Summary
Dit artikel beschrijft de procedure voor de vorming en visualisatie van een bacteriële biofilm gegroeid binnen een 8-well kamer slide
Abstract
Het chronische karakter van veel ziekten wordt toegeschreven aan de vorming van bacteriële biofilms die recalcitrant de traditionele behandeling met antibiotica. Biofilms zijn community-geassocieerde bacteriën gehecht aan een oppervlak en ingekapseld in een matrix. De rol van de extracellulaire matrix is veelzijdig, waaronder het faciliteren van voedingsstoffen verwerving, en biedt aanzienlijke bescherming tegen milieu-invloeden (bijv. gastheer immuunreacties). In een poging om een beter inzicht te verwerven over hoe de bacteriën in een biofilm te reageren op milieu-invloeden hebben we gebruik gemaakt van een protocol waarin we visualiseren bacteriële biofilms, die zijn gevormd in een 8-well kamer schuiven. De biofilms werden gekleurd met de BacLight Live / Dead vlek en onderzocht met behulp van een confocale microscoop om de relatieve biofilm omvang en structuur karakteriseren onder verschillende incubatie-omstandigheden. Z-stack beelden werden verzameld via confocale microscopie en geanalyseerd door COMSTAT. Dit protocol kan worden gebruikt om opheldering van het mechanisme en de kinetiek waardoor biofilms vormen, evenals de bestanddelen die belangrijk zijn voor biofilm structuur en stabiliteit.
Protocol
1. In Vitro biofilmvorming
- Bacteriekolonies (die zijn gekweekt op juiste agar 's nachts), werden opgeschort in de media en de OD 490 is aangepast aan 0,65
- De resulterende bacteriële suspensie werd vervolgens verdund 01:06 (1 ml bacteriesuspensie + 5 ml voorverwarmd medium) en geïncubeerd bij 37 ° C met 5% CO 2 voor ongeveer 3 uur om de mid-log-fase te bereiken.
- Verdun de mid-log groei ophanging 1:2500 met voorverwarmd media en plaats 200 pi van de verdunning in elke well van een 8-well kamer glijbaan.
- Incubeer bij 37 ° C met 5% CO 2.
- Na ongeveer 16 uur, aspireer medium van de hoek van elke kamer en voeg 200 pi verse, voorverwarmde medium - afzien langs de muur van de kamer, zodat er geen afschuifkrachten te creëren in de kamer die de biofilm kunnen verstoren.
- Als het incuberen van langer dan 24 uur, veranderen medium elke 12 uur of als nodig is om bacteriële levensvatbaarheid te behouden.
2. Visualisatie van Biofilm
- Aspireren medium van elke kamer, zoals hierboven beschreven, en was woonachtig biofilm twee keer voorzichtig met een steriele zoutoplossing.
- Voeg 200 ul van BacLight Live / Dead vlek (3 pL component A + 3 pi component B per ml zout) aan elk putje en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Bescherm de cultuur van het licht vanaf dit punt verder.
- Aspireren de vlek en voorzichtig twee keer wassen met steriele zoutoplossing als voorheen.
- Voeg 200 ul van neutraal gebufferde formaline in elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur monster op te lossen.
- Verwijder fixatief en correct in de afvoer in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.
- Was tweemaal met zout en gooi de was vloeistoffen die bevatten formaline als hierboven.
- Verwijder het plastic putten uit de dia, voeg genoeg zout in elk putje, zodat wanneer een dekglaasje wordt geplaatst op de pakking, geen luchtbellen aanwezig zijn.
- Dekglaasje en afdichting van de randen van het dekglaasje met montage medium. Nagellak kunnen gebruikt worden om de dia's zegel echter de dia's worden niet als permanente.
- Laat de kit vooraf drogen ongeveer 1 uur tot het onderzoek via microscopie.
3. Resultaten
Figuur 1. Vertegenwoordiger 3D samengestelde beelden van een biofilm gevormd in een 8-well kamer schuiven. Bacteriën werden gemerkt met Live / Dead beits, waarin levende bacteriën fluoresceren groene en dode bacteriën rood fluoresceren. (A) Composiet beeld van de gehele biofilm met verschillende architectuur met torens en water kanalen. (B) Zelfde biofilm als in (A), nu gezien in dwarsdoorsnede.
Discussion
Het begrijpen van het mechanisme waarmee biofilms vormen, evenals kenmerkend hun matrix componenten, is een gebied van intense belangstelling. Dit protocol kan worden gebruikt om te helpen identificeren eiwitten of andere bestanddelen die bijdragen aan de structurele integriteit van de biofilm, maar ook helpen bij het identificeren en doeleiwitten die zich kunnen lenen voor een therapeutische toepassing.
De incubatie tijden en verdunningen in de hierboven beschreven protocol zijn vastgesteld voor een optimale biofilmvorming door nontypeable Haemophilus influenzae (NTHI). Wat voorbereidend werk kan nodig zijn om deze stappen voor andere bacteriesoorten te optimaliseren (dat wil zeggen de eerste verdunning en incubatie tijd die nodig is om mid-log-fase groei te realiseren). De 1:2500 verdunning voor de eerste zaaien van de kamers werd opgericht om ervoor te zorgen dat een robuuste biofilm zich zou ontwikkelen in de kamer dia's veroorzaakt door dit organisme en binnen de incubatietijden verklaard, zonder dat de biofilm begroeiing de kamer en / of vermoeiende beschikbare voedingsstoffen . Bijgevolg kan de initiële verdunning en of incubatie tijden moeten worden aangepast voor andere bacteriële soorten.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Het werk werd gefinancierd door het NIDCD, toont / NIH R01DC003915 naar LO Bakaletz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate II agar | Fisher Scientific | B21267X | |
| 8-well chamber slides | Fisher Scientific | 12-656-18 | |
| BacLight Live/Dead bacterial viability kit | Fisher Scientific | NC9439023 | |
| BHI | Fisher Scientific | 211059 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H5533 | |
| β-NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Permaslip mounting media | Fisher Scientific | NC9693613 |
References
- Bakaletz, L. O. Bacterial biofilms in otitis media: evidence and relevance. Pediatr Infect Dis J. 26, Suppl 10. S17-S19 (2007).
- Heydorn, A., Nielsen, A. T., Hentzer, M., Sternberg, C., Givskov, M., Ersboll, B. K., Molin, S. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
