RNAi Interferência por injeção dsRNA em Drosophila Os embriões

Summary

Interferência de RNA tem se mostrado muito eficaz para analisar a função do gene em

Abstract

Screening genético é um dos métodos mais poderosos disponíveis para a obtenção de insights sobre processo biológico complexo ^1. Ao longo dos anos muitas melhorias e ferramentas para a manipulação genética tornaram-se disponíveis em Drosophila ^2. Logo após a descoberta inicial por Frie e Mello ^3, que RNA de filamento duplo pode ser usado para knockdown a atividade de genes individuais em Caenorhabditis elegans, interferência de RNA (RNAi) foi mostrado para fornecer uma abordagem inversa genética poderosa para analisar funções de genes na Drosophila desenvolvimento dos órgãos ^{4, 5.}

Muitos órgãos, incluindo pulmões, rins, fígado e sistema vascular, são compostas de redes tubulares ramificados que os fluidos vitais de transporte ou gases ^{6, 7.} A análise da formação de Drosophila traqueal fornece um sistema de excelente modelo para estudar a morfogênese de outros órgãos tubulares ^8. O Berkeley Drosophila projeto genoma revelou centenas de genes que são expressos no sistema traqueal. Para estudar o mecanismo molecular e celular de formação do tubo, o desafio é compreender o papel destes genes no desenvolvimento traqueal. Aqui, descrevemos um método detalhado de dsRNA injeção em Drosophila embrião para knockdown expressão de genes individuais. Com sucesso derrubado endógena dysfusion expressão gênica (dis) por injeção dsRNA. Disfunção é uma proteína bHLH-PAS expressa em células de fusão de traquéia, e é necessária para a fusão ramo traqueal ^{9, 10.} dis-RNAi completamente eliminada expressão disfunção e resultou em defeito de fusão traqueal. Este método relativamente simples fornece uma ferramenta para identificar genes requried para tissure e desenvolvimento de órgãos em Drosophila.

Protocol

1. De colheita de embriões

1. Configurar gaiolas a 25 ° C usando 2-4 dias de idade w placas de suco de ¹¹¹⁸ flies.Grape são trocados a cada hora durante o dia para sincronizar a coleta de ovos ao longo de 1-2 período de dias antes da coleta
2. Coletar embriões para 1h a 25 ° C
3. Corte um pedaço retangular de ágar suco de uva, corte levemente no meio com uma lâmina de barbear, deixe uma linha no agar
4. Use uma sonda de metal para transferência de embriões a partir de chapa de suco de uva para o seu pedaço do ágar suco de uva, alinhá-los em uma linha reta com maior eixo do embrião em ângulo de 45 graus para a linha no meio do ágar. Obter uma linha reta de cerca de 50 embriões. Certifique-se de todos os pontos dos embriões na mesma direção, com extremidade posterior apontando para longe da linha.
5. Corte um pedaço retangular de fita dupla pau, e colocá-lo para uma lamínula 18x18mm.
6. Pick up embriões com fita dupla pau na lamínula
7. Coloque a lamínula para uma lâmina de vidro, secar o embrião no ar por cerca de 10 min.
8. Cobrir o embrião com uma fina camada de óleo de 700 Halocarbon, agora ele está pronto para a injecção.

2. Puxando Agulha

Faça agulhas microinjeção puxando tubos capilares de vidro. Usamos um extrator de agulhas de Instrumento Mundial Precision (Modelo PUL-1). A agulha especificações do programa extrator são: calor: 1, demora 4.

3. Preenchimento das Agulhas

Voltar carga de agulhas usando a pipeta Eppendorf p20 equipado com dicas Eppendorf Microloader, normalmente de carga 1,5-2 dsRNA mL

4. Quebrar o Needles

1. Antes de quebrar a agulha, coloque uma lamínula sobre uma lâmina.
2. Prepare uma lâmina com uma gota de óleo no meio do slide
3. Ligue o III Picospritzer picopump para ajustar a pressão do ar
4. Quebrar a agulha cheia contra a borda de uma lamínula, criando uma ponta afiada.
5. Quando a ponta está quebrada, pisar no pedal de Picospritzer III picopump, alguns dsRNA vai vazar para fora da ponta da agulha.
6. Retire a lâmina com a lamínula.
7. Inserir a agulha sob a gota de óleo no meio da lâmina preparada antes.
8. Ajustar a definição sobre o III Picospritzer picopump para obter 100-200pl dsRNA quando você pisa no pedal. dsRNA pode ser visto como uma pequena gota.

5. Injeção

1. Traga a ponta da agulha para a porção posterior do embrião blastoderma primeiro no mesmo plano focal e injetar o embrião fora do centro em torno de 30-50% de comprimento do ovo.
2. Depois de pisar no pedal do III Picospritzer picopump, uma pequena quantidade de dsRNA aparecerá como um pequeno ponto no local da injeção.

6. Análise fenotípica

1. Após a injeção, coloque o slide em uma câmara úmida coberta (placa de Petri de plástico) a 18 ° C até que os embriões se desenvolvem ao estágio desejado embrionárias.
2. Use sonda para remover embriões a partir da fita dupla face e empurrá-los para a borda da lamínula.
   Lavar os embriões para fora do slide em um frasco de coleta com malha de nylon na parte inferior usando heptano, lavar 3 vezes com PBT.
   Embriões Dechorionate em lixívia 50% por 5 min, e lavar 3 vezes com PBT.
   Transferência de embriões a partir do tubo de coleta para um pedaço de malha de nylon, e depois mergulhar a tela de náilon na solução fixadora (heptano 5ml, 4,5 ml PBS, 0,5 ml de formol 37%) para liberar os embriões. Fix embriões na solução fixadora por 30min.
   Devitellinize embriões com metanol, transferência de embriões para um tubo eppendorf e immunostain os embriões utilizando protocolos padrão.
3. Embriões também podem desenvolver a fase larval apropriado.
4. Prepare uma lâmina com uma gota de óleo Halocarbon 700 no meio
5. Transferência de uma larva para o slide, coloque uma lamínula no topo
6. Observe larvas em microscópio de campo claro.

7. Resultados representativos:

Um exemplo de dsRNA derrubar gene dysfusion (dis) em embrião Drosophlia é mostrado na Fig1. GFP-dsRNA embriões injetados são o controle negativo. Disfunção é um fator de transcrição bHLH PAS expressa em células de fusão traqueal. GFP-dsRNA embriões injetados mostrar a fusão da traquéia normal, e proteína Dys está presente em células de fusão (Figura 1A). Por outro lado, dis-dsRNA injetado embriões mostram fusão ramo falhou, e proteínas Dys não estão presentes em células de fusão (Figura 1B). Quando dsRNA injetado embriões se desenvolvem para a fase larval, as larvas dis-dsRNA injetado mostraram fusão ramo falhou (Fig.1D) em relação ao GFP-dsRNA injetado controle negativo (Figura 1C). Estes resultados mostraram eficazes derrubar de expressão de genes por disfunção endógena dsRNA injeção em embriões de Drosophila

Figura 1. Remoção de função dis por dis-RNAi revela traqueal fusão defects. Embriões blastoderma (w ¹¹¹⁸⁾ foram injetados com qualquer GFP-dsRNA (controle negativo) ou dis-dsRNA e doseados por defeitos traqueal. (A) embrião Stage 16 injetados com GFP-dsRNA e corados com α-Dys e 2A12 mAb que as manchas do lúmen traqueal. Proeminentemente mostrado é o tronco lateral, que se fundiu. Setas apontam para as células tronco laterais Dys-positivos de fusão. (B) embrião Stage 16 injetados com dis-dsRNA e corados com α-Dys e 2A12 MAB. O embrião mostrou uma falta de fusão tronco lateral (o asterisco indica a localização normal de uma fusão-lateral do tronco em embriões de controle). Nenhuma célula Dys-positivos foram observados, indicando que a dis-RNA efetivamente aboliu a proteína Dys. (C a D) de larvas de segundo ínstar tanto com GFP-dsRNA ou dis-dsRNA foram examinadas por microscopia de campo brilhante para os defeitos da traquéia. (C) Sites de fusão são indicados por um asterisco na GFP-dsRNA larvas controle injetado. (D) O tronco laterais não fusível no larvas dis-RNA injetado, (*) indica a localização normal de uma fusão tronco lateral.

Discussion

O dsRNA presentes método de injeção aqui permite uma análise muito sensível e rápido da função do gene em Drosophila desenvolvimento traqueal. Este método pode potencialmente ser aplicada para analisar a função do gene para outros tecidos e desenvolvimento do órgão.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Picospritzer III picopump	Parker Hannifin Corporation	051-0500-900
Micro-pipettes	Fisher Scientific	21170M
Microloaders	Eppendorf	930001007