Summary
RNA interference è stato dimostrato molto efficace per analizzare la funzione del gene in
Abstract
Screening genetico è uno dei metodi più potenti disponibili per ottenere intuizioni complesso processo biologico 1. Nel corso degli anni molti miglioramenti e strumenti per la manipolazione genetica si sono resi disponibili in Drosophila 2. Subito dopo la scoperta iniziale Frie e Mello 3 che doppio filamento di RNA possono essere utilizzate per knockdown l'attività di singoli geni in Caenorhabditis elegans, è stato mostrato interferenza dell'RNA (RNAi) per fornire un potente approccio inverso genetico di analizzare le funzioni del gene nello sviluppo di Drosophila organo 4, 5.
Molti organi, compreso il polmone, rene, fegato e sistema vascolare, sono composti da tubolari ramificate reti di trasporto che i fluidi vitali o gas 6, 7. L'analisi della formazione di Drosophila tracheale fornisce un ottimo sistema modello per studiare la morfogenesi degli altri organi tubolari 8. The Berkeley Drosophila Genome Project ha rivelato centinaia di geni che si esprimono nel sistema tracheale. Per studiare i meccanismi molecolari e cellulari della formazione del tubo, la sfida è comprendere il ruolo di questi geni nello sviluppo tracheale. Qui, abbiamo descritto un metodo dettagliato di dsRNA iniezione in embrione di Drosophila espressione genica knockdown individuali. Siamo riusciti abbattuto endogeno dysfusion (dis) espressione genica mediante iniezione dsRNA. Disfunzione è un bHLH-PAS proteina espressa nelle cellule fusione tracheali, ed è necessario per la fusione ramo tracheale 9, 10. disfunzione RNAi completamente eliminato espressione disfunzioni e ha portato in difetto di fusione tracheale. Questo metodo relativamente semplice fornisce uno strumento per identificare i geni requried per tissure e lo sviluppo degli organi in Drosophila.
Protocol
1. Raccolta degli embrioni
- Impostare gabbie a 25 ° C con 2-4 giorni di età w 1118 piastre succo flies.Grape vengono cambiati ogni ora durante il giorno per sincronizzare la raccolta delle uova in 1-2 giorni prima del periodo di raccolta
- Raccogliere embrioni per 1 ora a 25 ° C
- Tagliare un pezzo rettangolare di agar succo d'uva, tagliate leggermente al centro con una lama di rasoio, lasciare una riga nel agar
- Utilizzare una sonda di metallo per il trasferimento degli embrioni da piastra succo d'uva al vostro pezzo di agar succo d'uva, li allineano in linea retta con l'asse più dell'embrione a 45 gradi con la linea in mezzo l'agar. Ottenere una retta di circa 50 embrioni. Assicurarsi che tutti gli embrioni punto nella stessa direzione, con estremità posteriore che punta lontano dalla linea.
- Tagliare un pezzo rettangolare di nastro doppio bastone, e posizionarlo di una scivolata copertura 18x18mm.
- Pick up embrioni con nastro doppio bastone sul vetrino
- Mettere il vetrino di un vetrino, asciugare l'embrione in aria per circa 10 min.
- Coprire l'embrione con un sottile strato di 700 Halocarbon, ora è pronto per l'iniezione.
2. Tirare Needle
Fai aghi microiniezione tirando tubi di vetro capillari. Noi utilizziamo un estrattore ago dal Instrument mondiale di precisione (modello PUL-1). Le specifiche estrattore programma aghi sono: calore: 1, ritardo di 4.
3. Riempimento del Needles
Back-carico aghi utilizzando la pipetta Eppendorf p20 dotato di Eppendorf punte Microloader, normalmente carico 1,5-2 dsRNA microlitri
4. Break the Needles
- Prima di rompere l'ago, inserire un vetrino in una diapositiva.
- Preparare un vetrino con una goccia di olio al centro della diapositiva
- Accendere il III Picospritzer picopump per regolare la pressione dell'aria
- Rompere l'ago riempito contro il bordo di un vetrino, la creazione di una punta aguzza.
- Quando la punta è rotto, passo sul pedale del Picospritzer III picopump, alcuni dsRNA sarà fuoriuscire dalla punta dell'ago.
- Estrarre il vetrino con il coprioggetto.
- Inserire l'ago sotto la goccia di olio al centro della diapositiva preparato prima.
- Regolare l'impostazione del III Picospritzer picopump per ottenere 100-200PL dsRNA quando fate un passo sul pedale. dsRNA può essere visto come una piccola goccia.
5. Iniezione
- Portare la punta dell'ago alla parte posteriore dell 'embrione Blastoderm prima nello stesso piano focale e iniettare l'embrione fuori centro del 30-50% lunghezza d'uovo.
- Dopo passo sul pedale del III Picospritzer picopump, una piccola quantità di dsRNA apparirà come un puntino nel sito di iniezione.
6. Analisi fenotipica
- Dopo l'iniezione, collocare il vetrino in una camera coperta umida (plastica Petri) a 18 ° C fino a quando gli embrioni sviluppano allo stadio embrionale desiderato.
- Utilizzare la sonda per rimuovere gli embrioni dal nastro biadesivo e spingerli verso il bordo dello slip di copertura.
Lavare gli embrioni fuori dalla diapositiva in un flaconcino di raccolta con rete di nylon sul fondo utilizzando eptano, lavare 3 volte con PBT.
Embrioni Dechorionate nel 50% di candeggina per 5 minuti, e lavare 3 volte con PBT.
Trasferimento degli embrioni dal flacone collezione ad un pezzo di rete di nylon, e poi immergere la rete di nylon nella soluzione di fissativo (5 ml eptano, 4,5 ml di PBS, 0,5 ml di formaldeide 37%) per rilasciare embrioni. Fissare gli embrioni nella soluzione fissante per 30min.
Devitellinize embrioni con metanolo, il trasferimento di embrioni per una provetta Eppendorf, e immunostain gli embrioni utilizzando protocolli standard. - Gli embrioni possono anche sviluppare appropriarsi stadio larvale.
- Preparare un vetrino con una goccia di olio Halocarbon 700 nel mezzo
- Trasferire una larve alla diapositiva, mettere un vetrino in cima
- Osservare le larve al microscopio in campo chiaro.
7. Rappresentante dei risultati:
Un esempio di dsRNA abbattere dysfusion (dis) gene in embrione Drosophlia è mostrato in Fig. 1. GFP-dsRNA embrioni iniettati sono il controllo negativo. Disfunzione è un fattore di trascrizione bHLH PAS espressi nelle cellule fusione tracheale. GFP-dsRNA embrioni iniettati mostrano normale fusione tracheale, e proteine Dys è presente nelle cellule di fusione (Figura 1A). D'altra parte, disfunzioni dsRNA embrioni iniettati mostrano fusione ramo fallito, e le proteine Dys non sono presenti nelle cellule di fusione (Figura 1B). Quando dsRNA iniettato embrioni si sviluppano allo stadio larvale, la disfunzione dsRNA larve iniettate hanno mostrato la fusione ramo fallito (Fig.1D) rispetto al GFP-dsRNA controllo iniettato negativo (Figura 1C). Questi risultati hanno dimostrato efficace abbattere di espressione genica endogena disfunzioni da dsRNA iniezione in embrioni di Drosophila
Figura 1. Rimozione della funzione di disfunzioni da disfunzione RNAi rivela tracheale fusione defects. Embrioni Blastoderm (w 1118) sono stati iniettati sia con GFP-dsRNA (controllo negativo) o disfunzioni dsRNA e analizzati per difetti tracheale. (A) Fase 16 embrioni iniettati con GFP-dsRNA e colorati con α-Dys e MAb 2A12 che macchia il lume tracheale. Prominente mostrata è il tronco laterale, che ha fuso. Le frecce indicano laterale tronco Dys cellule positive fusione. (B) Fase 16 embrioni iniettati con disfunzione dsRNA e colorati con α-Dys e MAb 2A12. L'embrione ha mostrato una mancanza di fusione tronco laterale (l'asterisco indica la posizione normale di un tronco di fusione laterale in embrioni di controllo). Nessun Dys cellule positive sono state osservate, indicando che la disfunzione RNA effettivamente abolito proteina Dys. (Da C a D) di secondo instar larve sia con GFP-dsRNA o disfunzione dsRNA sono stati esaminati dal campo chiaro microscopia per difetti tracheale. (C) Siti di fusione sono contrassegnati da un asterisco GFP-dsRNA larve controllo iniettato. (D) Il tronco laterale non è riuscito a fondere nel dys-RNA larve iniettate, (*) indica la posizione normale di una fusione tronco laterale.
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Discussion
L'attuale metodo di iniezione di dsRNA consente qui una analisi molto sensibile e rapida della funzione del gene nello sviluppo di Drosophila tracheale. Questo metodo può potenzialmente essere applicato per analizzare la funzione del gene per altri tessuti e lo sviluppo degli organi.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Stefano per Crews dysfusion cDNA, anticorpi Dys e w le mosche 1118.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Picospritzer III picopump | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | |
| Micro-pipettes | Fisher Scientific | 21170M | |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 |
References
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