Summary
RNA girişim gen fonksiyonu analiz etmek için çok etkili olduğu kanıtlanmıştır
Abstract
Genetik tarama karmaşık biyolojik süreci 1 içgörüler kazanmak için mevcut olan en güçlü yöntemlerden biridir. Drosophila 2 yıl içinde genetik manipülasyon için birçok yenilik ve araçlar haline gelmiştir. Yakında çift iplikli RNA RNA enterferans (RNAi) Drosophila organ gelişimi gen fonksiyonlarını analiz için güçlü bir ters genetik yaklaşım sağlamak için gösterilen Caenorhabditis elegans, bireysel genlerin aktivitesi demonte etmek için kullanılabilir Frie ve Mello 3 tarafından ilk keşfinden sonra 4, 5.
, Akciğer, böbrek, karaciğer, ve damar sistemi de dahil olmak üzere birçok organı, dallı tübüler ağları oluşan taşıma hayati sıvı veya gazlar, 6, 7 . Drosophila trakeal oluşumu analiz tübüler diğer organların 8 morfolojilerinden çalışmak için mükemmel bir model sistemi sağlar. Berkeley Drosophila genom projesi, trakeal sistem olarak ifade edilir yüzlerce gen ortaya çıkardı . Tüp oluşumunun moleküler ve hücresel mekanizma çalışmak için, meydan trakeal gelişiminde bu genlerin rollerini anlamak. Burada, demonte bireysel gen ekspresyonu Drosophila embriyo haline dsRNA enjeksiyon ayrıntılı bir yöntem tanımlanmıştır. Biz başarıyla dsRNA enjeksiyon endojen dysfusion (DYS) gen ekspresyonu çaldı. Disfonksiyonu, trakeal füzyon hücreleri ifade bHLH-PAS protein ve trakeal şube füzyon 9, 10 için gereklidir . disfonksiyonu RNAi disfonksiyonu ifadesi tamamen ortadan kaldırdı ve trakeal füzyon defekti sonuçlandı. Bu nispeten basit bir yöntem Drosophilia'daki tissure ve organ gelişimi için requried genleri tanımlamak için bir araç sağlar.
Protocol
1. Embriyo Koleksiyon
- 25 kafesleri ayarlayın ° C 2-4 gün eski w 1118 flies.Grape suyu plakaları kullanarak toplama önce 1-2 gün süre içinde yumurta toplama senkronize etmek için gün boyunca her saat başı değiştirilir
- 25 1hr için embriyolar toplayın ° C
- Üzüm suyu agar ortasında bir jiletle hafifçe kesilmiş bir dikdörtgen parça, Kes, agar bir çizgi terk
- , Üzüm suyu agar parça, üzüm suyu plaka embriyo transferine yönelik bir metal prob kullanın agar ortasında hattına 45 derecelik bir açıyla embriyonun uzun ekseni ile düz bir çizgi, onları hizaya. Yaklaşık 50 embriyoların düz bir çizgi alın. Hat uzak işaret arka ucu ile, tüm embriyoların noktası aynı yönde olduğundan emin olun.
- Çift kaset sopa dikdörtgen bir parça kesin ve 18x18mm bir kapak kayma yerleştirin.
- Kapak astar üzerine çift kaset sopa ile embriyolar Pick up
- Koyun, bir bardak slayt kapak kayma, embriyo yaklaşık 10 dakika süreyle havada kurutun.
- 700 Halokarbon yağı ince bir tabaka ile embriyo Kapak, şimdi enjeksiyon için hazır.
2. İğne Çekme
Cam kılcal tüpler çekerek mikroenjeksiyon iğneler olun. Biz Dünya Hassas Aracı (Model PUL-1) bir iğne çektirmesi kullanın. İğne çektirmesi programın özellikleri şunlardır: Isı: 1, gecikme 4.
3. İğneler Dolum
Back-Eppendorf Microloader ipuçları ile donatılmış Eppendorf P20 pipet kullanarak yük iğneler, normal yük 1.5-2 mcL dsRNA
4. İğneler Molası
- Iğne kırılması önce, bir slayt üzerine bir lamel.
- Bir slayt slayt ortasında bir damla yağ ile hazırlayın
- Hava basıncı ayarlamak için Picospritzer III picopump açın
- Keskin bir noktası oluşturarak, bir kapak kayma kenarına dolu iğne kırın.
- Ucu kırık, ayak pedalı Picospritzer III picopump adım, bazı dsRNA iğne ucu kaçağına sebep olur.
- Lamel ile slayt dışarı atın.
- Önce hazırlanan slayt ortasında yağ damlası altında iğne yerleştirin.
- 100-200pl dsRNA ayak pedalı adım almak için Picospritzer III picopump ayarını değiştirin. dsRNA bir küçük damlacık olarak görülebilir.
5. Enjeksiyon
- Iğne ucu aynı odak düzlemi içine ilk blastodermin embriyo arka kısmına getirin ve% 30-50 yumurta uzunluğu etrafında merkezden embriyo enjekte.
- Picospritzer III picopump ayak pedalı adımdan sonra, küçük bir miktarda dsRNA enjeksiyon yerinde küçük bir nokta olarak görünür.
6. Fenotipik Analizi
- Embriyoların istenilen embriyonik aşamada geliştirmek kadar, enjeksiyondan sonra 18 yaşında bir kapalı nemli ortamdan (plastik Petri kabı) ° C slayt.
- Çift taraflı bant embriyolar kaldırmak ve kapak kayma kenarına itmek için prob kullanın.
Heptan kullanarak alt kısmında naylon örgü bir koleksiyon şişenin içine slayt kapalı embriyoların yıkayın, PBT ile 3 kere yıkayın.
5 dakika boyunca% 50 çamaşır Dechorionate embriyolar ve PBT ile 3 kere yıkayın.
Toplama şişeden bir parça naylon örgü embriyo transferi ve ardından embriyoları serbest fiksatif solüsyonu (5ml heptan, 4.5ml PBS, 0.5 ml% 37 formaldehit) naylon örgü içine batırın. 30 dakika için fiksatif çözüm embriyolar sabitleyin.
Eppendorf tüp embriyo transferi ve standart protokolleri kullanarak embriyolar immunostain, metanol ile embriyolar Devitellinize. - Embriyolar uygun larva dönemi de gelişebilir.
- Ortasında Halokarbon 700 petrol bir damla bir slayt hazırlayın
- Slayta bir larva transferi, üstüne bir kapak kayma koymak
- Parlak alan mikroskobu altında larvaları uyun.
7. Temsilcisi Sonuçlar:
DsRNA, bir örnek Fig1 gösterilen Drosophlia embriyo dysfusion (DYS) gen yıkmak. GFP-dsRNA enjekte edilen embriyolar, negatif kontrol edilir. Disfonksiyonu, trakeal füzyon hücreleri ifade bHLH PAS transkripsiyon faktörü. GFP-dsRNA enjekte edilen embriyolar normal trakeal füzyon, füzyon hücreleri (Şekil 1A) ve DYS protein bulunur. Öte yandan, dis-dsRNA embriyolar başarısız şube füzyon enjekte ve DYS proteinler füzyon hücreleri (Şekil 1B) mevcut değildir. DsRNA embriyolar larva aşamasında geliştirmek enjekte edildiğinde, dis-dsRNA enjekte larvaları GFP-dsRNA enjekte negatif kontrol (Şekil 1C) ile karşılaştırıldığında başarısız şube füzyon (Fig.1D) gösterdi. Bu sonuçlar, Drosophila embriyolara dsRNA enjeksiyon etkili endojen disfonksiyonu gen ekspresyonu yıkmak gösterdi
Şekil 1, dis-RNAi dis fonksiyon Kaldırma ortaya koymaktadır trakeal füzyon defects. Blastodermin embriyolar (w 1118), GFP dsRNA (negatif kontrol) veya disfonksiyonu dsRNA ile enjekte edilir ve trakeal kusurlar için ölçüldü . (A) Sahne 16 embriyo GFP-dsRNA ile enjekte edilen ve α-DYS ve MAb 2A12 lekeleri trakeal lümen ile boyandı. Göze çarpacak erimiş sahip yan gövde, gösterilir. Oklar yan gövde DYS pozitif füzyon hücreleri üzerine gelin. (B) Sahne 16 embriyo disfonksiyonu dsRNA ile enjekte edilen ve α-DYS ve MAb 2A12 ile boyandı. Embriyo, lateral gövde füzyon (yıldız kontrolü embriyolar bir yan gövde füzyon normal yeri gösterir) eksikliği gösterdi. Dis-RNA etkili DYS protein kaldırıldı olduğunu belirterek, DYS-pozitif hücrelerin yok gözlendi. (C D) GFP-dsRNA veya disfonksiyonu dsRNA İkinci instar larvaları trakeal kusurları için parlak alan mikroskobu ile incelendi. (C) füzyon siteler GFP-dsRNA enjekte kontrolü larvaları bir yıldız işareti ile belirtilmiştir. (D) lateral dis-RNA enjekte larvalar gövde sigorta başarısız lateral gövde füzyon (*) normal yeri gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DsRNA enjeksiyon yöntemi mevcut burada çok hassas ve hızlı analiz Drosophila trakeal gelişme gen fonksiyonu sağlar. Bu yöntem, potansiyel olarak diğer doku ve organ gelişimi için gen fonksiyonu analiz etmek için de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarları Stephen Ekipler dysfusion cDNA, DYS antikor ve w 1118 sinekler için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Picospritzer III picopump | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | |
| Micro-pipettes | Fisher Scientific | 21170M | |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 |
References
- St Johnston, D., Nusslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-219 (1992).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster. Nat. Rev. Genet. 6, 167-178 (2005).
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
- Misquitta, L., Paterson, B. M. Targeted disruption of gene function in Drosophila by RNA interference (RNA-i): a role for nautilus in embryonic somatic muscle formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 1451-1456 (1999).
- Horowitz, A., Simons, M. Branching morphogenesis. Circ. Res. 103, 784-795 (2008).
- Hogan, B. L., Kolodziej, P. A. Organogenesis: molecular mechanisms of tubulogenesis. Nat. Rev. Genet. 3, 513-523 (2002).
- Ghabrial, A., Luschnig, S., Metzstein, M. M., Krasnow, M. A. Branching morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19, 623-647 (2003).
- Jiang, L., Crews, S. T. Dysfusion transcriptional control of Drosophila tracheal migration, adhesion, and fusion. Mol. Cell. Biol. 26, 6547-6556 (2006).
- Jiang, L., Crews, S. T. The Drosophila dysfusion basic helix-loop-helix (bHLH)-PAS gene controls tracheal fusion and levels of the trachealess bHLH-PAS protein. Mol. Cell. Biol. 23, 5625-5637 (2003).
