תא הקלטות שלמות של המוח של מבוגרים תסיסנית

Summary

וידאו זה מדגים את נוהל בידוד המוח כולו מן הבוגרים תסיסנית כהכנה ההקלטה מתא עצב בודד באמצעות תא רגיל הטכנולוגיה כולו. זה כולל תמונות של תאים GFP ונוירונים שכותרתו שנצפו במהלך ההקלטה.

Abstract

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הליך לבודד את המוח כולו מן הבוגרים תסיסנית כהכנה ההקלטה מתא עצב אחד. נתחיל בתיאור פתרון לנתח ולתפוס של נשים בוגרות שימוש במחקרים שלנו. ההליך להסרת המוח כולו שלם, כולל שתי האונות אופטיים, מומחש. Dissection של קנה הנשימה שמעל מוצג גם. המוח מבודד הוא לא רק קטן אך זקוק לטיפול מיוחד בטיפול בשלב זה כדי למנוע נזק לתאי העצב, רבים מהם קרוב לפני השטח החיצוני של הרקמה. אנו מראים כיצד בעל מיוחדת שפיתחנו משמש כדי לייצב את המוח בחדר ההקלטה. Electrophysiology תקן להגדיר משמש ההקלטה מתא עצב יחיד או זוגות של נוירונים. תמונה ניאון, נצפים מבעד למיקרוסקופ הקלטה, מקו GAL4 נהיגה ביטוי של GFP (GH146) מדגים כיצד נוירונים השלכה (PNS) מזוהים במוח לחיות. תמונת מתח גבוה Nomarski מראה תצוגה של נוירון בודד כי הוא ממוקד עבור הקלטה התא כולו. כאשר המוח יוסר בהצלחה ללא נזק, רוב הנוירונים הם פעילים באופן ספונטני, יורים פוטנציאל פעולה ו / או להציג קלט סינפטי ספונטנית. זו הכנה באתרו, שבו כל תא הקלטה של ​​נוירונים במוח המזוהה כל יכול להיות משולב עם מניפולציות גנטיות תרופתי, הוא מודל שימושי לחקר הפיזיולוגיה פלסטיות הסלולר ב CNS מבוגר.

Protocol

I. Dissection של המוח של הזבוב הבוגר

1. המקום טיפה קטן (~ 100 μl) של ביתור פתרון במרכז של צלחת פטרי 35 מ"מ.
2. תפוס נקבה בוגרת באמצעות aspirator. תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במזרק שתי מחטים לערוף את הזבוב.
3. מקום ראש טיפה קטנה של מלח לנתח (עם papain נוסף) בצלחת פטרי.
4. עמדה בראש עם עם חוטם מול התחתון של המנה.
5. החזק את הקוטיקולה המכסה את עין שמאל מתחם עם מחט 1. בצע חתך אלכסוני המשתרע מן הגב אל פני השטח הגחון עם 2 מחט, המדיאלי רק מחט 1.
6. החזק את גפי עם מחט 1 ולהשתמש מחט 2 לעשות חתך אופקי המשתרע מפני השטח של הגחון בעין שמאל לעין ימין, ברמת הבסיס של חוטם.
7. החזק את הקוטיקולה המכסה את עין ימין מתחם עם מחט 1. בצע חתך אלכסוני המשתרע מן הגב אל פני השטח הגחון עם 2 מחט, רק המדיאלי של מחט 1.
8. סובב את ראשו כך שהצד מקורי הוא על פני צלחת פטרי. הכנס מחט 1 לציפורן בין המוח לבין מקורי, ולהשתמש מחט 2 ללכת בדרך זהה המחט הראשונה. באופן אידיאלי, הקפסולה יהיה לקלף מן המוח עם שתי האונות אופטי המחובר מאז האלה חשובים בייצוב המוח ההקלטה.
9. קנה הנשימה, שקי האוויר, ורקמות החיבור אחרים מוסרים בזהירות בעזרת שני מלקחיים טיפ נאה.
10. דיסקציה שלמים צריך לקחת 3-10 דקות

השנייה. הרכבה העצבים המרכזית

1. המוח הוא הועבר לתא הקלטה באמצעות pipet קצה צהוב.
2. בחדר הקלטה, המוח הוא התייצב על ידי הצבת מסגרת פלטינה כך שתי שערות לחצות קנס ליצור קשר עם רקמת בצומת בין האונות אופטיים אזור במוח המרכזי.
3. המוח כל מותר לנוח בחדר הקלטה עם טפטוף מתמיד עם מלוחים מחומצן (95% חמצן ופחמן דו חמצני 5%) לפחות 10 דקות. זלוף של החדר עם מלוחים מחומצן הוא המשיך לאורך כל התקופה את ההקלטה. ההכנה היא דמיינו באמצעות מיקרוסקופ זקוף (Axioskop 2FS; Zeiss, Oberkochen, גרמניה) עם במה קבועה של מים 40X טבילה אובייקטיבי (Achroplan; הצמצם המספרי, 0.8; Zeiss) ו Nomarski אופטיקה. GFP נתפסה עם מסנן הקרינה 505-530 BP.

ג. Electrophysiology

1. Pipets של 8-14 Mohms משמשים הקלטות התא כולו
2. הקלטות מהדק הנוכחי מתח-clamp מבוצעות באמצעות רשימת EPC7 או מגבר Axopatch 200B, 1322A Digidata התובע ממיר (התקנים מולקולריים, פוסטר סיטי, קליפורניה), Dimension 8200 של Dell המחשב (Dell Computer, Round Rock, TX) ו pClamp 9 תוכנה (התקנים מולקולריים).

Discussion

הכנת מבודד המוח כולו אנו מדגימים בסרטון זה מאפשר הערכה של מנגנוני הסלולר הבסיסית רגישות והעברת סינפטיים של נוירונים שזוהו, לרבות אלה המסלולים עיבוד חוש הריח, את הבוגרים תסיסנית המוח (גו ו-O דאוד, 2006). גישה זו משלימה המחקר של הפעילות העצבית במוחם של מבוגרים תסיסנית שלם (Wilson et כל 2004), ברוב ההקלטות באותה דרך של נוירונים פרוסת מוח היונקים משלימים הקלטות ביונקים מתנהג ער. ישנם שני יתרונות גדולים של כהכנה לטוס באתרו המוח בהשוואה פרוסות יונקים. ראשית המוח לטוס כולו נכנס בקלות לתוך תא ההקלטה ולכן אין צורך הבלו פיסה קטנה של רקמה עצבית מעגל גדול המתרחשת בעת ביצוע פרוסות המוח של היונקים. לכן מעגלים עצביים בתוך המוח מבודד Drospohila להישאר שלם ברובו. שנית, גופי התא של רוב הנוירונים נמצאים סמוך לפני השטח של המוח, נגיש עבור כל הקלטה התא והם נשארים פעילים מבחינה תפקודית כאשר perfused ברציפות עם מלוחים מחומצן במשך כמה שעות.

בעזרת תחתית כוס קאמרית הקלטה גם מאפשר זיהוי של נוירונים ספציפיים על בסיס מיקומם ו / או ביטוי של GFP. בהכנה זו, הקלטה במהלך זלוף מחייבת התייצבות של המוח. זו אינה תואמת את נהלי סטנדרטי, כולל חוט זהב במיקום אסטרטגי או רשת ניילון, כי הם יעילים עבור רקמות כגון פרוסות בהיפוקמפוס, בגלל גודלו הקטן של המוח כולו (~ 1mm). לכן אנו מחזיק מעוצב עם מסגרת פלטינה לחצות ניילון שערות ממוצבת לפנות את המוח רק בשני מקומות כדי למזער את הנזק נוירונים הממוקמת סמוך לפני השטח של המוח. זה מייצב את המוח, עם פני השטח או הקדמי או האחורי כלפי מעלה את פני השטח רק מול קלות מונחות על רצפת חדר ההקלטות. שימוש בהתקן זה אנו מסוגלים לשמור על שגרה יציבה הקלטות תא שלם עד שעה, גם מתא עצב קטן כולל תאים קניון, בעוד עושה מניפולציות תרופתי הדורשים יישום אמבטיה של תרופות ספציפיות. בעל צריך להיות שימושית גם בהבטחת אחרים דגימות רקמה קטנות ללימודי אלקטרו כגון פרוסות חוט השדרה של מכרסמים הילוד.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
#5 Foceps	Tool	Fine Science Tools	No. 11251-10	Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain	Reagent	Worthington Biochemical	3126	20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope	SMZ-2B Model:C-PS	Nikon Instruments		Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe		PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co	305175 & 309602	Cheap and durable
Upright microscope	Axioskop2 FS plus	Carl Zeiss, Inc.		Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier	200 B	Molecular Devices
Digidata D-A converter	1322A	Molecular Devices