Summary
हम आरएनएआई का उपयोग कर कक्ष से घट अंतर्जात बीआरसीए 1 प्रोटीन और यह एक बीआरसीए 1 बिंदु उत्परिवर्ती है कि एक कोडन परिवर्तन होता है के साथ जगह एक टिशू कल्चर डीएनए की क्षति के मुताबिक़ पुनर्संयोजन की मरम्मत के लिए आधारित परख में बीआरसीए 1 वेरिएंट के परीक्षण के लिए एक तरीका प्रदान करते हैं.
Protocol
1. सेल लाइन के साथ एक एकीकृत पुनर्संयोजन सब्सट्रेट
- HELA कोशिकाओं stably PDR-GFP (एम. Jasin, मेमोरियल स्लोअन-Kettering कैंसर केंद्र से प्लाज्मिड उपहार 7) के साथ बदल रहे थे और transformants के चयन के लिए puromycin में बनाए रखा.
- कोशिकाओं DMEM / FBS में passaged कर रहे हैं, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी GlutaMAX, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 यू mL/0.1 मिलीग्राम / एमएल /), और 1.5 puromycin / स्नातकीय एमएल युक्त.
पुनर्संयोजन सब्सट्रेट, प्लाज्मिड, और स्थिर transformants में PDR-GFP में GFP के दो alleles के निष्क्रिय (चित्रा 1) शामिल हैं. एक एलील 18 बीपी मैं SceI के लिए प्रतिबंध एंजाइम मान्यता साइट के कोडन अनुक्रम में शामिल किए जाने की वजह से निष्क्रिय है. मैं इन कोशिकाओं में SceI की अभिव्यक्ति एक डीएनए डबल असहाय (DSB) को तोड़ने बनाता है. इस डीएनए पर निष्क्रिय GFP के एक दूसरे एलील है, लेकिन मैं SceI पहली एलील साइट पर के साथ सहसंबद्ध अपने अनुक्रम के भाग जंगली प्रकार है. यह दूसरा GFP एलील मुताबिक़ DSB के पुनर्संयोजन की मरम्मत के लिए एक दृश्य दाता के रूप में कार्य कर सकते हैं और एक सक्रिय GFP एलील, जो आसानी से प्रवाह cytometry द्वारा पता चला है पर नतीजा होगा. वैकल्पिक रूप से, DSB nonhomologous अंत में शामिल होने, जो मैं SceI प्रतिबंध साइट को नष्ट और GFP नकारात्मक कोशिकाओं में परिणाम होगा द्वारा मरम्मत किया जा सकता है. किसी कक्ष में मुताबिक़ पुनर्संयोजन के स्तर GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना के द्वारा निर्धारित किया जाता है.
इस सेल लाइन pHeLa-DR13 9, सभी क्लोनों के बीच शून्य पृष्ठभूमि GFP संकेत और अभिकर्मक पर मैं SceI के साथ GFP पॉजिटिव कोशिकाओं प्लाज्मिड pCBASce व्यक्त की एक अपेक्षाकृत उच्च प्रतिशत के लिए चुना गया था. (PCBASce और उसके वेक्टर नियंत्रण, pCAGGS, दोनों एम. Jasin मेमोरियल स्लोअन-Kettering कैंसर केंद्र के द्वारा आपूर्ति की गई.)
HeLa-DR13 9 सेल लाइन लेखकों से अनुरोध पर उपलब्ध है.
2. अभिकर्मक अंतर्जात बीआरसीए 1 व्यय करने के लिए और वापस उत्परिवर्ती बीआरसीए 1 जोड़ें.
- पहले अभिकर्मक (आमतौर पर एक मंगलवार) के पहले दिन: HeLa-DR13-9 कोशिकाओं को कम से कम 90% मिला हुआ एक 10 सेमी पकवान के साथ शुरू करो.
- 1 एमएल में Trypsinize और 9 एमएल DMEM / FBS जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो, pipetting द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से.
- Trypsinized कोशिकाओं के 40 μL प्रति अच्छी तरह से एक 24 DME / FBS की 0.5 एमएल में अच्छी तरह से थाली जोड़ें.
- दिवस 1 (बुधवार) transfections: कोशिकाओं ~ 40-50% मिला हुआ हो, अगर बहुत कम पर शुरू करना चाहिए. Transfect मिश्रण द्वारा: 5 pmol siRNA + 0.3 स्नातकीय बीआरसीए 1 उत्परिवर्ती 12.5 μL Opti-सदस्य में प्लास्मिड डीएनए व्यक्त; और 0.5 12.5 μL Opti-सदस्य में μL 2000 Lipofectamine. Lipofectamine प्रोटोकॉल (Invitrogen) के अनुसार अभिकर्मक के साथ आगे बढ़ें.
- मीडिया 4-6 घंटे बाद बदलें. हम बीआरसीए 1 खलाना उपयोग siRNA अनुक्रम ८०७९८ (परिग्रहण AY273801 नंबर) बीआरसीए 1 3'-UTR 80,780 दृश्यों को निर्दिष्ट GCUCCUCUCACUCUUCAGU पर आधारित है.
- दिन 2: 24 अच्छी तरह से थाली से एक छह अच्छी तरह से थाली trypsinizing कोशिकाओं स्थानांतरण.
- Pmol 25 + siRNA 0.75 स्नातकीय बीआरसीए 1 उत्परिवर्ती प्लास्मिड डीएनए व्यक्त + 0.75 62.5 μL Opti-सदस्य और 62.5 μL Opti-सदस्य में 2.5 μL Lipofectamine 2000 में स्नातकीय pCBASce (या pCAGGS वेक्टर नियंत्रण): दिवस 3 transfections. मीडिया 4-6 घंटे बाद बदलें.
3. Transfectants का विश्लेषण.
- 6 दिन, प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं trypsinize और 1 एमएल DMEM / FBS में बंद करो. दिन 5 या 7 पर GFP अभिव्यक्ति के लिए कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन हम उस दिन 6 काम करता है सबसे अच्छा लगता है.
- प्रवाह cytometry द्वारा अच्छी तरह से प्रति 10,000 कोशिकाओं का विश्लेषण करें. हम ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी व्यापक कैंसर केंद्र विश्लेषणात्मक Cytometry साझा संसाधन में एक Becton Dickinson FACSCalibur साधन का उपयोग करें. सिंगल, जीवित कोशिकाओं आगे और पक्ष स्कैटर मापदंडों का उपयोग gated हैं. GFP पॉजिटिव कोशिकाओं GFP प्रतिदीप्ति डिटेक्टर (FL1) का उपयोग कर पता चला रहे हैं, और परिणाम एक हिस्टोग्राम (चित्रा 2 नीचे) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं.
- वाम से अधिक कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा फोटोग्राफी के लिए replated किया जा सकता है है अगर वांछित.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
बीआरसीए 1 मुताबिक़ 6,11 पुनर्संयोजन द्वारा डबल असहाय डीएनए टूट की मरम्मत के लिए मार्ग को नियंत्रित करता है . उन कोशिकाओं जो मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा मरम्मत आया है प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2, शीर्ष) द्वारा आसानी से पता चला रहे हैं. पता चला GFP सकारात्मक कोशिकाओं (चित्रा 2, सही) में कमी बीआरसीए 1 परिणामों के रिक्तीकरण. FACSCalibur से उत्पादन X-अक्ष और y अक्ष (चित्रा 2, नीचे) पर कोशिकाओं की संख्या पर सेल प्रति GFP तीव्रता के साथ हिस्टोग्राम है. एक ही प्रयोग से परिणाम की एक विशिष्ट सेट में, कक्षों की 15.5% मैं SceI अभिव्यक्ति और नियंत्रण आरएनएआई रिक्तीकरण (चित्रा 3) के बाद GFP पॉजिटिव थे. तुलना करके, बीआरसीए 1 और सदिश की कमी वापस 0.7% करने के लिए जोड़ने GFP-रूपांतरण कम. जोड़ें वापस जंगली - प्रकार बीआरसीए 1 या बीआरसीए 1 (I21V) पूरी तरह से बहाल मुताबिक़ पुनर्संयोजन के, के रूप में 15-16% GFP-सकारात्मक कोशिकाओं प्राप्त करने के द्वारा पता चला. जोड़ें वापस बीआरसीए 1 (M18T उत्परिवर्ती) (चित्रा 3, 5 लेन) के रूप में वेक्टर नियंत्रण के ऐड वापस समान प्रभाव था. चूंकि इस प्रकार अंतर्जात 9 प्रोटीन के रूप में समान स्तर पर व्यक्त की, हम इस तरह बीआरसीए 1 संस्करण (M18T) मुताबिक़ पुनर्संयोजन में गैर कार्यात्मक है व्याख्या .
हम आम तौर पर कोशिकाओं के 10-20% है मैं - SceI अभिव्यक्ति प्लाज्मिड transfecting बाद GFP पॉजिटिव कन्वर्ट करने के लिए. बीआरसीए 1 के रिक्तीकरण reproducibly GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के रूपांतरण के बारे में 8-10 गुना द्वारा कम कर देता है. हालांकि GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के वास्तविक प्रतिशत एक प्रयोग के भीतर नियंत्रण कमी के रिश्तेदार रिक्तीकरण बीआरसीए 1 के बाद प्रयोग से प्रयोग, GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के अनुपात बदल सकता है काफी संगत है. हम 100% और बीआरसीए 1 प्रतिशत के रूप में और depletions ऐड - पीठ के साथ व्यक्त परिणाम uninhibited रूपांतरण दर की स्थापना द्वारा परिणाम सामान्य है. इस तरह, हम कई प्रयोगों गठबंधन कर सकते हैं, और प्रयोगात्मक भिन्नता नहीं उच्च है.
बीआरसीए 1 म्यूटेंट वापस जोड़ें अभी तक मजबूत परिणाम सामने आए: प्रत्येक संस्करण बीआरसीए 1 या तो पूरी तरह मुताबिक़ पुनर्संयोजन गतिविधि बहाल या कोई प्रभाव नहीं पड़ा. इन परिणामों को प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण विचार है कि हमारे अभिकर्मक शर्तों बीआरसीए 1 प्रोटीन का स्तर है कि लगभग अंतर्जात अनुपचारित कोशिकाओं में प्रोटीन की एकाग्रता के बराबर उत्पादन. भी बीआरसीए 1 के एक दोषपूर्ण उत्परिवर्ती के एक overexpression की उच्च बहुत कुछ सकारात्मक मुताबिक़ पुनर्संयोजन गतिविधि में परिणाम हो सकता है.
एक समस्या यह है कि हम पर काबू पाने के की जरूरत अभिकर्मक की विषाक्तता था. बीआरसीए 1 के रिक्तीकरण ही सेल के विकास को धीमा कर सकते हैं, और पकवान पर कोशिकाओं की संख्या के सापेक्ष Lipofectamine-2000 और प्लाज्मिड डीएनए का संतुलन एक सुसंगत स्तर पर आयोजित किया जाना चाहिए. बहुत Lipofectamine या प्लाज्मिड डीएनए सेल नंबर को कम करने, और कोशिकाओं की संख्या विश्वसनीय प्रवाह cytometry परिणाम प्राप्त करने के लिए अपर्याप्त जाएगा. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की संख्या बनाम प्लाज्मिड और Lipofectamine अभिकर्मकों के शेष कक्षों की व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए काफी महत्वपूर्ण है.
चित्रा 1 पुनर्संयोजन सब्सट्रेट. रणनीति है कि एम. Jasin 7,12 के समूह द्वारा विकसित किया गया था दिखाया गया है. प्लाज्मिड PDR-GFP GFP के दो alleles के दोषपूर्ण है, जिनमें से एक एक मैं SceI प्रतिबंध endonuclease साइट शामिल हैं. एक HeLa व्युत्पन्न सेल लाइन इस डीएनए 9 जीनोम में एक ही साइट पर एकीकृत सब्सट्रेट, और साइट मैं SceI मुताबिक़ पुनर्संयोजन के परिणाम के लिए रूपांतरण में एक एलील की GFP पॉजिटिव द्वारा डबल असहाय डीएनए को तोड़ने की सक्रिय मरम्मत शामिल हैं.
चित्रा 2 प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा GFP पॉजिटिव कोशिकाओं की जांच. कक्ष इस प्रोटोकॉल के अनुसार परीक्षण किया गया, और नियंत्रण समाप्त कोशिकाओं मुताबिक़ पुनर्संयोजन में सक्रिय थे, के रूप में GFP अभिव्यक्ति (बाएं) के साथ कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत के द्वारा पता लगाया है. बीआरसीए 1 के GFP पॉजिटिव कोशिकाओं (दाएं) की संख्या में तेजी से कमी में आरएनएआई परिणामों से रिक्तीकरण.
चित्रा 3 एक बीआरसीए 1 missense म्यूटेंट के ऐड वापस परिणाम. परिणाम के एक ही प्रयोग से इस हिस्टोग्राम में दिखाए जाते हैं. ट्रांसफ़ेक्ट मैं - SceI के अभाव प्लाज्मिड व्यक्त (1 लेन) में नहीं पता चला GFP पॉजिटिव कोशिकाओं रहे हैं. गलियों में परिणाम 2-6 के सभी जिसमें प्लाज्मिड व्यक्त मैं SceI 3 दिन ट्रांसफ़ेक्ट था कोशिकाओं से लिया गया. कोशिकाओं है कि एक अप्रासंगिक जीन (luciferase) के लिए समाप्त हो रहे थे और वेक्टर वापस जोड़ के साथ कोशिकाओं के 15.5% GFP सकारात्मक थे (2 लेन). बीआरसीए 1 और सदिश के रिक्तीकरण ऐड - वापस मुताबिक़ पुनर्संयोजन (3 लेन) पर बीआरसीए 1 के नुकसान के प्रभाव का पता चलता है. बीआरसीए 1 की कमी और जोड़ - वापस जंगली प्रकार बीआरसीए 1 (4 लेन), (M18T) बीआरसीए 1 (5 लेन), और (I21V) बीआरसीए 1 (6 लेन) के प्रभाव दिखाया है. इन परिणामों के एक ही प्रयोग से कर रहे हैं, और कम से कम दो अधिक दोहराने प्रयोगों के साथ संयुक्त हो जाएगा क्रम में एक दिया उत्परिवर्ती बीआरसीए 1 प्रोटीन द्वारा समर्थित मुताबिक़ पुनर्संयोजन के एक उपाय प्राप्त करने के.
Discussion
इस विधि का लाभ यह है कि हम मुताबिक़ कोशिकाओं है कि जंगली प्रकार endogenously व्यक्त बीआरसीए 1 है का उपयोग पुनर्संयोजन द्वारा डीएनए की मरम्मत को विनियमित करने में बीआरसीए 1 प्रोटीन के समारोह का अध्ययन कर सकते हैं. हम मुताबिक़ पुनर्संयोजन प्रक्रिया का अध्ययन और आरएनएआई की मध्यस्थता रिक्तीकरण उपयोग के लिए डीएनए की मरम्मत में समारोह के लिए बीआरसीए 1 वेरिएंट परीक्षण करने के लिए उपन्यास विधि प्राप्त करने के दो अलग स्थापित तरीकों को अपनाया है. इस विधि की सफलता के लिए महत्वपूर्ण आसानी transfectable HeLa जैसे सेल लाइन, ऐसी है कि हम GFP रूपांतरण के बहुत उच्च स्तर प्राप्त करने के जीनोम में पुनर्संयोजन सब्सट्रेट के साथ स्थापित किया गया था. हम क्रम में मूल परिवर्तन के कई क्लोन जांच की थी कि कोई detectable पृष्ठभूमि GFP संकेत था प्राप्त करने के लिए, लेकिन मैं SceI प्लाज्मिड अभिव्यक्ति की अभिकर्मक पर GFP रूपांतरण के एक बहुत ही उच्च स्तर पर था.
इस विधि के साथ, हम अब अन्य मुताबिक़ पुनर्संयोजन में समारोह के लिए विशिष्ट बीआरसीए 1 अमीनो एसिड के अवशेष की जांच कर रहे हैं. इस काम से जैविक अंतर्दृष्टि के साथ साथ, इन निष्कर्षों नैदानिक कैंसर आनुवंशिकी के लिए लागू किया जा सकता है. बीआरसीए 1 missense म्यूटेशनों के एक उच्च प्रतिशत अज्ञात नैदानिक महत्व है क्योंकि वहाँ कई दुर्लभ वेरिएंट हैं और इनमें से कई के लिए अपर्याप्त जानकारी के लिए आनुवंशिक अलगाव 3,10,13,14 विश्लेषण कैंसर संघ द्वारा निर्धारित है . इस पद्धति का उपयोग करके, मुताबिक़ पुनर्संयोजन को विनियमित करने में बीआरसीए 1 के जैविक समारोह पर एक विशिष्ट प्रकार के परिणामों के लिए महिलाओं को जो अपने जीनोम में इन वेरिएंट के ले को सूचित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम ओहियो राज्य इस काम के लिए धन प्रदान करने के लिए यूनिवर्सिटी व्यापक कैंसर केंद्र के लिए आभारी हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960 | |
| FBS | USA Scientific, Inc. | 9871-5200 | |
| siRNA | Invitrogen | N/A | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12604 | |
| Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
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