настройка Электропорация станции
- Лента заостренными электродами 75 мкм вольфрама до микроманипуляторами (инструменты Всемирного Precision).
- Место микроманипуляторами по обе стороны от вскрытия столик микроскопа (Leica).
- Подключите электроды к Защитить СиУ-21 Изменить площади волна Electroporator (рис. 1).
- Включите electroporator и настроить параметры для электропорации, в том числе напряжения, длительность импульса и количество импульсов. Наиболее эффективные параметры для этого эксперимента было установлено, что три 13-вольтовых импульсов, каждый длился 5.0ms, с 100 мс между каждым импульсом. Если электропорации создает воздушные пузырьки в эмбрион, уменьшить длительность импульса.
3. Микроинъекции Morpholinos Into данио рерио слуховым пузырьком
- Урожай данио эмбрионов из разведения танк. Инкубируйте эмбрионов в зародыше средств среде с 0,3 PPM метиленовый синий (Уэстерфилд, 2005) на 28,5 ° С в течение ночи.
- Вытяните стекла иглы с Саттер Р-97 электрод съемник
- Разминка агарозном геле базы (1% агарозы в рыбе воды в 10 мм блюдо Петри) до 37 ° С на водяной бане
- Нагрейте 1% низкой температурой плавления агарозы (LMPA) в воде, пока рыба плавится и сохранить его тепло 37 ° С водяной бане.
- Наполните стакан игла с решением морфолино (GeneTools, Корваллис, OR) и вырезать наконечник соответствующего диаметра. Горы инъекционной иглой на микроманипулятора (Kuhn).
- Отрежьте кончик иглы примерно до 10 мкм и впрыснуть в минеральное масло для того, чтобы наконечник позволяет достаточным поставку решения морфолино.
- Dechorinate эмбрионов на 24 часов функции организма крыс (HPF) и обезболить их MS222 (tricaine, Sigma) в 0,3 PPM метиленовый голубой воды рыбу.
- Совместите 3 до 5 наркозом эмбрионы на базе агарозном геле с правой стороной вверх для удобного анализа равномерное
- Положите 1 по 2 капли 1% LMPA за каждый эмбрион и пусть укрепит исправить эмбриона на месте
- Поворот чашке Петри, чтобы слухового пузыря находится на правой стороне
- Место иглу в просвет слухового пузыря и внедрить решение морфолино с PV820 пневматический PicoPump (инструменты Всемирного Precision) с прикрепленным резервуар азота (рис. 2)
4. Процедура Электропорация
- Перемещение установлен эмбрионов электропорации станции сразу после инъекции
- Место положительного электрода на ткани как раз позади слухового пузырька, но не проникают; вставить отрицательного электрода в мозг только впереди слухового пузырька
- Применить тока с помощью ножной педали или нажатием переключателя.
- Залить рыбу водой на агарозном и удалить эмбрионов из агарозы с крутящихся и стеклянную пипетку. Будьте осторожны, чтобы не повредить эмбрионов. Для эмбрионов, которые трудно удалить, используйте иглу, чтобы аккуратно порвать любого LMPA окружающих эмбрион.
- Место эмбрионов в тарелку с метиленовым синим рыбы и поднять эмбрионы желаемого этапов для анализа (морфологического, иммуногистохимического, на месте anlaysis гибридизации, и т.д., и микроскопические).
5. Представитель Результаты:
Рисунок 1. Электропорация станции. Электроды были сделаны с помощью заостренными 75 мкм провода вольфрама и связанных приводит к Защитить СиУ-21 Изменить Electroporator Волна площади. Эти электроды были записаны на пленку, чтобы микроманипуляторами.
Рисунок 2. Инъекции станции. Все эмбрионы были введены в правое ухо по стандартизации целей.
Рисунок 3. Фаллоидином окрашивания нитей актина с 3 эмбрионов DPF. (А) 3 денье эмбриона injecteг с управлением МО имеет сильное окрашивание фаллоидином в задней макулы (вторая половина дня). (B) эмбриона который был введен с контролем МО, а затем электропорации были подобные уровни окрашивания фаллоидином в пм в инъекции только эмбрионы. (C) Инъекция с MIF МО в слуховым пузырьком в одиночку не может привести к снижению окрашивания фаллоидином, в то время как инъекции MIF МО вместе с электропорации вызвало резкое сокращение окрашивания фаллоидином в час (D). Я, передней макулы.
Рисунок 4. Фаллоидином окрашивания нитей актина с 5 DPF личинок. Существовал никакой разницы между инъекции только (А) и инъекции электропорации, когда стандартный элемент управления морфолино был использован (B). Тем не менее, 5 DPF личинки, которые были введены с MIF morpholinos и электропорации показали снижение фаллоидином окрашивания в задней макулы (вторая половина дня) (D), хотя и менее драматично, чем 3 денье, по сравнению с эмбрион, который был введен с MIF morpholinos только (C ). Я, передней макулы.
Рисунок 5. Ацетилированный окрашивания тубулина эмбрионов на 3 денье. Эмбриона в (А) не получили никаких инъекций или электропорации. Эмбриона в (Б) была электропорации но не получил инъекцию. Эмбрионы, получающих одновременно инъекции и электропорации (C, D) с MIF morpholinos было заметно уменьшилась окрашивания тубулина по сравнению с контрольной группой. (Вторая половина дня, задним макулы).
Рисунок 6. Ацетилированный окрашивания тубулина эмбрионов на 3 денье с контролем морфолино. (А) эмбрионов без какого-либо лечения показал сильную ацетилированного окрашивания тубулина в задней макулы (вторая половина дня) и обширные иннервации. (B) эмбрионов вводят контроль морфолино. (C) эмбрионов получавших только электропорации. (D) Управление эмбриона с контролем морфолино вводили и электропорации имеет одинаковый уровень ацетилированного тубулина в задней макулы и иннервации по сравнению с отсутствием лечения контроль.
Discussion
Мы успешно внедрили МО антисмысловых олигонуклеотида в ухо 24 эмбрионов данио HPF. Эмбрионы, которые были поставлены после инъекции и электропорации были жизнеспособными. Если эмбрионов выжили электропорация, они выросли по обычным ставкам по сравнению с эмбрионами, которые не получали лечения, а также эмбрионы, которые только были введены и эмбрионов, которые были только электропорации.
Мы наблюдали эффект MIF и MIF-МО, как после инъекции уха и электропорация с помощью маркировки с фаллоидином и ацетилированного тубулина. Фаллоидином окрашивания актиновых филаментов в волосковых клеток задней макулы указывает, что электропорации MIF и MIF-MO, как в 24-HPF этапе вызванные изменениями в волосковых клеток и / или стереоцилий номера по сравнению с эмбрионами, которые только вводят МО (рис. 3). Это снижение численности волосковых клеток согласуется с выводами Шень и соавт. (Представлено), что МО в MIF и MIF-как причина сокращения числа волосковых клеток в саккулярной макулы. Снижение численности волосковых клеток в эмбрионы, которые были введены с МО и электропорации продемонстрировать, что электропорации может помочь в продвижении МО через клеточную мембрану, тем самым повышая степень морфологические эффекты по сравнению с эмбрионами, в котором слуховым пузырьком только вводили. Изменения в морфологии statoacoustic ганглия наблюдали через ацетилированного окрашивания тубулина. Степени иннервации по statoacoustic ганглия пострадал, так как эмбрионы, которые были введены и электропорации шоу снизилась ветвление нейритов (рисунок 5). Там также может быть уменьшен конденсации ганглиозных клеток и / или снижение количества ганглиозных клеток, так как ацетилированный окрашивания тубулина значительно уменьшились в эмбрионов, которые были и вводят и электропорации. Потому что MIF было показано, что иметь решающее значение для развития нервной системы (Suzuki и соавт., 2004), изменения, наблюдаемые после электропорации может быть результатом увеличения трансфекции и MIF MIF-MO, как раствор в нейробластов клеток.
Электропорация антисмысловых олиго morpholinos непосредственно в развивающихся тканей является полезным инструментом для управления экспрессию гена в процессе развития, что ткани, оба во времени и пространстве, в зародыше. Электропорация Мифа и MIF-МО, как в ткани внутреннего уха в результате ненормальной морфологии оба задних макулы и statoacoustic ганглия. Существовал сокращение числа волосковых клеток в задней макулы у эмбрионов, которые были введены и электропорации по сравнению с эмбрионами, которые не получали лечения или эмбрионов, которые были либо только вводят или только электропорации. Существовал также снижение степени иннервации задних сенсорных патч statoacoustic ганглия и размер SAG. Электропорация является ценным методом трансфекции макромолекул в конкретной ткани, с выгодой для наблюдения первичных эффектов, что особенно ДНК, РНК, или МО в нужной ткани и дискриминацию их от вторичных эффектов на другие ткани, в том числе головного мозга, нервного гребня и околоушный мезенхимы на внутреннее развитие уха (Barald и Келли, 2004).
Disclosures
Производство статье был организован Гена Сервис ООО, которые производят реагенты, упомянутые в видео и текста.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами фонда исследований Глухота к Yc S и NSF (IOS 0930096) на КФБ.
КФБ: NIH / NINDCD 2 RO1 DC04184, 3R01DC004184-08W1 , NSF DBI 0832862, 0930096 NSF IOS
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sutter P-97 electrode puller | Equipment | |||
| PV820 Pneumatic PicoPump | Equipment | World Precision Instruments, Inc. | ||
| M3301L Manual Micromanipulator | Equipment | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Leica S6D stereomicroscope | Equipment | |||
| Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator | Equipment | |||
| Olympus FV500 confocal microscope | Equipment | |||
| 0.01 inch Platinum Wire | Supply | A-M Systems | 711000 | |
| Shrink Tubing | Supply | Newark Inc | 03F3172 | |
| Socket Crimp Terminal | Supply | Digi-Key | 82PECT-ND | |
| Capillaries | Supply | Stoelting Co. | 50613 | |
| Modeling clay | Supply | |||
| Plastic 100 mm Petri dishes | Supply | Falcon BD | ||
| 6 well plastic plates | Supply | Falcon BD | ||
|
||||
References
- Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).
- Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development. J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).
- Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. From placode to polarization: new tunes in inner ear development. Development. 131, 4119-4135 (2004).
