Todo Recordings celular do cérebro de adultos Drosophila

Summary

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar toda cérebros de adultos Drosophila em preparação para gravar a partir de neurônios individuais usando a tecnologia de célula padrão todo. Inclui imagens de células GFP rotulados e neurônios visto durante a gravação.

Abstract

Neste vídeo, demonstramos o procedimento para isolar toda cérebros de adultos Drosophila em preparação para gravar a partir de neurônios individuais. Começamos por descrever a solução de dissecação e captura das fêmeas adultas usadas em nossos estudos. O procedimento para a remoção de todo o cérebro intacto, incluindo ambos os lobos óptica, é ilustrado. Dissecção da traquéia sobrejacente também é mostrada. O cérebro isolado não é apenas pequena, mas necessita de cuidados especiais no manuseio, nesta fase, para evitar danos aos neurônios, muitos dos quais estão perto da superfície externa do tecido. Mostramos como um suporte especial que desenvolvemos é usado para estabilizar o cérebro na câmara de gravação. A eletrofisiologia padrão criado é usado para gravar a partir de neurônios individuais ou pares de neurônios. Uma imagem fluorescente, vistos através do microscópio de gravação, de uma linha de condução GAL4 expressão GFP (GH146) ilustra como os neurônios de projeção (PNs) são identificados no cérebro vivo. A imagem de alta potência Nomarski mostra uma visão de um único neurônio que está sendo alvo para gravação de células inteiras. Quando o cérebro é removido com sucesso sem danos, a maioria dos neurônios são espontaneamente ativos, disparando potenciais de ação e / ou exibindo entrada sináptica espontânea. Esta em preparação local, em que a gravação de células inteiras de neurônios identificados em todo o cérebro pode ser combinado com manipulações genéticas e farmacológicas, é um modelo útil para explorar fisiologia celular e plasticidade no SNC adulto.

Protocol

I. Dissecção de cérebros da mosca adulta

1. Coloque uma pequena gota (~ mL 100) de dissecar solução no centro de uma placa de Petri 35 mm.
2. Pegar fêmea adulta utilizando aspirador. Sob microscópio de dissecação, use duas agulhas de seringa para decapitar a voar.
3. Cabeça no lugar uma pequena gota de solução salina de dissecação (com papaína adicionados) numa placa de Petri.
4. Posição com cabeça com tromba de frente para fundo do prato.
5. Segure a cutícula que cobre o olho composto esquerdo com agulha 1. Faça um corte diagonal que se estende desde o dorsal para a superfície ventral com agulha 2, apenas medial a agulha 1.
6. Segure o aparelho bucal com agulha e usar uma agulha de 2 para fazer um corte horizontal que se estende desde a superfície ventral do olho esquerdo para o olho direito, ao nível da base da tromba.
7. Segure a cutícula que cobre o olho composto direito, com agulha 1. Faça um corte diagonal que se estende desde o dorsal para a superfície ventral com agulha 2, apenas medial da agulha 1.
8. Gire a cabeça para que o lado rostral está na superfície placa de Petri. Insira a agulha 1 entre a cutícula rostral e cérebro, e usar agulhas de 2 a seguir o mesmo caminho como a primeira agulha. Idealmente, a cápsula será se desfazer do cérebro com ambos os lobos óptica anexada uma vez que estes são importantes na estabilização do cérebro para a gravação.
9. Traquéia, sacos de ar, e outros tecidos conectivos são cuidadosamente removidos com duas pinças de ponta fina.
10. Dissecção todo deve tomar 30-10 minutos

II. Montagem do CNS

1. O cérebro é transferido para a câmara de gravação usando uma pipeta de ponta amarela.
2. Na câmara de gravação, o cérebro é estabilizado pela colocação do quadro de platina de forma que dois mira bem fazer contato com o tecido na junção entre os lobos ópticos e região do cérebro central.
3. Cada cérebro é permitido descansar na câmara de gravação com perfusão contínua com solução salina oxigenada (95% de oxigênio e dióxido de carbono de 5%) durante pelo menos 10 minutos. Perfusão da câmara com solução salina oxigenada é continuado durante todo o período de gravação. Preparação é visualizada utilizando um microscópio vertical (Axioskop 2FS; Zeiss, Oberkochen, Alemanha), com um palco fixo e uma objetiva de imersão 40x de água (Achroplan; abertura numérica, 0,8; Zeiss) e Nomarski óptica. GFP foi visto com um 505-530 BP de filtros de fluorescência.

III. Eletrofisiologia

1. Pipetas de 14/08 Mohms são usados ​​para gravações de células inteiras
2. Gravações braçadeira de tensão e corrente-clamp são realizadas usando uma Lista de EPC7 ou um amplificador Axopatch 200B, a Digidata 1322A DA conversor (dispositivos Molecular, Foster City, CA), um Dell Dimension 8200 computador (Dell Computer, Round Rock, TX), e pClamp 9 software (dispositivos Molecular).

Discussion

A preparação do cérebro isolado todo ilustramos neste vídeo permite a avaliação dos mecanismos celulares subjacentes a excitabilidade ea transmissão sináptica em neurônios identificados, incluindo aqueles em vias de processamento olfativo, no adulto Drosophila cérebro (Gu e O Dowd, 2006). Esta abordagem é complementar ao estudo da atividade neuronal no cérebro de adultos intactos Drosophila (Wilson et all, 2004), em grande parte as gravações mesma forma dos neurônios em uma fatia do cérebro de mamíferos são complementares às gravações em mamíferos acordado comportando. Há duas grandes vantagens do em preparação situ voar cerebral quando comparado com as fatias de mamíferos. Primeiro, o cérebro da mosca toda se encaixa facilmente na câmara de gravação de modo que não é necessário para extirpar um pequeno pedaço de tecido de um grande circuito neural que ocorre ao fazer fatias de cérebro de mamíferos. Portanto, os circuitos neuronais no cérebro Drospohila isolados permanecem em grande parte intactos. Em segundo lugar, os corpos celulares da maioria dos neurônios estão perto da superfície do cérebro, facilmente acessível para a gravação de células inteiras e permanecem funcionalmente ativas quando continuamente perfundidos com solução salina oxigenado por várias horas.

Usando um vidro de câmara de gravação de fundo também permite a identificação de neurônios específicos em função da sua localização e / ou expressão GFP. Nessa preparação, a gravação durante a perfusão requer estabilização do cérebro. Isto não é compatível com os procedimentos padrão, incluindo fio de ouro estrategicamente colocadas ou malha de nylon, que são eficazes para os tecidos, tais como fatias do hipocampo, devido ao tamanho pequeno de todo o cérebro (~ 1mm). Portanto, um suporte projetado com uma moldura de platina e os cabelos de nylon cruz posicionado para contactar o cérebro em apenas dois locais para minimizar os danos aos neurônios localizados perto da superfície do cérebro. Isso estabiliza o cérebro, tanto com a superfície anterior ou posterior para cima ea superfície oposta apenas levemente apoiado no chão da câmara de gravação. Usando este dispositivo, somos capazes de manter estável rotineiramente gravações de células inteiras por até uma hora, até mesmo de neurônios pequenos, incluindo células Kenyon, ao fazer manipulações farmacológicas que exigem a aplicação de banho de drogas específicas. O titular também deve ser útil na obtenção de outras pequenas amostras de tecido para estudos eletrofisiológicos, como fatias de medula espinhal de roedores neonatal.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
#5 Foceps	Tool	Fine Science Tools	No. 11251-10	Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain	Reagent	Worthington Biochemical	3126	20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope	SMZ-2B Model:C-PS	Nikon Instruments		Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe		PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co	305175 & 309602	Cheap and durable
Upright microscope	Axioskop2 FS plus	Carl Zeiss, Inc.		Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier	200 B	Molecular Devices
Digidata D-A converter	1322A	Molecular Devices