RNAi Störningar av dsRNA Injektion i Drosophila Embryon

Summary

RNA-interferens har visat sig mycket effektiva för att analysera geners funktion i

Abstract

Genetisk screening är ett av de mest kraftfulla metoder som finns för att få insikter i komplexa biologiska processen ^1. Genom åren har många förbättringar och verktyg för genetisk manipulation har blivit tillgängliga i Drosophila ^2. Strax efter den första upptäckten av Frie och Mello ³ att dubbelsträngat RNA kan användas för att ÖVERVÄLDIGANDE aktiviteten av enskilda gener i Caenorhabditis elegans, RNA-interferens (RNAi) har visat sig ge en kraftfull omvänd genetisk metod att analysera gener funktioner i Drosophila organutveckling ^{4, 5.}

Många organ, inklusive lungor, njurar, lever och kärlsystemet, består av förgrenade tubulära nät som transporterar viktiga vätskor eller gaser ^{6, 7.} Analysen av Drosophila trakeal bildas ger ett utmärkt modellsystem för att studera morfogenes andra tubulära organ ^8. The Berkeley Drosophila Genome Project har avslöjat hundratals gener som uttrycks i trakeal systemet. För att studera molekylära och cellulära mekanismer av röret bildas, är utmaningen att förstå funktionen hos dessa gener i trakeal utveckling. Här beskrev vi en detaljerad metod för dsRNA injektion i Drosophila embryo till ÖVERVÄLDIGANDE enskilda genuttryck. Vi knackade framgångsrikt ner endogena dysfusion (dys) genuttrycket dsRNA injektion. Dys är en bHLH-PAS proteinet uttrycks i luftrör fusion celler, och det krävs för endotrakeal gren fusion ^{9, 10.} dys-RNAi elimineras helt dys uttryck och resulterade i luftstrupen fusion defekt. Denna relativt enkla metod ger ett verktyg för att identifiera gener requried för tissure och organ utveckling i Drosophila.

Protocol

1. Embryosamlings

1. Sätt upp burar vid 25 ° C med 2-4 dagsgamla w ¹¹¹⁸ plattor flies.Grape juice ändras varje timme under dagen för att synkronisera insamling av ägg under 1-2 dagar innan insamlingen
2. Samla embryon för 1 timme vid 25 ° C
3. Skär en rektangulär bit av druvsaft agar, skär lätt i mitten med ett rakblad, lämna en rad i agar
4. Använd en metall sond för att överföra embryon från druvsaft tallriken till din del av druvsaft agar, rada upp dem i en rak linje med embryots längre axel i 45 graders vinkel mot linjen i mitten av agar. Skaffa en rak linje på ca 50 embryon. Se till att alla embryon pekar i samma riktning, med bakre änden pekar bort från linjen.
5. Skär en rektangulär bit dubbel tejp och placera den i en 18x18mm täcka halka.
6. Plocka upp embryon med dubbel tejp på omslaget slip
7. Placera locket glida på en glasskiva, torr embryot i luften i ca 10 min.
8. Täck embryo med ett tunt lager av 700 Halocarbon olja, nu är det färdigt för injektion.

2. Dra Needle

Gör mikroinjektion nålar genom att dra glas kapillärrör. Vi använder en nål avdragare från World precisionsinstrument (Modell PUL-1). Nålen avdragare Programmet specifikationer är: värme: 1, dröjsmål 4.

3. Fyllning the Needles

Back-load nålar med Eppendorf P20 pipetten försedd med Eppendorf Microloader tips, last normalt 1,5-2 mikroliter dsRNA

4. Break the Needles

1. Innan du bryter nål och placera en täckglas på en bild.
2. Förbered en bild med en droppe olja i mitten av bilden
3. Slå på Picospritzer III picopump att justera lufttrycket
4. Bryt fyllde nålen mot kanten av ett täckglas, vilket skapar en vass spets.
5. När spetsen är trasig, steg på fotpedalen av Picospritzer III picopump kommer vissa dsRNA läcker ut ur nålspetsen.
6. Ta ut bilden med täckglas.
7. In nålen i oljan sjunka i mitten av bilden förberedd innan.
8. Justera inställningen på Picospritzer III picopump att få 100-200pl dsRNA när du trampar på fotpedalen. dsRNA kan ses som en liten droppe.

5. Injektion

1. Ta nålspetsen till den bakre delen av den första BLASTODERM embryot i samma fokalplanet och injicera embryot från mitten runt 30-50% ägg längd.
2. När du trampar på fotpedalen av Picospritzer III picopump kommer en liten mängd dsRNA visas som en liten prick i injektionsstället.

6. Fenotypisk analys

1. Efter injektion, placera glida in i en täckt fuktig kammare (plast petriskål) vid 18 ° C tills embryona utvecklas till önskad fosterstadiet.
2. Använd sond för att ta bort embryon från dubbelhäftande tejp och driva dem till kanten av locket halka.
   Tvätta embryona från bilden i en samling injektionsflaska med nylonmesh i botten med hjälp av heptan, tvätta tre gånger med PBT.
   Dechorionate embryon i 50% blekmedel i 5 minuter och tvätta tre gånger med PBT.
   Överför embryon från insamlingen flaskan till en bit av nylon mesh, och sedan doppa nylonmesh i Fixeringslösning (5 ml heptan, 4,5 ml PBS, 0,5 ml 37% formaldehyd) för att frigöra embryon. Fix embryon i fixativ lösningen för 30min.
   Devitellinize embryon med metanol, överföra embryon till ett Eppendorf-rör och immunostain embryon med hjälp av standardprotokoll.
3. Embryon kan också utvecklas till lämpliga larvstadiet.
4. Förbered en bild med en droppe Halocarbon 700 olja i mitten
5. Överför en larver till bilden, lägg ett lock halka på toppen
6. Observera larver under starkt fält mikroskop.

7. Representativa resultat:

Ett exempel på dsRNA slå ner dysfusion (dys) gen i Drosophlia embryo visas i Fig 1. GFP-dsRNA injiceras embryon som negativ kontroll. Dys är en bHLH PAS transkriptionsfaktor som uttrycks i luftrör fusion celler. GFP-dsRNA injicerade embryona visa normala luftrör fusion och Dys protein finns i fusion celler (Figur 1A). Å andra sidan, dys-dsRNA injicerade embryona visa misslyckats gren fusion och Dys proteiner är inte i fusion celler (Figur 1B). När dsRNA injiceras embryon utvecklas till larvstadiet, visade dys-dsRNA injicerade larver misslyckades gren Fusion (Fig.1D) jämfört med GFP-dsRNA injiceras negativ kontroll (Figur 1C). Dessa resultat visade att effektivt slå ner av endogena dys genuttrycket dsRNA injektion i Drosophila embryon

Figur 1. Avlägsnande av dys funktion genom dys-RNAi avslöjar trakeal fusion defects. BLASTODERM embryon (W ¹¹¹⁸⁾ injicerades med antingen GFP-dsRNA (negativ kontroll) eller dys-dsRNA och analyseras för endotrakeal defekter. (A) Etapp 16 embryo injiceras med GFP-dsRNA och färgas med α-Dys och MAb 2A12 som färgar trakeal lumen. Framträdande plats som visas är den laterala stammen, som har smält. Pilarna pekar mot laterala stammen Dys-positiva fusion celler. (B) Etapp 16 embryo injiceras med dys-dsRNA och färgas med α-Dys och MAb 2A12. Embryot visade en brist på laterala stammen fusion (asterisken indikerar normala placeringen av en lateral-trunk fusion kontroll embryon). Inga Dys-positiva celler observerades, vilket tyder på att den dys-RNA effektivt avskaffas Dys protein. (C till D) Andra INSTAR larver med antingen GFP-dsRNA eller dys-dsRNA undersöktes av ljus-fält mikroskop för endotrakeal defekter. (C) webbplatser fusion är markerade med en asterisk i GFP-dsRNA injiceras kontroll larver. (D) laterala stammen inte säkringen i den injicerade dys-RNA larver, visar (*) den normala platsen för en lateral stammen fusion.

Discussion

Den dsRNA injektionsmetod närvarande gör här en mycket känslig och snabb analys av geners funktion i Drosophila trakeal utveckling. Denna metod kan potentiellt användas för att analysera geners funktion för andra vävnader och organ utveckling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Picospritzer III picopump	Parker Hannifin Corporation	051-0500-900
Micro-pipettes	Fisher Scientific	21170M
Microloaders	Eppendorf	930001007