Summary
وقد ثبت RNA التدخل الفعال للغاية لتحليل الجينات في وظيفة
Abstract
الفحص الجيني هي واحدة من أقوى الوسائل المتاحة لاكتساب نظرة ثاقبة عملية بيولوجية معقدة 1. على مر السنين وأصبحت العديد من التحسينات وأدوات للتلاعب الجيني المتاحة في ذبابة الفاكهة 2. بعد وقت قصير من الاكتشاف الأولي Frie وميلو 3 التي يمكن استخدامها RNA المزدوج تقطعت بهم السبل لضربة قاضية في نشاط الجينات الفردية في ايليجانس انواع معينة ، وقد تبين تدخل الحمض النووي الريبي (رني) لتوفير منهج قوي الجينية العكسية لتحليل وظائف الجينات في تطوير الجهاز ذبابة الفاكهة 4 ، 5.
وتتكون العديد من الأجهزة ، بما في ذلك الرئة والكلى والكبد والأوعية الدموية ، أنبوبي من شبكات متفرعة أن السوائل أو الغازات الحيوية النقل 6 ، 7. تحليل تشكيل ذبابة الفاكهة القصبة الهوائية يوفر نظام نموذجا ممتازا لدراسة التشكل الأجهزة الأخرى 8 أنبوبي. كشفت ذبابة الفاكهة بيركلي مشروع الجينوم مئات الجينات التي يتم التعبير عنها في النظام القصبة الهوائية. لدراسة الآلية الجزيئية والخلوية تشكيل الأنبوب ، فإن التحدي يكمن في فهم دور هذه الجينات في عملية التنمية القصبة الهوائية. هنا ، نحن وصف مفصل لطريقة حقن الرنا المزدوج الجديلة في جنين ذبابة الفاكهة في التعبير ضربة قاضية الجينات الفردية. نحن أفلحت أسفل الذاتية dysfusion التعبير الجيني (dys) الرنا المزدوج الجديلة عن طريق الحقن. Dys هو بروتين bHLH لتقييم الأداء وأعرب في خلايا الانصهار القصبة الهوائية ، وكان مطلوبا للاندماج فرع القصبة الهوائية 9 و 10. dys - رني القضاء عليها كليا التعبير dys وأسفرت عيب الانصهار القصبة الهوائية. هذه طريقة بسيطة نسبيا يوفر أداة لتحديد الجينات لrequried tissure وتطوير الجهاز في ذبابة الفاكهة.
Protocol
1. كوكتيل الجنين
- إنشاء الأقفاص عند 25 درجة مئوية ويتم تغيير باستخدام 2-4 يوما ث عصير flies.Grape 1118 لوحات في كل ساعة خلال اليوم لمزامنة جمع البيض خلال فترة 1-2 أيام قبل جمع
- جمع الأجنة ل1hr عند 25 درجة مئوية
- قطع قطعة مستطيلة من آغار عصير العنب ، وقطع خفيفة في منتصف بشفرة الحلاقة ، وترك سطر في أجار
- استخدام مجس معدني لنقل الأجنة لوحة من عصير العنب لديك قطعة من عصير العنب آغار ، خط لهم في خط مستقيم مع محور أطول للجنين في زاوية 45 درجة من خط في منتصف آغار. الحصول على خط مستقيم من حوالي 50 الأجنة. تأكد من أن كل نقطة الأجنة في نفس الاتجاه ، مع انتهاء الخلفي لافتا بعيدا عن خط المرمى.
- قطع قطعة مستطيلة من الشريط عصا مزدوجة ، ووضعه على زلة تغطية 18x18mm.
- التقاط الأجنة مع عصا الشريط المزدوج على تغطية زلة
- ضع زلة لتغطية شريحة زجاجية جافة والجنين في الهواء لحوالي 10 دقيقة.
- تغطية الجنين بطبقة رقيقة من النفط الهالوكربون 700 ، الآن انها مستعدة للحقن.
2. سحب الإبرة
جعل الإبر microinjection عن طريق سحب أنابيب زجاجية الشعرية. نستخدم مجتذب إبرة دقيقة من الصك الدولي (النموذجي PUL - 1). مواصفات البرنامج إبرة مجتذب هي : الحرارة : 1 ، 4 تأخير.
3. ملء إبر
العودة الحمل باستخدام الإبر P20 إيبندورف ماصة مزودة نصائح Microloader إيبندورف ، تحميل عادة 1،5-2 الرنا المزدوج الجديلة ميكرولتر
4. كسر إبر
- قبل ان يكسر الإبرة ، وضع ساترة على شريحة.
- إعداد الشريحة مع هبوط النفط في منتصف الشريحة
- بدوره على picopump Picospritzer الثالث لضبط ضغط الهواء
- كسر شغل الإبرة ضد حافة الانزلاق الغطاء ، وخلق نقطة حادة.
- عندما يتم تقسيم الحافة ، خطوة على دواسة القدم Picospritzer picopump الثالث ، فإن بعض الرنا المزدوج الجديلة يتسرب من طرف الإبرة.
- اخراج الشريحة مع ساترة.
- ادخال الإبرة تحت انخفاض اسعار النفط في منتصف الشريحة أعدت من قبل.
- ضبط الإعداد على picopump Picospritzer الثالث للحصول على 100 200pl الرنا المزدوج الجديلة عند الخطوة على دواسة القدم. ويمكن رؤية الرنا المزدوج الجديلة وقطرات صغيرة.
5. حقن
- جلب رأس الإبرة إلى الجزء الخلفي من الجنين الأريمة الطائرة الأولى في الاتصال نفسه وحقن الجنين قبالة مركز حول 30-50 ٪ طول البيضة.
- بعد خطوة على دواسة القدم من picopump Picospritzer الثالث ، فإن كمية صغيرة من الرنا المزدوج الجديلة تبدو وكأنها نقطة صغيرة في موقع الحقن.
6. تحليل المظهري
- بعد الحقن ، ضع الشريحة في الحجرة مغطاة رطبة (البلاستيك طبق بيتري) في 18 درجة مئوية حتى الأجنة لتطوير المرحلة الجنينية المطلوب.
- استخدام التحقيق لإزالة الشريط من أجنة مزدوجة من جانب ودفعهم الى حافة الانزلاق الغطاء.
غسل الأجنة خارج الشريحة إلى قارورة جمع مع شبكة من النايلون في أسفل باستخدام هيبتان ، ويغسل 3 مرات مع PBT.
Dechorionate الأجنة في التبييض 50 ٪ لمدة 5 دقائق ، وتغسل 3 مرات مع PBT.
نقل الأجنة من القنينة لجمع قطعة من شبكة من النايلون ، ثم تراجع لشبكة النايلون في حل تثبيتي (هيبتان 5ml ، 4.5ml PBS ، 0.5ml الفورمالديهايد 37 ٪) للافراج عن الأجنة. الإصلاح الأجنة في حل لتثبيتي 30min.
Devitellinize الأجنة مع الميثانول ، ونقل الأجنة إلى أنبوب إيبندورف ، وimmunostain الأجنة باستخدام البروتوكولات القياسية. - ويمكن أيضا تطوير الأجنة لمرحلة اليرقات المناسبة.
- إعداد شريحة مع قطرة من النفط 700 الهالوكربون في منتصف
- نقل أحد اليرقات إلى الشريحة ، ووضع غطاء على زلة الأعلى
- مراقبة اليرقات تحت المجهر حقل مشرق.
7. ممثل النتائج :
مثالا على الرنا المزدوج الجديلة نهدم dysfusion (dys) الجينات في الأجنة Drosophlia هو مبين في Fig1. GFP - الأجنة حقن الرنا المزدوج الجديلة هي السيطرة السلبية. Dys هو عامل النسخ PAS bHLH التي أعرب عنها في خلايا الانصهار القصبة الهوائية. GFP - حقن الرنا المزدوج الجديلة الأجنة تظهر الانصهار القصبة الهوائية العادية ، وDys بروتين موجود في خلايا الانصهار (الشكل 1A). من ناحية أخرى ، dys - الرنا المزدوج الجديلة حقن الاجنة تظهر فشل اندماج فرع ، وDys البروتينات ليست موجودة في خلايا الانصهار (1B الشكل). أظهرت يرقات dys - الرنا المزدوج الجديلة حقن الرنا المزدوج الجديلة عند حقن الأجنة تتطور إلى مرحلة اليرقات ، فشل اندماج فرع (Fig.1D) مقابل السيطرة GFP - الرنا المزدوج الجديلة السلبية حقن (1C الشكل). وأظهرت هذه النتائج فعالة نهدم الذاتية من التعبير الجيني عن طريق الحقن dys الرنا المزدوج الجديلة في أجنة ذبابة الفاكهة
الشكل 1. إزالة الدالة dys بواسطة dys - رني يكشف الرغامى د الانصهارefects. تم حقن الاجنة الأريمة (ث 1118) إما مع GFP - الرنا المزدوج الجديلة (مراقبة سلبية) أو dys الرنا المزدوج الجديلة ويعاير عن العيوب القصبة الهوائية. (أ) مرحلة الجنين 16 حقنوا GFP - الرنا المزدوج الجديلة وملطخة α - MAB 2A12 Dys والبقع التي تجويف القصبة الهوائية. أظهرت بشكل بارز هو الجذع الوحشي الذي تنصهر. السهام لخلايا الجذع نقطة الانصهار الأفقي Dys إيجابية. (ب) المرحلة 16 الجنين حقنوا dys - الرنا المزدوج الجديلة وملطخة α - 2A12 Dys وماب. وأظهرت عدم وجود الجنين الانصهار الجذع الجانبية (العلامة النجمية يشير الموقع الطبيعي للانصهار الاطراف الجذع في الأجنة التحكم). ولوحظ وجود خلايا Dys إيجابية ، مشيرا الى ان dys - RNA ألغت فعليا Dys البروتين. تم فحص (C إلى D) الثانية طور مرحلي اليرقات إما مع GFP - الرنا المزدوج الجديلة أو الرنا المزدوج الجديلة dys تلو مشرق الميدان المجهري للعيوب القصبة الهوائية. (ج) يتم الإشارة إلى مواقع الانصهار بواسطة نجمية في GFP - الرنا المزدوج الجديلة اليرقات تحكم حقن. (D) الجذع الوحشي فشلت في الصمامات في يرقات dys - RNA حقن ، (*) يشير إلى الموقع الطبيعي للانصهار الجذع الجانبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة حقن الرنا المزدوج الجديلة الحاضر هنا يمكن تحليل حساسة جدا وسريعة وظيفة الجينات في تطوير ذبابة الفاكهة القصبة الهوائية. ومن الممكن أن تطبق هذه الطريقة لتحليل وظيفة الجين على الأنسجة الأخرى ، وتطوير الجهاز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر ستيفن لطواقم dysfusion الضد ، [كدنا] Dys والذباب 1118 ث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Picospritzer III picopump | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | |
| Micro-pipettes | Fisher Scientific | 21170M | |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 |
References
- St Johnston, D., Nusslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-219 (1992).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster. Nat. Rev. Genet. 6, 167-178 (2005).
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
- Misquitta, L., Paterson, B. M. Targeted disruption of gene function in Drosophila by RNA interference (RNA-i): a role for nautilus in embryonic somatic muscle formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 1451-1456 (1999).
- Horowitz, A., Simons, M. Branching morphogenesis. Circ. Res. 103, 784-795 (2008).
- Hogan, B. L., Kolodziej, P. A. Organogenesis: molecular mechanisms of tubulogenesis. Nat. Rev. Genet. 3, 513-523 (2002).
- Ghabrial, A., Luschnig, S., Metzstein, M. M., Krasnow, M. A. Branching morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19, 623-647 (2003).
- Jiang, L., Crews, S. T. Dysfusion transcriptional control of Drosophila tracheal migration, adhesion, and fusion. Mol. Cell. Biol. 26, 6547-6556 (2006).
- Jiang, L., Crews, S. T. The Drosophila dysfusion basic helix-loop-helix (bHLH)-PAS gene controls tracheal fusion and levels of the trachealess bHLH-PAS protein. Mol. Cell. Biol. 23, 5625-5637 (2003).
