Summary
Nous fournissons une méthode pour tester des variantes du gène BRCA1 dans un essai de culture de tissus basées pour la réparation recombinaison homologue des dommages à l'ADN en appauvrissant protéine BRCA1 endogène à partir d'une cellule à l'aide d'ARNi et le remplacer par un mutant BRCA1 points qui contient un changement de codage.
Abstract
L'analyse fonctionnelle des mutations faux-sens peut être compliquée par la présence dans la cellule de la protéine endogène. Structure-fonction des analyses des gènes BRCA1 ont été compliquées par l'absence d'un test robuste pour la protéine BRCA1 pleine longueur et les difficultés inhérentes à travailler avec des lignées cellulaires qui expriment la protéine BRCA1 hypomorphes 1,2,3,4,5. Nous avons développé un système dans lequel la protéine BRCA1 endogène dans une cellule a été gravement appauvris par RNAi ciblant le 3'-UTR de l'ARNm du gène BRCA1 et remplacé par co-transfection d'un plasmide exprimant un variant du gène BRCA1. Un avantage de cette procédure est que la réduction au silence aiguë de remplacement BRCA1 et simultanées permettent aux cellules de se développer sans des mutations secondaires ou des adaptations qui pourraient survenir au cours du temps pour compenser la perte de fonction du gène BRCA1. Cet appauvrissement et d'add-back procédure a été fait dans une lignée de cellules HeLa-dérivé qui a été facilement analysés pour l'activité de recombinaison homologue. Le test de recombinaison homologue est basée sur une méthode précédemment publiée par lequel un substrat de recombinaison est intégré dans le génome (figure 1) 6,7,8,9. Ce substrat recombinaison a le rare coupe le site I-Scel enzyme de restriction à l'intérieur d'un allèle GFP inactif, et se trouve en aval d'un allèle GFP secondes inactif. La transfection du plasmide qui exprime I-Scel résultats dans une cassure double brin, qui peuvent être réparées par recombinaison homologue, et si la recombinaison homologue ne réparer la cassure il crée un allèle GFP active qui est facilement obtenu par cytométrie en flux pour l'expression protéique GFP . L'appauvrissement de BRCA1 endogènes conduit à une réduction de 8 à 10 fois dans l'activité de recombinaison homologue, et des add-arrière de type sauvage fonction de plasmide de recombinaison homologue entièrement restauré. Lorsque les mutants point spécifique de BRCA1 pleine longueur ont été exprimés à partir de co-transfecté les plasmides, l'effet du mutant faux-sens spécifique pourrait être marqué. À titre d'exemple, l'expression des gènes BRCA1 (M18T) des protéines, une variante de la signification clinique inconnue 10, a été exprimée dans ces cellules, il a échoué à restaurer BRCA1-dépendant recombinaison homologue. En revanche, l'expression d'une autre variante, également d'importance inconnue, BRCA1 (I21V) entièrement restauré BRCA1-dépendante la fonction de recombinaison homologue. Cette stratégie de test de la fonction des mutations faux-sens du gène BRCA1 a été appliquée à un autre système biologique pour la fonction de titrage centrosome (Kais et al, observations non publiées). Globalement, cette approche est appropriée pour l'analyse des mutants faux-sens dans un gène quelconque qui doit être analysé de façon récessive.
Protocol
1. Cell Line avec un substrat recombinaison intégré
- Les cellules HeLa ont été transformées de façon stable avec le PDR-GFP (plasmide 7 don de M. Jasin, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) et maintenu dans la puromycine pour la sélection des transformants.
- Les cellules sont repiquées dans du DMEM / FBS, contenant 10% de sérum fœtal bovin, 2 mM glutamax, pyruvate de sodium 1 mM, pénicilline / streptomycine (100 UI / mL/0.1 mg / mL), et 1,5 ug / ml de puromycine.
Le substrat de recombinaison dans le PDR-GFP plasmide, et dans des transformants stables, contient deux allèles inactifs de la GFP (figure 1). Un allèle est inactif en raison de l'inclusion dans sa séquence codante du site de restriction 18 pb de reconnaissance d'enzymes pour I-Scel. Expression de I-Scel dans ces cellules crée une cassure de l'ADN double-brin (DSB). Il ya un deuxième allèle de la GFP inactif sur cet ADN, mais la partie de sa séquence en corrélation avec le site I-Scel sur le premier allèle est de type sauvage. Cet allèle GFP seconde peut fonctionner comme un donneur de séquence pour la réparation de recombinaison homologue de l'ORD et se traduirait par un allèle GFP active, qui est facilement détectée par cytométrie en flux. Alternativement, l'ORD pourrait être réparé par non homologues fin de rejoindre, ce qui détruirait le site de restriction I-Scel et se traduirait par la GFP cellules négatives. Le niveau de la recombinaison homologue dans une cellule est déterminée en comptant le pourcentage de cellules positives pour la GFP.
Cette lignée cellulaire, pHeLa-DR13-9, a été sélectionné parmi tous les clones de zéro du signal GFP de fond et un pourcentage relativement élevé de la GFP de cellules positives à la transfection avec le I-Scel plasmide exprimant, pCBASce. (Le pCBASce et son contrôle des vecteurs, pCAGGS, ont tous deux été fournies par M. Jasin du Centre Memorial Sloan-Kettering Cancer.)
La ligne de cellules HeLa-DR13-9 cellules est disponible auprès des auteurs sur demande.
2. La transfection du gène BRCA1 au appauvrissent endogène et Retour Ajouter BRCA1 mutant.
- Le jour avant la transfection première (généralement un mardi): Commencer avec un plat de 10 cm de cellules HeLa-DR13-9 cellules au moins 90% de confluence.
- Trypsiniser dans 1 ml et arrêter la réaction en ajoutant 9 ml de DMEM / FBS, bien mélanger par pipetage.
- Ajouter 40 ul de cellules trypsinisées par puits d'une plaque à 24 puits dans 0,5 ml de DME / FBS.
- Jour 1 transfections (mercredi): les cellules doivent être confluentes ~ 40-50%, si bien moins recommencer. Transfecter en mélangeant: 5 + 0,3 pmol siARN ug BRCA1 mutantes exprimant l'ADN plasmidique de 12,5 uL Opti-MEM et 0,5 uL Lipofectamine 2000 à 12,5 uL Opti-MEM. Procéder à la transfection selon le protocole Lipofectamine (Invitrogen).
- Remplacer les 4-6 heures plus tard, les médias. Le siRNA nous utilisons pour épuiser BRCA1 est basé sur la séquence spécifiant GCUCCUCUCACUCUUCAGU BRCA1 3'-UTR séquences 80780 au 80798 (numéro d'accession AY273801).
- Jour 2: Transfert des cellules par trypsinisation de la plaque de 24 puits d'une plaque à 6 puits.
- Jour 3 transfections: 25 pmol siARN + 0,75 ug BRCA1 mutantes exprimant l'ADN plasmidique + 0,75 pCBASce ug (ou pCAGGS lutte antivectorielle) dans 62,5 uL Opti-MEM et 2,5 uL Lipofectamine 2000 à 62,5 uL Opti-MEM. Remplacer les 4-6 heures plus tard, les médias.
3. L'analyse de transfectants.
- Au jour 6, trypsiniser cellules de chaque puits et d'arrêter dans 1 ml de DMEM / FBS. L'analyse des cellules pour expression de la GFP peut être fait sur 5 ou 7 jours, mais nous constatons que 6 jours qui fonctionne le mieux.
- Analyser 10.000 cellules par puits par cytométrie en flux. Nous utilisons un Becton Dickinson FACSCalibur instrument dans l'Ohio State University Comprehensive Cancer Centre de cytométrie analytique ressource partagée. Simple, les cellules vivantes sont déclenchés en utilisant les paramètres de dispersion avant et latérale. GFP-positives cellules sont détectées à l'aide du détecteur de fluorescence de la GFP (FL1), et les résultats sont présentés sous forme d'histogramme (figure 2, en bas).
- Gauche sur les cellules peuvent être réensemencées pour la photographie par microscopie à fluorescence, si désiré.
4. Les résultats représentatifs:
BRCA1 régule la voie pour la réparation des cassures double brin par recombinaison homologue 6,11. Les cellules qui ont subi la réparation par recombinaison homologue sont facilement détectés par microscopie à fluorescence (figure 2, en haut). Épuisement des résultats BRCA1 dans une diminution de la GFP-positives détectées cellules (Figure 2, droite). La sortie de la FACSCalibur est un histogramme avec une intensité GFP par cellule sur l'axe X et le nombre de cellules sur l'axe Y (figure 2, en bas). Dans un ensemble typique de résultats d'une expérience unique, 15,5% des cellules GFP-positives ont été, après I-Scel expression et le contrôle ARNi épuisement (figure 3). Par comparaison, l'épuisement des gènes BRCA1 et vecteur de rajouter réduite GFP de conversion à 0,7%. Ajouter-arrière de type sauvage du gène BRCA1 ou du gène BRCA1 (I21V) entièrement restauré recombinaison homologue, détectée par l'obtention de 15-16% de cellules positives GFP. Réintégration des gènes BRCA1 (M18T) mutant (figure 3, ligne 5) a le même effet que l'add-back de la commande vectorielle. Depuis cette variante exprimée à des niveaux similaires à la protéine endogène 9, nous avons donc interpréter les gènes BRCA1 (M18T) variante est non-fonctionnel dans la recombinaison homologue.
Nous avons généralement 10-20% des cellules GFP-convertir en positif après transfection l'expression I-Scel plasmide. L'appauvrissement de BRCA1 diminue de façon reproductible la conversion de la GFP-positives cellules par environ 8-10 fois. Bien que les pourcentages réels de la GFP-positives cellules peuvent changer d'une expérience à l', le ratio de la GFP de cellules positives suite à l'épuisement du gène BRCA1 par rapport à l'épuisement de contrôle au sein d'une expérience est tout à fait cohérente. Nous normalisons les résultats en réglant le taux de conversion désinhibé à 100% et les résultats expriment avec déplétions BRCA1 et ajoutez-dos sous forme de pourcentages. De cette façon, nous pouvons combiner de multiples expériences, et la variation expérimentale n'est pas élevé.
Rajouter des mutants BRCA1 ont jusqu'ici donné des résultats robustes: chaque variante du gène BRCA1 est soit entièrement restauré homologues activité de recombinaison ou n'a eu aucun effet. Une considération importante dans l'obtention de ces résultats est que nos conditions de transfection de produire des niveaux de protéine BRCA1 qu'environ égale à la concentration de la protéine endogène dans les cellules non traitées. Trop haut d'une surexpression de même un mutant défectueux du gène BRCA1 peut entraîner une certaine activité de recombinaison homologue positif.
Un problème que nous avions besoin pour surmonter était la toxicité de la transfection. L'appauvrissement de BRCA1 se peut ralentir la croissance des cellules, et l'équilibre de l'ADN Lipofectamine-2000 et le plasmide par rapport au nombre de cellules sur le plat doit être maintenue à un niveau constant. L'ADN Trop Lipofectamine ou plasmide réduira le nombre de cellules, et le nombre de cellules seront insuffisants pour obtenir des résultats fiables cytométrie en flux. Le solde du plasmide et réactifs Lipofectamine versus le nombre de cellules transfectées est assez important pour maintenir la viabilité des cellules.
Figure 1. Le substrat de recombinaison. La stratégie qui avait été développé par le groupe de M. Jasin 7,12 est représenté. Le PDR-GFP plasmide contient deux allèles défectueux de la GFP, dont l'un contient un site I-Scel endonucléase de restriction. Une ligne de cellules HeLa dérivé contient ce substrat ADN intégré dans un site unique dans le génome 9 et réparation active de la rupture d'ADN double-brin au site I-Scel par les résultats de recombinaison homologue dans la conversion d'un allèle à la GFP-positives.
Figure 2. Détection de la GFP-positives cellules par microscopie à fluorescence. Les cellules ont été testées selon ce protocole, et le contrôle appauvri cellules ont été actifs dans la recombinaison homologue, détectée par un pourcentage élevé de cellules avec des expression de la GFP (à gauche). L'appauvrissement de BRCA1 par les résultats ARNi dans une forte diminution du nombre de cellules positives pour la GFP (à droite).
Figure 3. Résultats d'un add-back de mutants faux-sens du gène BRCA1. Les résultats d'une seule expérience sont présentés dans cet histogramme. En l'absence de transfectées I-Scel plasmide exprimant (piste 1) il n'ya pas de cellules GFP-positives détectées. Les résultats dans les couloirs 2-6 ont toutes été prises à partir des cellules dans lesquelles l'I-Scel exprimer plasmide a été transfecté le jour 3. Dans les cellules qui ont été épuisés pour un gène non pertinentes (luciférase) et avec le vecteur add-back, 15,5% des cellules étaient positives GFP (piste 2). L'épuisement des gènes BRCA1 et vecteur add-back révèle l'effet de la perte de BRCA1 sur la recombinaison homologue (piste 3). Les effets de l'appauvrissement des gènes BRCA1 et ajoutez-arrière de type sauvage du gène BRCA1 (piste 4), BRCA1 (M18T) (piste 5), et du gène BRCA1 (I21V) (piste 6) sont présentés. Ces résultats sont issus d'une seule expérience, et serait associée à au moins deux expériences se répètent plus, afin d'obtenir une mesure de la recombinaison homologue soutenu par une protéine BRCA1 mutant donné.
Discussion
L'avantage de cette méthode est que nous pouvons étudier la fonction de la protéine BRCA1 dans la régulation de réparation de l'ADN par recombinaison homologue en utilisant des cellules qui ont de type sauvage du gène BRCA1 endogène exprimé. Nous avons adopté deux séparés des méthodes établies de l'étude des processus de recombinaison homologue et d'utiliser l'ARNi médiation pour obtenir la déplétion nouvelle méthode pour tester des variantes du gène BRCA1 pour la fonction de réparation de l'ADN. La clé de la réussite de cette méthode a été d'établir une lignée cellulaire facilement transfectables, comme les cellules HeLa, avec le substrat de recombinaison dans le génome de telle sorte que nous obtenons des niveaux très élevés de conversion GFP. Nous avions projeté de multiples clones de la transformation originale afin d'obtenir un qui n'avait pas de signal de fond détectable GFP, mais sur la transfection de l'expression I-Scel plasmide avait un niveau très élevé de conversion GFP.
Avec cette méthode, nous étudions actuellement d'autres résidus spécifiques du gène BRCA1 acides aminés pour fonctionner dans la recombinaison homologue. Avec les connaissances biologiques à partir de ce travail, ces conclusions peuvent être appliquées à la génétique clinique sur le cancer. Un pourcentage élevé de mutations faux-sens du gène BRCA1 ont inconnus signification clinique car il ya beaucoup de variantes rares et les informations sont insuffisantes pour beaucoup de ces afin de déterminer l'association du cancer par l'analyse de ségrégation génétique 3,10,13,14. En utilisant cette méthode, les conséquences d'une variante spécifique sur la fonction biologique des gènes BRCA1 dans la régulation de la recombinaison homologue pourrait être utilisée pour informer les femmes qui portent l'une de ces variantes dans leur génome.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants au Centre de l'Ohio State University Comprehensive Cancer de fournir un financement pour ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960 | |
| FBS | USA Scientific, Inc. | 9871-5200 | |
| siRNA | Invitrogen | N/A | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12604 | |
| Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
- Carvalho, M. A. Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis. Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).
- Couch, F. J. Genetic epidemiology of BRCA1. Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).
- Couch, F. J. Assessment of functional effects of unclassified genetic variants. Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).
- Tomlinson, G. E. Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier. Cancer Res. 58, 3237-3242 (1998).
- Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).
- Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. Brca1 controls homology-directed DNA repair. Mol Cell. 4, 511-518 (1999).
- Nakanishi, K. Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1110-1115 (2005).
- Pierce, A. J. Double-strand breaks and tumorigenesis. Trends Cell Biol. 11, 52-59 (2001).
- Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E., Parvin, J. D. Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination. Cancer Res. 70, 988-995 (2010).
- Easton, D. F. A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes. Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).
- Snouwaert, J. N. BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene. Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).
- Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells. Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).
- Spearman, A. D. Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance. J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).
- Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance. Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).
