Summary
RNA 간섭은 유전자의 기능을 분석하는 매우 효과적인 입증되었습니다
Abstract
유전자 검사는 복잡한 생물 학적 과정을 한 통찰력을 확보하고 사용할 수있는 가장 강력한 방법 중 하나입니다. 수년 동안 유전자 조작을위한 많은 개선 및 도구 Drosophila 2 사용할 수 있습니다. 곧 두 번 좌초 RNA가 분해 RNA 간섭 (RNAi)가 Drosophila 장기 개발에 유전자 기능을 분석하는 강력한 반대로 유전자 접근 방법을 제공하기 위해 표시되었습니다 Caenorhabditis 엘레간스에서 개별 유전자의 활동을하는 데 사용할 수있는 프리와 멜로 3 초기 발견 이후 4, 5.
폐, 신장, 간, 그리고 혈관 계통을 포함한 많은 장기는, 분기 관 네트워크로 구성하는 중요 교통 유체 또는 가스 6, 7. Drosophila tracheal 형성의 분석은 다른 관형 기관 8 morphogenesis을 연구하는 훌륭한 모델 시스템을 제공합니다. 버클리 Drosophila 게놈 프로젝트는 tracheal 시스템에 표현됩니다 유전자의 수백을 보여주었다. 튜브 형성의 분자 및 세포 메커니즘을 연구하기 위해 도전 tracheal 개발에서 이러한 유전자의 역할을 이해하는 것입니다. 여기, 우리는 최저의 개별 유전자 발현에 Drosophila의 배아에 주입 dsRNA에 대한 자세한 방법을 설명했다. 우리는 성공적으로 dsRNA 주입에 의해 내생 dysfusion (dys) 유전자 발현을 무너 뜨 렸어. Dys는 tracheal 융합 세포의 표현 bHLH - PAS 단백질이며, 그것은 tracheal 지점 융합 9, 10 필요합니다. dys - RNAi 완전히 dys 표현을 제거하고 tracheal 퓨전 결함의 결과. 이것은 비교적 간단한 방법은 Drosophila의 tissure 및 장기 개발을위한 requried 유전자를 식별할 수있는 도구를 제공합니다.
Protocol
1. 배아 컬렉션
- 25 새장을 설정 ° 2-4일 된 w 1118 flies.Grape 주스 플레이트를 사용하는 C는 수령 전에 1-2일 기간 동안 계란 컬렉션을 동기화하기 위해 하루 동안 매 시간마다 변경됩니다
- 25 1 시간에 대한 배아를 수집 ° C
- 면도날로 중간에 가볍게 절단 포도 주스 한천의 사각형 조각을 잘라 한천의 라인을두고
- 포도 쥬스 한천의 조각에 포도 주스 플레이트에서 배아를 전송하는 금속 프로브를 사용하여 한천의 중간에있는 라인에 45도 각도에서 배아의 긴 축을 가진 직선에서 그들을 라인 업. 약 50 배아의 직선을하십시오. 라인에서 멀리 가리키는 후부 엔드와 모든 배아 지점 같은 방향을 확인하십시오.
- 이중 스틱 테이프의 사각형 조각을 잘라 및 18x18mm 커버 슬립에 놓으십시오.
- 커버 슬립을 더블 스틱 테이프와 배아를 들고
- , 유리 슬라이드에 커버 슬립을 플레이스 약 10 분 공중에 배아를 건조.
- 700 할로 카본 오일의 얇은 층과 배아를 맡아, 지금은 주사를위한 준비.
2. 니들을 풀링
유리 모세관 튜브를 당겨 microinjection의 바늘을 만듭니다. 우리는 세계 정밀 악기 (모델 PUL - 1)에서 바늘 풀러를 사용합니다. 바늘 풀러 프로그램 사양은 다음과 같습니다 열 : 1, 지연 4.
3. 니들 필링
Eppendorf Microloader 팁 장착되어 Eppendorf p20 피펫을 사용하여 백업 부하 바늘은 일반적으로 1.5-2 μL dsRNA를 로드할 수
4. 니들 브레이크
- 바늘을 깨는 전에 슬라이드로 coverslip을 넣으십시오.
- 슬라이드 중간에 기름 한 방울과 슬라이드를 준비
- 공기 압력을 조정 Picospritzer III picopump 켭니다
- 샵 포인트를 작성, 표지 용지의 가장자리에 대한 가득한 바늘을 휴식.
- 팁이 깨진 경우, Picospritzer III picopump 기슭 페달에 단계는, 일부 dsRNA는 바늘 끝 밖으로 누출됩니다.
- coverslip으로 슬라이드를 꺼내주세요.
- 전에 준비한 슬라이드의 중간에 오일 드롭에서 바늘을 삽입합니다.
- 당신은 발 페달을 밟아 때 100 - 200pl dsRNA를 얻을 수있는 Picospritzer III picopump에 대한 설정을 조정합니다. dsRNA는 작은 비말로 볼 수 있습니다.
5. 주사
- 동일한 초점 비행기로 최초의 배반엽 배아의 후부 부분에 바늘 끝을 준비하고 30~50% 달걀 길이 주위 센터에서 배아를 주입.
- 당신이 Picospritzer III picopump 기슭 페달 밟아 후, dsRNA의 작은 금액은 사출 사이트의 작은 점으로 표시됩니다.
6. Phenotypic 분석
- 태아가 원하는 배아 단계로 개발할 때까지 주입 후 18 덮여 촉촉한 챔버 (플라스틱 페트리 접시) ° C에 슬라이드를 놓으십시오.
- 이중 양면 테이프에서 배아를 제거하고 커버 용지의 가장자리로 밀어 프로브를 사용합니다.
헵탄를 사용하여 아래에 나일론 메쉬와 컬렉션 약병에 슬라이드에서 배아를 와시, PBT로 3 회 씻는다.
Dechorionate 5 분 50 % 표백제로 배아하고 PBT로 3 회 씻는다.
수집 약병에서 나일론 메쉬의 한 부분으로 배아를 전송하고 배아를 공개 정착액 솔루션 (5ml 헵탄, 4.5ml PBS, 0.5ml 37 % 포름 알데히드)에 나일론 메쉬를 찍어. 30 분 대한 고정력있는 솔루션에 배아를 수정.
eppendorf 튜브에 배아를 전송하고, 표준 프로토콜을 사용하여 배아를 immunostain, 메탄올과 배아를 Devitellinize. - 배아는 해당 애벌레 단계로 개발할 수 있습니다.
- 중간에 할로 카본 700 기름 한 방울과 슬라이드를 준비
- 슬라이드 하나의 유충을 전송, 상단에 커버 슬립을하다
- 명시야 현미경으로 애벌레를 관찰.
7. 대표 결과 :
dsRNA의 예는 Fig1에 표시됩니다 Drosophlia의 배아에서 dysfusion (dys) 유전자를 노크. GFP - dsRNA 주입 태아는 부정적인 통제하고 있습니다. Dys는 tracheal 융합 세포의 표현 bHLH PAS의 전사 인자이다. GFP - dsRNA 주입 배아가 정상 tracheal 융합을 표시하고, Dys 단백질이 융합 세포 (그림 1A)에 속해 있습니다. 한편, dys - dsRNA는 배아가 실패 지점 융합을 보여 주입하고, Dys 단백질이 융합 세포 (그림 1B)에 존재하지 않습니다. dsRNA는 배아가 애벌레 단계로 개발 주입하면 dys - dsRNA 주입 애벌레는 GFP - dsRNA 주입 대조군 (그림 1C)에 비해 실패 지점 퓨전 (Fig.1D)을 보여주었다. 이러한 결과는 효과가 Drosophila의 배아에 주입하여 dsRNA 내생 dys 유전자 표현의 다운 노크했다
그림 1. dys - RNAi에 의해 dys 기능의 제거 tracheal 퓨전 D를 보여efects. 배반엽의 배아 (W 1118)는 GFP - dsRNA (대조군) 또는 dys - dsRNA 중 하나와 함께 주입하고 tracheal 결함에 대한 assayed했다. (A) 단계 16 배아는 GFP - dsRNA로 주입과 α - Dys 및 MAb 2A12 그 얼룩이 tracheal 루멘 물들다. 눈에 띄게 융합있는 측면 트렁크는, 표시됩니다. 화살표는 측면 트렁크 Dys - 긍정적인 융합 세포를 가리 킵니다. (B) 16 단계 배아는 dys - dsRNA로 주입과 α - Dys과 MAb 2A12 물들다. 배아는 측면 트렁크 퓨전 (별표 제어 배아의 측면 - 트렁크 융합의 정상 위치를 나타냅니다)의 부족을 보여주었다. 없음 Dys 양성 세포는 dys - RNA 효과적으로 Dys 단백질을 폐지한다는 의미 관찰되지 않았습니다. GFP - dsRNA 또는 dys - dsRNA 중 하나와 함께 (C D)을 제 2 instar 애벌레는 tracheal 결함에 대한 밝은 - 필드 현미경으로 조사되었다. (C) 퓨전의 사이트는 GFP - dsRNA 주입 제어 애벌레의 별표로 표시됩니다. (D) 측면 트렁크 dys - RNA 주입 애벌레의 퓨즈에 실패, (*)는 측면 트렁크 융합의 정상 위치를 나타냅니다.
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Discussion
dsRNA 주입 방식 현재는 여기에 Drosophila tracheal 개발 유전자 기능의 매우 민감하고 신속한 분석이 가능합니다. 이 방법은 잠재적으로 다른 조직 및 장기 개발을위한 유전자 기능을 분석하기 위해 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자 dysfusion cDNA, Dys 항체 및 W 1118 파리, 스티븐 크루스 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Picospritzer III picopump | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | |
| Micro-pipettes | Fisher Scientific | 21170M | |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 |
References
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