Summary
Questo articolo descrive la procedura per la formazione e la visualizzazione di un biofilm batterico cresciuto all'interno di un 8-scivolo e da camera
Abstract
La natura di molte malattie croniche è attribuito alla formazione di biofilm batterici che sono recalcitranti alla tradizionale terapia antibiotica. Biofilm sono comunità di batteri associati collegato a una superficie e racchiusi in una matrice. Il ruolo della matrice extracellulare è multiforme, anche facilitando l'acquisizione di nutrienti, e offre una protezione significativa contro gli stress ambientali (ad esempio risposta immunitaria). Nel tentativo di acquisire una migliore comprensione di come i batteri in un biofilm rispondere agli stress ambientali che abbiamo usato un protocollo in cui noi visualizziamo biofilm batterici che si sono formati in un 8-scivolo e da camera. I biofilm sono stati colorati con la BacLight Live / Dead macchia ed esaminate con un microscopio confocale a caratterizzare la dimensione relativa biofilm, e la struttura in diverse condizioni di incubazione. Z-stack immagini sono state raccolte tramite microscopia confocale e analizzati da COMSTAT. Questo protocollo può essere utilizzato per contribuire a spiegare il meccanismo e cinetica con cui formare biofilm, oltre a identificare i componenti che sono importanti per la struttura biofilm e la stabilità.
Protocol
1. Nella formazione di biofilm in vitro
- Colonie batteriche (che sono state coltivate su agar appropriato durante la notte), sono stati sospesi nei media e la OD 490 è stato rettificato a 0,65
- La sospensione batterica risultante è stato poi diluito 1:6 (1 ml di sospensione batterica + 5 ml preriscaldata media) e incubate a 37 ° C con 5% di CO 2 per circa 3 ore per raggiungere la metà del log fase.
- Diluire il mid-log 1:2500 sospensione di crescita con pre-riscaldato media e 200 ul luogo di diluizione in ciascun pozzetto di una 8-scivolo e da camera.
- Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Dopo circa 16 ore, media aspirato da un angolo di ogni camera e aggiungere 200 microlitri fresco, pre-riscaldato a medio - lungo dispensare muro di camera in modo da non creare forze di taglio all'interno della camera che potrebbe disturbare il biofilm.
- Se incubazione più lungo di 24 ore, il cambiamento medio ogni 12 ore o secondo necessità per mantenere la vitalità dei batteri.
2. Visualizzazione dei biofilm
- Aspirare il terreno da ogni camera, come sopra descritto, e lavare biofilm residente due volte delicatamente con soluzione salina sterile.
- Aggiungere 200 ml di BacLight Live / Dead macchia (3 microlitri componente A 3 componente B + microlitri per mL di soluzione salina) per ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Proteggere la cultura dalla luce da questo punto in avanti.
- Aspirare la macchia e lavare due volte delicatamente con soluzione salina sterile come prima.
- Aggiungere 200 ml di formalina neutra tamponata ad ogni pozzetto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per risolvere campione.
- Rimuovere fissativo e smaltire in conformità alle direttive istituzionali.
- Lavare due volte con soluzione salina e smaltimento dei liquidi di lavaggio contenenti formalina come sopra.
- Rimuovere i pozzi di plastica dalla diapositiva, aggiungere abbastanza salina in ogni pozzetto in modo che quando un coprioggetto è posto sulla guarnizione, non siano presenti bolle d'aria.
- Coprioggetto e sigillare i bordi del coprioggetto con mezzo di montaggio. Smalto per le unghie può essere utilizzato per sigillare le diapositive tuttavia le diapositive non sarà permanente.
- Lasciare che il sigillante ad asciugare per circa 1 ora prima di analizzare tramite microscopia.
3. Risultati
Figura 1. Rappresentante immagini 3D composito di un biofilm formati in una 8-scivolo e da camera. I batteri sono stati etichettati con Live / Dead macchia batteri in cui vivono i batteri fluorescenti verdi e morto fluorescenza rossa. (A) immagine composita di biofilm intera che mostra l'architettura diversi con torri e canali d'acqua. (B) biofilm Stessa (A), ora visto in sezione trasversale.
Discussion
Comprendere il meccanismo con cui biofilm forma, così come caratterizzante la loro componenti della matrice, è un'area di grande interesse. Questo protocollo può essere usato per aiutare a identificare le proteine o altri costituenti che contribuiscono alla integrità strutturale del biofilm, così come aiutare a identificare e target le proteine che possono si prestano ad una applicazione terapeutica.
I tempi di incubazione e diluizioni nel protocollo sopra descritti sono stati stabiliti per la formazione di biofilm ottimale nontypeable da Haemophilus influenzae (NTHI). Alcuni lavori preliminari può essere necessaria per ottimizzare questi passaggi per altre specie di batteri (ad esempio diluizione iniziale e tempo di incubazione necessario per raggiungere la metà del log fase di crescita). La diluizione 1:2500 per la semina iniziale delle camere è stato creato per garantire che un biofilm robusta si svilupperebbe in camera di diapositive come indotta da questo organismo e nei tempi di incubazione ha dichiarato, senza il biofilm overgrowing la camera e / o estenuanti sostanze nutritive disponibili . Di conseguenza, la diluizione iniziale e tempi di incubazione possono o devono essere adeguate per le altre specie batteriche.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il lavoro è stato finanziato dalla dell'NIDCD / NIH R01DC003915 a LO Bakaletz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate II agar | Fisher Scientific | B21267X | |
| 8-well chamber slides | Fisher Scientific | 12-656-18 | |
| BacLight Live/Dead bacterial viability kit | Fisher Scientific | NC9439023 | |
| BHI | Fisher Scientific | 211059 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H5533 | |
| β-NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Permaslip mounting media | Fisher Scientific | NC9693613 |
References
- Bakaletz, L. O. Bacterial biofilms in otitis media: evidence and relevance. Pediatr Infect Dis J. 26, Suppl 10. S17-S19 (2007).
- Heydorn, A., Nielsen, A. T., Hentzer, M., Sternberg, C., Givskov, M., Ersboll, B. K., Molin, S. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
