Summary
RNA-interferentie is bewezen zeer effectief te genfunctie te analyseren in
Abstract
Genetische screening is een van de meest krachtige methodes beschikbaar zijn voor het verkrijgen van inzicht in complexe biologische proces 1. In de loop der jaren veel verbeteringen en tools voor genetische manipulatie zijn beschikbaar in Drosophila 2. Al snel na de eerste ontdekking door Frie en Mello 3 dat dubbelstrengs RNA kan worden gebruikt om knockdown de activiteit van individuele genen in Caenorhabditis elegans, RNA interferentie (RNAi) is aangetoond dat een krachtige reverse genetische benadering van genfuncties te analyseren in Drosophila orgel ontwikkeling 4, 5.
Veel organen, zoals long-, nier-, lever-en vaatstelsel, zijn samengesteld uit vertakte netwerken die tubulaire transport vitale vloeistoffen of gassen 6, 7. De analyse van Drosophila tracheale vorming biedt een uitstekend model systeem om de morfogenese van andere buisvormige organen acht te bestuderen. De Berkeley Drosophila genoom project heeft geopenbaard honderden genen die worden uitgedrukt in de tracheale systeem. De studie van de moleculaire en cellulaire mechanismen van de buis vorming, de uitdaging is om de rol van deze genen te begrijpen in tracheale ontwikkeling. Hier beschreven we een gedetailleerde methode voor het dsRNA injectie in Drosophila embryo tot knockdown individuele genexpressie. Wij hebben met succes neergehaald endogene dysfusion (dys) genexpressie door dsRNA injectie. Dys is een bHLH-PAS eiwit, uitgedrukt in tracheale fusion-cellen, en het is nodig voor tracheale tak fusion 9, 10. dys-RNAi volledig geëlimineerd dys expressie en resulteerde in tracheale fusie defect. Deze relatief eenvoudige methode is een hulpmiddel om genen nodig voor Uw voor tissure en orgel ontwikkeling in Drosophila te identificeren.
Protocol
1. Embryoteams
- Stel kooien bij 25 ° C met behulp van 2-4 dagen oud w 1118 flies.Grape sap platen worden elke uur tijdens de dag om het ei collectie te synchroniseren gedurende 1-2 dagen periode voor collectie
- Verzamelen van embryo's voor 1 uur bij 25 ° C
- Knip een rechthoekig stuk druivensap agar, licht gesneden in het midden met een scheermesje, laat een lijn in de agar
- Gebruik een metalen sonde naar embryo transfer van druivensap plaat om jouw stuk druivensap agar, lijn ze in een rechte lijn met hoe langer de embryo-as van 45 graden ten opzichte van de lijn in het midden van de agar. Hier krijg je een rechte lijn van ongeveer 50 embryo's. Zorg ervoor dat alle embryo's wijzen in dezelfde richting, met posterior einde wijzen uit de buurt van de lijn.
- Knip een rechthoekig stuk van dubbele plakband en plaats deze op een 18x18mm dekglas.
- Pick-up embryo's met dubbele plakband op de cover slip
- Plaats het deksel glijden naar een glasplaatje, droog het embryo in de lucht voor ongeveer 10 minuten.
- Bedek de embryo met een dun laagje van 700 Halocarbon olie, nu is het klaar voor injectie.
2. Pulling Naald
Maak micro-injectie naalden door te trekken glazen capillaire buizen. We maken gebruik van een naald trekker van World precisie-instrument (Model PUL-1). De naald trekker programma specificaties zijn: warmte: 1, 4 vertraging.
3. Het vullen van de Needles
Back-load naalden met behulp van de Eppendorf pipet p20 uitgerust met Eppendorf Microloader tips, normaal belasting 1,5 tot 2 pi dsRNA
4. Breek de Needles
- Voor het breken van de naald, plaats een dekglaasje op een dia.
- Maak een dia met een druppel olie in het midden van de dia
- Zet de Picospritzer III picopump om de luchtdruk aan te passen
- Breek de gevulde naald tegen de rand van een dekglas, het creëren van een scherpe punt.
- Wanneer de tip is gebroken, stap op het voetpedaal van de Picospritzer III picopump, zullen sommige dsRNA uit lekken van de naald.
- Haal de dia met de dekglaasje aan.
- Steek de naald onder de olie druppel in het midden van de dia bereid daarvoor.
- Pas de instelling op de Picospritzer III picopump tot 100-200pl dsRNA krijgt als je stap op de voet pedaal. dsRNA kan gezien worden als een kleine druppel.
5. Injectie
- Breng de naald aan het achterste deel van de eerste blastoderm embryo in dezelfde focal plane en injecteer het embryo uit het midden rond 30-50% ei lengte.
- Nadat u stap op het voetpedaal van de Picospritzer III picopump, zal een kleine hoeveelheid dsRNA verschijnen als een kleine stip in de plaats van injectie.
6. Fenotypische analyse
- Na injectie, plaatst u de dia in een overdekte vochtige kamer (plastic petrischaal) bij 18 ° C tot de embryo's te ontwikkelen om de gewenste embryonale stadium.
- Gebruik probe om embryo's te verwijderen uit de dubbelzijdige tape en ze te duwen naar de rand van het dekglas.
Was de embryo's van de dia in een verzameling flacon met nylon gaas op de bodem met behulp van heptaan, was 3 keer met PBT.
Dechorionate embryo's in 50% bleekwater gedurende 5 minuten, en was drie keer met PBT.
Transfer embryo's uit de collectie flacon om een stuk van nylon mesh, en dan dompel de nylon mesh in het fixeermiddel oplossing (5 ml heptaan, 4.5ml PBS, 0,5 ml 37% formaldehyde) om embryo's vrij te geven. Fix embryo's in de fixeermiddel oplossing voor 30min.
Devitellinize embryo's met methanol, transfer embryo's een eppendorfbuisje, en immunostain de embryo's met behulp van standaard protocollen. - Embryo's kan ook de ontwikkeling van passende larvale stadium.
- Bereid een dia met een daling van 700 Halocarbon olie in het midden
- Overdracht een larven aan de dia, zet een dekglas op de top
- Let op larven onder felle veld microscoop.
7. Representatieve resultaten:
Een voorbeeld van dsRNA knock down dysfusion (dys) gen in Drosophlia embryo wordt getoond in Fig1. GFP-dsRNA geïnjecteerde embryo's worden de negatieve controle. Dys is een bHLH PAS transcriptiefactor, uitgedrukt in tracheale fusie cellen. GFP-dsRNA geïnjecteerde embryo's vertonen een normale tracheale fusion, en Dys eiwit is aanwezig in fusie-cellen (Figuur 1A). Aan de andere kant, dys-dsRNA geïnjecteerde embryo's tonen mislukt tak fusion, en Dys eiwitten zijn niet aanwezig in de fusie-cellen (Figuur 1B). Bij het dsRNA geïnjecteerd embryo's te ontwikkelen voor larvale stadium, de dys-dsRNA ingespoten larven toonde mislukt tak fusie (Fig.1D) in vergelijking met GFP-dsRNA geïnjecteerd negatieve controle (Figuur 1C). Deze resultaten toonden effectief naar beneden slaan van endogene dys genexpressie door dsRNA injectie in Drosophila embryo's
Figuur 1. Verwijdering van dys functie door dys-RNAi onthult tracheale fusie defects. Blastoderm embryo's (w 1118) werden geïnjecteerd met ofwel GFP-dsRNA (negatieve controle) of dys-dsRNA en getest op tracheale defecten. (A) Stage 16 embryo geïnjecteerd met GFP-dsRNA en gekleurd met α-dys en MAB 2A12 die vlekken het tracheale lumen. Prominent getoond is de laterale romp, die is gesmolten. Pijlen wijzen naar laterale romp Dys-positieve fusion cellen. (B) Stage 16 embryo geïnjecteerd met dys-dsRNA en gekleurd met α-dys en MAB 2A12. Het embryo toonde een gebrek aan laterale romp fusie (het sterretje geeft de normale locatie van een laterale-stam fusie onder controle embryo's). Geen Dys-positieve cellen waargenomen, hetgeen aangeeft dat de dys-RNA effectief Dys eiwit afgeschaft. (C naar D) Tweede-instar larven met een GFP-dsRNA of dys-dsRNA werden onderzocht door helder-veld microscopie voor tracheale defecten. (C) Sites van fusie zijn aangegeven met een asterisk in de GFP-dsRNA ingespoten controle larven. (D) De laterale romp niet zekering in de dys-RNA geïnjecteerd larven, (*) geeft de normale locatie van een laterale romp fusie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De dsRNA injectiemethode presenteren maakt hier een zeer gevoelige en snelle analyse van gen-functie in Drosophila tracheale ontwikkeling. Deze methode kan mogelijk worden toegepast op genfunctie te analyseren voor de andere weefsels en organen ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Stephen Crews bedanken voor dysfusion cDNA, Dys antilichaam en w 1118 vliegen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Picospritzer III picopump | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | |
| Micro-pipettes | Fisher Scientific | 21170M | |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 |
References
- St Johnston, D., Nusslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-219 (1992).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster. Nat. Rev. Genet. 6, 167-178 (2005).
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
- Misquitta, L., Paterson, B. M. Targeted disruption of gene function in Drosophila by RNA interference (RNA-i): a role for nautilus in embryonic somatic muscle formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 1451-1456 (1999).
- Horowitz, A., Simons, M. Branching morphogenesis. Circ. Res. 103, 784-795 (2008).
- Hogan, B. L., Kolodziej, P. A. Organogenesis: molecular mechanisms of tubulogenesis. Nat. Rev. Genet. 3, 513-523 (2002).
- Ghabrial, A., Luschnig, S., Metzstein, M. M., Krasnow, M. A. Branching morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19, 623-647 (2003).
- Jiang, L., Crews, S. T. Dysfusion transcriptional control of Drosophila tracheal migration, adhesion, and fusion. Mol. Cell. Biol. 26, 6547-6556 (2006).
- Jiang, L., Crews, S. T. The Drosophila dysfusion basic helix-loop-helix (bHLH)-PAS gene controls tracheal fusion and levels of the trachealess bHLH-PAS protein. Mol. Cell. Biol. 23, 5625-5637 (2003).
