Enjeksiyon ve Elektroporasyon Zebra balığı Otocyst içine MIF Morpholinos Stoktan teslim İç Kulak Geliştirme etkiler

Summary

24hpf zebrafish otocyst doğrudan morpholinos sunmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Otik vezikül ve penetrasyon etkisi elektroporasyon lümenine morpholinos, mikroenjeksiyon, morpholinos beyin üzerinde etkisi atlayacak ve iç kulak özgü efektler elde etmek mümkün.

Abstract

Son yıllarda, elektroporasyon, göz, beyin, ve zebrafish, hücre grubu da dahil olmak üzere çeşitli dokular, içine, DNA, RNA ve morpholinos in vivo transfeksiyon için popüler bir yöntem haline gelmiştir . Elektroporasyon genetik manipülasyon diğer yöntemlere göre avantajı belirli dokuları, elektrik akımı uygulanması makromoleküllerin tanıtımı için, hem mekansal ve zamansal olarak, hedefli olabilir ki. Burada mif zebrafish gelişmekte olan iç kulağın dokularına ve mif gibi morpholinos transfecting elektroporasyon kullanımı açıklanmaktadır. Geçmiş çalışmalarda, mif morfolino 1 embriyolar içine enjekte - 8-hücreli aşamaya yaygın morfolojik değişikliklerin yanı sıra, sinir sistemi ve göz kulak sonuçlandı. Geliştirme sonraki aşamada iç kulak dokuları belirleyerek, diğer dokulara etkisi sonucu ikincil etkileri aksine, gelişmekte olan iç kulak MIF birincil etkileri belirleyebilirsiniz. Nöronlar, nöronal süreçleri ve arka makula ile ilişkili saç hücrelerinin morfolojisini incelemek için boyama Phalloidin ve asetillenmiş tubulin kullanarak, zebrafish iç kulak hedeflenen transfeksiyon için bir yöntem olarak elektroporasyon etkinliğini değerlendirmek mümkün. 24hpf embriyoların otik vezikül morpholinos ve electroporated enjekte edildi ve daha sonra hiçbir tedavi almış veya sadece enjekte veya electroporated olmuştu embriyoların karşılaştırıldı. Enjekte ve electroporated Embriyolar, saç hücre sayıları bir azalma olduğunu gösterdi statoacoustic ganglion (SAG) ve kontrol grupları ile karşılaştırıldığında daha az SAG nöronlar tarafından innervasyon azaldı. Sonuçları, daha sonraki aşamada otocysts içine morpholinos doğrudan teslim non-spesifik bir sinir sistemi ve nöral krest etkileri 1-8 hücre aşamasında teslim morpholinos önler olduğunu gösterdi. Ayrıca, iç kulak ve beyin, nöral krest veya periotic mezenşimin birincil etkileri kulak değil ikincil etkileri yönlendirilir etkilerinin incelenmesi.

Protocol

1. Elektroporasyon için Elektrotlar yapma

1. Kes uygun uzunluğu 75 mikron çaplı tungsten tel (AM Systems, Inc Carlsborg, WA) (yaklaşık 3-5 cm)
2. Molex kablo konektörü (pin damgalı pirinç) ile tungsten tel koyun
3. Sarın tungsten teller ve shrink boru (SPC Technology, Chicago, IL) ve Bunsen beki veya ısı tabancası ile daralan boru tel mühür ısı uygulamayın molex kablo konektörü
4. Tungsten tel ucu keskinleştirmek için, 1.0 N Sodyum hidroksit içine tel daldırma (Conrad ve ark 1993) ve diğer elektrot olarak bir ataş kullanarak, Kare Dalga Elektroporatör tel elektrolizi. Kullandığımız koşulları bakliyat arasında her biri 50 ms ile 100 ms 5 50 Volt bakliyat. Elektrotlar 15-20 mm çapa kadar bilenmiş olmalıdır
5. Elektroporasyon kullanmak için önce kil modelleme halinde preslenmiş oluklar içinde bir tepsi tel tutun

2. Elektroporasyon İstasyonu Kurma

1. Teyp mikromanipülatörler (Dünya Hassas aletler) 75μm tungsten elektrot bilenmiş.
2. Diseksiyon mikroskobu aşamasında (Leica) her iki tarafında yerleştirin mikromanipülatörler.
3. Koru CUY-21 Düzenle Kare Dalga Elektroporatör (Şekil 1) elektrotlar bağlayın.
4. Elektroporatör açın ve elektroporasyon Parametreler, gerilim, darbe süresi ve bakliyat sayısı da dahil olmak üzere ayarlayabilirsiniz. Bu deneme için en etkili parametrelerin her biri Her darbe arasında 100ms ile, 5.0ms süren üç adet 13-volt bakliyat bulundu. Elektroporasyon embriyo hava kabarcıkları oluşturur, darbe süresini azaltır.

3. Zebra balığı Kulakla veziküllü içine Morpholinos Mikroenjeksiyon

1. Hasat zebrafish embriyoların üreme tankından. Embriyolar embriyo-yükselterek ° C gecede 28.5 0.3 PPM metilen mavisi (Westerfield 2005) orta inkübe.
2. Sutter P-97 elektrot çektirmesi ile cam iğneler çekin
3. Bir agaroz jel tabanı (10 mm Petri kabında balık su içinde% 1 agaroz) - 37 ° C su banyosunda Isınma
4. Balık suda ısı% 1 düşük erime noktası agaroz (LMPA) kadar erimiş ve 37 ° C su banyosunda sıcak tutmak.
5. Bir morfolino çözüm (GeneTools, Corvallis, OR) ile doldurun ve bir bardak iğne ucu uygun çap kesmek. Bir iğne bir micromanipulator (Kuhn) üzerine monte edin.
6. Yaklaşık 10 mm iğne ucu kesin ve ucu morfolino çözüm yeterli teslim imkân vermesini sağlamak için madeni yağ içine enjekte edilir.
7. 24 saat postfertilization (hpf) embriyolar Dechorinate ve 0.3 PPM metilen mavisi balık su MS222 (tricaine Sigma) ile onları uyutmak.
8. Uygun üniforma analizi için sağ tarafında agaroz jel tabanı üzerine 3 ila 5 anestezi embriyolar hizalayın
9. Her embriyo üzerinde% 1 LMPA 1 ile 2 damla koyun ve izin yer embriyo düzeltmek için kuvvetlendirmek
10. Otik vezikül sağ tarafta böylece Petri çanağı
11. Otik vezikül lümen içine iğne yerleştirin ve bağlı bir nitrojen tankı (Şekil 2) ile morfolino çözüm PV820 Pnömatik PicoPump (Dünya Hassas Aletler) enjekte.

4. Elektroporasyon Prosedürü

1. Hemen enjeksiyondan sonra elektroporasyon istasyona monte embriyolar Taşı
2. Otik vezikül sadece arka doku üzerine pozitif elektrot yerleştirin, fakat sadece otik vezikül ön beyin içine nüfuz etmez; negatif elektrot eklemek
3. Bir ayak pedalı veya bir anahtar basarak kullanarak uygulayın.
4. Agaroz balık su dökün ve dönen ve bir cam pipet ile agaroz embriyolar kaldırmak. Embriyoların zarar vermemek için dikkatli kullanın. Kaldırmak için zor olan embriyo, embriyonun çevresindeki herhangi bir LMPA hafifçe kurtulmak için bir iğne kullanın.
5. Embriyolar, metilen mavisi balık su ve analiz için istenen aşamaları (in situ hibridizasyon, etc ve mikroskopik anlaysis, immünohistokimyasal, morfolojik) embriyolar yükseltmek ile bir tabak koyun .

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1 Elektroporasyon istasyonu. Elektrotlar bilenmiş 75μm Tungsten teller kullanılarak yapılan ve bir koruyun CUY-21 Kare Dalga Düzenle Elektroporatör yol açar bağlı idi. Bu elektrotlar mikromanipülatörler bantlanmış.

Şekil 2. Enjeksiyon istasyonu. Tüm embriyolar standardizasyon amaçlar için sağ kulak içine enjekte edildi.

Şekil 3 3 dpf'e embriyolar aktin filamentler Phalloidin boyama. (A), 3 dpf'e embriyo injected kontrolü MO ile arka makula (pm) Phalloidin güçlü boyama vardır. (B) kontrolü MO ile enjekte edilir ve sonra electroporated oldu embriyo enjeksiyon sadece embriyolarda am Phalloidin boyama benzer seviyelerde vardı. Elektroporasyon birlikte mif katille enjeksiyon pm (D) Phalloidin boyama dramatik bir azalmaya neden olmuştur (C) yalnız otik vezikül mif katille Enjeksiyon, Phalloidin boyama azaltılması neden yoktu. am anterior makula.

Şekil 4, 5 dpf larvaları ile aktin filamentler Phalloidin boyama . Enjeksiyon arasında hiçbir fark sadece (A) ve standart kontrolü morfolino (B) elektroporasyon enjeksiyon. Ancak, mif morpholinos ve electroporated enjekte edilen 5 dpf larvaları sadece mif morpholinos (C enjekte edildi embriyo ile karşılaştırıldığında arka makula (pm) (D) 3 dpf'e daha olsa daha az dramatik Phalloidin boyama, azaltılmış gösterdi .) am anterior makula.

Şekil 5 embriyoların 3 dpf'e Asetillendirilmiş tubulin boyama. (A) embriyo herhangi bir enjeksiyon veya elektroporasyon almadı. (B) embriyo electroporated ama hiçbir enjeksiyon aldı. Embriyolar mif morpholinos enjeksiyon ve elektroporasyon (C, D) Her iki alan kontrol grubu ile karşılaştırıldığında gözle görülür bir şekilde azaldı tubulin boyama vardı. (Pm, arka makula).

Şekil 6 kontrolü morfolino 3 dpf'e embriyoların Asetillendirilmiş tubulin boyama. (A) herhangi bir tedavi olmadan Embriyo arka makula (pm) ve geniş innervasyon güçlü asetillenmiş tubulin boyama gösterdi. (B) Embriyo kontrolü morfolino ile enjekte edilir. (C) sadece elektroporasyon ile tedavi Embriyo. (D) enjekte edilir ve electroporated kontrolü morfolino Kontrol embriyo hiçbir tedavi kontrolü ile karşılaştırıldığında arka makula ve innervasyon asetillenmiş tubulin benzer seviyesi vardır.

Discussion

Biz başarıyla 24 hpf zebrafish embriyonun kulak içine antisens oligonükleotid katille girmiştik. Enjeksiyon ve elektroporasyon sonra toplandı Embriyolar yaşayabilir. Embriyoların elektroporasyon kurtuldu, onlar hiçbir tedavi yanı sıra, sadece enjekte edilen ve sadece electroporated olmuştu embriyolar olmuştu embriyolarda almıştı embriyolar göre normal fiyatla büyüdü.

Biz Phalloidin ve asetillenmiş tubulin ile etiketleme yoluyla kulak enjeksiyon ve elektroporasyon sonra mif ve mif gibi katille bir etki gözlenmemiştir. Posterior makula duyusal saç hücreleri aktin filamentler Phalloidin boyama saç hücresi ve / veya stereocilia numaraları sadece katille enjekte edildi embriyolar ile kıyaslandığında değişikliğe neden mif ve 24-hpf aşamada mif gibi MO bu elektroporasyon gösterir (Şekil 3). Bu azalma saç hücre sayıları Shen ve arkadaşlarının bulguları ile tutarlıdır. Katille mif ve mif gibi sakküler makula saç hücrelerinin sayısında bir azalmaya neden olduğu (gönderildi). Pratisyenler ve electroporated enjekte edildi embriyolar, bu elektroporasyon göstermek saç hücre sayıları azalmaya ve böylece otik vezikül sadece enjekte edildiği embriyoların karşılaştırıldığında morfolojik etkileri ölçüde artırarak, hücre zarından katille hareketli yardımcı olabilir. Asetillenmiş tubulin boyama yoluyla statoacoustic ganglion morfolojisi değişiklikler gözlenmiştir. Enjekte gösterisi neurites (Şekil 5) dallanma azalma electroporated embriyolar olarak statoacoustic ganglion innervasyon ölçüde etkilendi. Asetillenmiş tubulin boyama embriyolarda enjekte ve electroporated her ikisi de önemli ölçüde azalmış olması nedeniyle de, ganglion hücreleri ve / veya ganglion hücrelerinin sayısı azalmış yoğuşma vardır azalma olabilir. Mif, sinir sistemi gelişimi (Suzuki ve ark, 2004) için kritik olduğu gösterilmiştir Çünkü, mif ve mif gibi neuroblast hücrelerin içine MO çözüm. Artış transfeksiyon elektroporasyon sonra görülen değişiklikler sonucu olabilir

Doğrudan gelişmekte olan bir doku içine antisens oligo morpholinos Elektroporasyon embriyo doku gelişimi sırasında, hem de mekansal ve zamansal bir gen ifadesini kontrol etmek için yararlı bir araçtır. Mif ve benzeri iç kulak dokularına katille mif Elektroporasyon arka makula ve statoacoustic ganglion anormal morfoloji sonuçlandı. Embriyolar ile karşılaştırıldığında, ya sadece enjekte edilmiş ya da sadece electroporated embriyolarda ya da hiç tedavi almıştı enjekte electroporated olmuştu embriyolar arka makula duyusal saç hücrelerinin sayısında bir azalma vardı. Statoacoustic ganglion ve SAG boyutunu arka duyusal yama innervasyon derecesi bir azalma vardı. Elektroporasyon istenen dokuya, özellikle DNA, RNA, yada MO birincil etkilerinin gözlenmesi ve diğer dokular üzerindeki ikincil etkileri bu ayrımcı, beyin, nöral krest ve yararı, belirli dokulara makromoleküllerin transfecting için değerli bir yöntem iç kulak geliştirme periotic mezenşimin (Barald ve Kelley, 2004).

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Sutter P-97 electrode puller	Equipment
PV820 Pneumatic PicoPump	Equipment	World Precision Instruments, Inc.
M3301L Manual Micromanipulator	Equipment	World Precision Instruments, Inc.
Leica S6D stereomicroscope	Equipment
Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator	Equipment
Olympus FV500 confocal microscope	Equipment
0.01 inch Platinum Wire	Supply	A-M Systems	711000
Shrink Tubing	Supply	Newark Inc	03F3172
Socket Crimp Terminal	Supply	Digi-Key	82PECT-ND
Capillaries	Supply	Stoelting Co.	50613
Modeling clay	Supply
Plastic 100 mm Petri dishes	Supply	Falcon BD
6 well plastic plates	Supply	Falcon BD
MOs: 0.3 mM of a combination of for mif, mif-like MO1, and mif-like MO2 was used. Mif MO is complimentary to the start codon of zebrafish mif mRNA: 5’-acatcggcatgactgcgacagagat-3’. Two MOs were used for mif-like. mif-like MO1 is complimentary to the translational start site: 5’-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3’, while mif-like MO2 derived from AS sequence at the intron1/exon 2 boundary: 5’-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC-3’. Control MO was the scrambled nucleotide sequence from Gene Tools: 5’-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA- 3’. methylene blue (0.3 ppm) in fish water MS222 (tricaine, Sigma; 0.64 mM in fish water) Low-melting point agarose (LMPA; Roche) phenol red (Sigma) Anti-acetylated tubulin (Sigma) Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse second antibody (Molecular probes) Texas red-phalloidin (Molecular probes)