Summary
이 문서는 8 자 챔버 슬라이드 내에서 성장 세균 biofilm의 형성과 시각화를위한 절차를 설명
Abstract
많은 질병의 만성적인 자연 전통적인 항생제 치료에 완강히 저항하는 세균성 biofilms 아르의 형성에 기인합니다. Biofilms는 표면에 붙어 매트릭스으로 쌌다는 지역 사회 관련 세균입니다. 세포외 기질의 역할은 영양소 획득을 촉진 포함하여 다각이며, 환경 스트레스 (예 : 호스트 면역 응답)에 대해 상당한 보호를 제공합니다. biofilm 내에 박테리아가 우리가 8 자 챔버 슬라이드에 형성 박테리아 biofilms을 시각화 궁극적 우리가 프로토콜을 사용한 환경 스트레스에 대응하는 방법으로 이해를 얻기위한 노력의 일환으로. biofilms는 얼룩 데드 / 라이브 BacLight 물들일 및 배양 조건을 변화에 따라 상대 biofilm의 크기 및 구조를 특징으로 공촛점 현미경을 사용하여 조사했다. Z - 스택 이미지 공촛점 현미경을 통해 수집 COMSTAT에 의해 분석되었다. 이 프로토콜은 메커니즘과 반응 속도론 biofilms 양식에서뿐만 아니라, biofilm 구조와 안정성에 중요한 구성 요소를 식별하는 데 도움을 명료하게하다하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
1. 체외의 Biofilm 형성에
- 세균성 식민지는 (야간 적절한 한천에서 성장했습니다)을, 미디어 중단되었으며 OD 490이 0.65으로 조정되었습니다
- 그 결과 세균 현탁액은 다음 1시 6분 (1 ML 세균 현탁액 + 5 ML 미리 예열 중간) 희석과 ° C가 약 3 시간 동안 5 % CO 2 중반 로그 단계에 도달하기 위해 37 incubated했다.
- 8 잘 챔버 슬라이드의 각 우물에 미리 예열 미디어 및 장소 희석 200 μL와 중반 로그 성장 서스펜션 1:2500을 희석.
- 37 ° C 5 % CO 2를 품어.
- 후 약 16시간, 기음 각 챔버 코너에서 중간 200 μL 신선한 사전 예열 중간 추가 -만큼 biofilm을 방해 할 수있는 챔버 내에서 전단 세력을 만들 수 없습니다 챔버 벽을 따라 분배합니다.
- 이상 24 시간 이상의 잠복기 경우, 중간 매 12 시간을 변경하거나 같은 박테리아 생존을 유지하는 데 필요한.
2. Biofilm의 시각화
- 위에서 설명한 바와 같이, 각각의 챔버에서 매체를 대기음하고, 무균 식염수에 두 번 가볍게 주민 biofilm을 씻으십시오.
- 각 잘하는 BacLight 데드 / 라이브 얼룩 (3 μL 구성 요소 호수의 ML 당 + 3 μL 부품 B) 200 μL를 추가하고 15 분 동안 상온에서 알을 품다. 이 시점 이후부터의 빛으로부터 문화를 보호할 수 있습니다.
- 얼룩을 대기음하고 이전과 멸균 식염수에 가볍게 두 번 씻는다.
- 각 잘하기 위해 포르말린 버퍼 중립 200 μL를 추가하고 시료를 해결하기 위해 상온에서 30 분 알을 품다.
- 정착액 제거하고 제대로 제도적 지침에 따라 폐기.
- 식염수에 두 번 씻고 위와 같이 포르말린이 들어있는 세척 유체 처리.
- coverslip이 근육에 배치되었을 때, 기포가 존재하지 않습니다 잘 있도록 슬라이드에서 플라스틱 우물을 제거 각각 살린만큼 추가할 수 있습니다.
- 설치 매체로 coverslip의 Coverslip 날인은 가장자리. 매니큐어는 그러나 슬라이드가 영구적으로하지 않습니다 슬라이드를 봉인하는 데 사용할 수 있습니다.
- 밀봉이 현미경을 통해 검사하기 전에 약 1 시간 동안 건조하실 수 있습니다.
3. 검색 결과
그림 1. 8 잘 챔버 슬라이드에 형성된 biofilm의 대표 3D 합성 이미지. 박테리아가 라이브 / 데드 얼룩이 궁극적으로 사는 박테리아와 라벨이 붙지만는 녹색과 죽은 박테리아가 적색 형광 형광. 타워 물을 채널과 독특한 건축 양식을 보여주는 전체 biofilm의 (A) 복합 이미지. (B) 같은 biofilm은 같이 (A), 지금 단면에서 본.
Discussion
biofilms이 양식을하는 메커니즘뿐만 아니라 자신의 매트릭스 구성 요소를 특성화로, 이해하는 것은 강렬한 관심의 영역입니다. 이 프로토콜은 단백질이나 구조 biofilm의 무결성뿐만 아니라 식별 및 치료 응용 프로그램에 자신을 빌려 있습니다 단백질을 타겟으로 도움에 기여하는 다른 성분을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
위에서 설명한 프로토콜에서 배양 시간 및 dilutions은 nontypeable 헤모필러스 인플루엔자 (NTHI)에 의해 최적의 biofilm 형성을 위해 설립되었습니다. 일부 예비 작업 (예 : 초기 희석 중반 로그 위상 성장을 달성하기 위해 필요한 배양 시간) 다른 세균 종에 대해 이러한 단계를 최적화해야 할 수도 있습니다. 챔버의 초기 시딩에 대한 1:2500 희석이 가능한 영양소를 챔버 overgrowing 및 / 또는 소진 biofilm없이 강력한 biofilm과 같이이 유기체에 의해 유도된 챔버 슬라이드와 배양 시간이 명시된 이내에 개발한다고 보장하기 위해 설립되었습니다 . 따라서, 초기 희석 및 또는 부화 시간은 다른 세균 종에 따라 조정해야 할 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
작품은 LO Bakaletz에 NIDCD / NIH에 의해 투자 R01DC003915했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate II agar | Fisher Scientific | B21267X | |
| 8-well chamber slides | Fisher Scientific | 12-656-18 | |
| BacLight Live/Dead bacterial viability kit | Fisher Scientific | NC9439023 | |
| BHI | Fisher Scientific | 211059 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H5533 | |
| β-NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Permaslip mounting media | Fisher Scientific | NC9693613 |
References
- Bakaletz, L. O. Bacterial biofilms in otitis media: evidence and relevance. Pediatr Infect Dis J. 26, Suppl 10. S17-S19 (2007).
- Heydorn, A., Nielsen, A. T., Hentzer, M., Sternberg, C., Givskov, M., Ersboll, B. K., Molin, S. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
