3D Nöral Kök Hücre Kültürü yerelleştirme Protein: Hybrid Görselleştirme Metodolojisi

Summary

Burada, üç boyutlu (3D) kültür üretmek genişletmek ve immunolabel postnatal hipokampal nöral progenitör hücrelerin (NPC) nasıl açıklar. Sonra, hibrid görselleştirme teknolojiler kullanılarak, dijital görüntüler immunolabelled cryosections tüm 3D neurosphere boyunca immünopozitif hücreler mekansal konumunu yeniden ve harita için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Abstract

Nöral kök ve progenitör hücre etkileyen 3 boyutlu (3D) topografyanın önemi (NPC) fenotipi yaygın henüz çalışmaya zorlu kabul edilmektedir. Embriyonik veya doğum sonrası beyin ne zaman ayrışmış, tek NPC'ler neurospheres formu askıya çoğalacak. Bu kültürlerin içinde kızı hücreleri aynı ekstrasellüler ortam maruz olmasına rağmen kendiliğinden genişleme içerisinde farklı gelişim soyları (nöronlar, oligodendrosit ve astrositler) benimsemek. Bu ilerlemesini özetlediği aşamaları çoğu doğum sonrası beyindeki nöron ve gliogenesis boyunca gözlenen ve kontrollü bir ortam içinde temel NPC biyoloji okumak için sık sık kullanılır. NPC kaderi bu kültürlerin içinde 3D topografya ve hücresel konumlandırma tam etkisini değerlendiren Ancak, zordur. Hedef proteinler lokalize ve immünhistokimya ile NPC soy belirlemek için, serbest neurospheres bir substrat üzerindeki kaplama veya seri kesitli olmalıdır. Bu işleme eşdeğer hücre permeabilization ve küreden antikor erişim sağlamak için gereklidir. Sonuç olarak, cryosections veya 3D Z-yığınlarının konfokal rekonstrüksiyonlar epifluorescent 2D görüntüleri sadece mekansal ayrık fiziksel veya dijital 3D dilimleri içinde hücre konumu hakkında bilgi verebilir ve bozulmamış bir alanda hücresel konum görselleştirmek yok. Burada neurosphere kültür topografya yinelemek ve tüm kültür boyunca protein ekspresyonu mekansal analizi izin verecek, biz bir protokol izolasyonu için, genişleme ve hedef proteinlerin epifluorescent veya konfokal İmmuno için uygun doğum sonrası hipokampal neurospheres seri kesit sunuyoruz. Connexin29 (Cx29) bir örnek olarak analiz edilir. Sonra, grafik düzenleme ve 3D modelleme bir melez kullanarak biyolojik detay titizlikle korumak için uygulanan yazılımları, bu görüntülerin 3 boyutlu yapısal konumlandırma yeniden birleştirmek ve dijital olarak tam neurosphere içinde etiketli hücreler haritası nasıl açıklar. Bu metodoloji, tüm 3D kültür topoğrafya boyunca hedef proteinleri ve hücreleri hücresel pozisyon görselleştirme ve analiz sağlar ve daha ayrıntılı bir analizi, in vitro nöron ve gliogenesis boyunca hücreleri arasındaki mekansal ilişkileri kolaylaştıracaktır.

Imbeault ve Valenzuela Her ikisi de eşit derecede katkıda bulunan ve ilk yazarın ortak düşünülmelidir.

Protocol

1. Sinir Progenitör Hücreler izolasyonu

Izolasyon protokol sırasında her zaman soğuk doku ve çözümler tutun!

1. Kültürler başlamadan önce, aşağıdaki stok çözümleri hazırlar:
   • Disosiyasyon medya (26 mM NaHCO _3, 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.1 mM CaCl ₂ * 2H ₂ O, 3.2 mM MgCl ₂ * 6H ₂ O, 10 mM D-glukoz, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml Sinir proteaz (25 mg: -20 ° C. çift distile H ₂ O, steril filtre ve -20 ° C'de muhafaza alikotları hücresel disosiasyon için kullanılan enzimler stok konsantrasyonları hazırlayın streptomisin Steril filtre ve 10-15 mL alikotları mağaza / ml), papain (10 mg / ml), DNAseI (10 mg / ml) Deney günü, şu son konsantrasyonlarda Ayrılma Medya 15 ml enzimleri eklemek: 1 mg / ml proteaz, 0.1 mg / son enzim konsantrasyonları içeren ml papain, 0.1 mg / ml DNAz I. Diseksiyon çözüm diseksiyon işlemi sırasında buz üzerinde tutulmalıdır.
   • Bakım Medya: Dulbecco'nun modifiye Eagle orta F12 (DMEM/F12), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin, 1X B27 takviyesi. 4 3 aya kadar saklanabilir ° C, B27 takviyesi ve bir ay olmadan 4 ° C B27 takviyesi.
   • Büyüme faktörleri: 0,1 mcg / ml rekombinant insan epidermal büyüme faktörü (hEGF) ve 10 mcg / mL stok alikotları hazırlayın DMEM/F12 fibroblast büyüme faktörü-2 (FGF-2) +% 0.1 sığır serum albumini (BSA). -20 ° C'de muhafaza
2. Ölümcül C57BL / 6 fare yavrular uyutmak için, fare postnatal günde 0-3 Euthansol intraperitoneal olarak enjekte edilir.
3. 26 mM NaHCO _3, 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl ₂ * 2H ₂ O, 1.3 mM MgCl ₂ * 6H ₂ O: Dikkatlice standart diseksiyon ve 60 mm çanak yapay beyin omurilik sıvısı içeren bir mağaza (ACSF beyinleri kaldırmak 10 mM D-glukoz, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin). 7.3 pH 50 ml alikotları gerekli ve steril filtre, -20 ° C'de saklayın
4. Krazy Glue, rostral yüzü yukarı, dorsal taraf size bakacak şekilde, beyincik ve tutkal beyin vibratome Chuck üzerine kaldırarak bir tıraş bıçağı, blok beyin kullanma. A Leica Microsystems VT1000S vibratome Bu protokolde kullanılır.
5. Pozisyon vibratome mandreni ve uygun bölmeye ACSF ve buz ekleyin.
6. 8.5 3,5-4,5 ve sıklığı arasında bir hız ile 500 mm kesim dilim kalınlıkları.
7. ACSF içeren yemekler hipokampal formasyon içeren dilim toplayın.
8. (ACSF olmadan) (CA3 bölgede eğri ventral başlayıncaya kadar), bir stereomikroskopta bregma -1,60 mm -2,40 mm arasındaki hippocampi kaldırmak ve yeni bir kuru yemek yer. Bu protokolde bir Leica MZ6 diseksiyon mikroskobu kullanılmaktadır.
9. Tüm hippocampi topladıktan sonra, bir neşter ile doku kıyma (homojen bir ve sıvılaştırılmış görünüm elde edilene kadar).
10. Kıyılmış doku sinir proteaz, papain, ve DNAz I (# 1, çözüm hazırlık için adım) içeren 2.5 ml Ayrılma medya içeren 15 ml'lik polipropilen tüpe aktarın. Bir sürü kaynak doku varsa (örneğin, 6 yavrular) optimal enzim korumak için 2.5 ml disosiasyon medya 2 şişe kullanmak iyi bir fikirdir: doku oranı. Ile 37 ° C 'de 45-60 dakika süreyle rotasyon inkübe edin. A Labnet ProBlot 6 hibridizasyon fırın (Mandel Bilimsel yoluyla satın), döndürme ayarı 4 bu protokol kullanılır.
11. 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj: 10 ml steril doku kültürü potasyum fosfat tamponlu salin (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM fosfat tamponu, pH 7.4 kpbs) ekleyin. Bir Eppendorf santrifüj (model 5702) bu protokol kullanılır.
12. Kpbs 5 ml supernatant ve tekrar süspansiyon pelet atın.
13. Pasteur pipeti ile öğütme doku ayrıştırmaları.
14. 5 dakika boyunca 300 xg'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin.
15. Bakım orta 3 mL yeniden süspanse hücreleri, 60 mm yapışmaz yemekler Tripan Mavi ve plaka hücreleri kullanarak hücrelerin sayısı 2.5 x 10 ⁵ hücre yoğunluğu (Corning Ultra Düşük bağlılık bağlayıcı yemekler bu protokolü kullanılır, Malzeme bakınız) / 5 ml bakım orta çanak. Petri kutularına Ultra Düşük bağlılık yemekler yerine kullanılabilir, ancak kültürler, kaplama ve spontan farklılaşma önlemek için in vitro ilk 6 gün boyunca genişleme (DIV) sırasında her gün sabah ve öğleden sonra aday olması gerekecektir.
16. 10 ng / ml kaplama sonra hemen bir son konsantrasyonu 20 ng / ml ve FGF-2 final konsantrasyon hEGF ekleyin. 14 DIV toplama gününe kadar genişleme aşamasında her iki günde bir ek büyüme faktörleri ekleyin. (Genişleyen neurospheres video Ölçek bar, 100 mm temsil.)

** Not: medya genişleme evresi yaklaşık 10 DIV sarı olabilir. Bu olursa, başka bir 1 ml Mai eklemekntenance medya. Medya ertesi gün tekrar sarı ise, başka bir 1 ml Bakım medya eklemek genişleme aşamasında gerekli Bunu yaparken tutmak doğru final konsantrasyonlarını korumak için, buna göre büyüme faktörleri ses seviyesini ayarlamak unutmayın.

2. Seri Cryosectioning

1. Fiksasyon için küreler fiksasyon zamanda iyi ayrılmış sağlamak için önce neurospheres hafifçe dokunun.
2. Doğrudan kültürlerin yavaş sallayarak 20 dakika boyunca oda sıcaklığında% 3.7 ve inkübe bir final konsantrasyonu (RT) moleküler sınıf formaldehit ekleyin. Bir Stovall Belly Dancer 2.5 dönme hızı bu protokol kullanılır.
3. 15 ml polipropilen tüp içinde neurospheres toplayın ve 5 dakika boyunca 300 xg'de aşağı doğru döndürün.
4. 10 ml sodyum fosfat süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet atın tamponlu salin (154 mM NaCl, 10 mM fosfat tamponu nPBS). Kpbs den nPBS çözüm kullanım değişikliği unutmayın.
5. 5 dakika boyunca 300 xg'de Spin.
6. NPBS 5-10 ml% 20 sukroz (w / v) solüsyonu içinde süspanse edin.
7. 4 ° C'de en az 24 saat süreyle kültürler cryoprotect neurospheres tutun.
8. Optimal Kesme Sıcaklık (OCT) Bileşik bir tek cryomold doldurun.
9. Neurospheres içeren bir çanak içine sakaroz çözeltisini yavaşça dökün.
10. Temsilci ile çeşitli boyutlarda küreler mekanik bozulma en az kanıt bulmak için bir stereomikroskopta kullanın. Ilk kez bu işlemi yaparken, bazı kültürlerde kırık veya yırtılmış olabilir. Morfoloji güzel uygulama ile muhafaza edilecektir.
11. 1 ml pipet (asgari kaldırıldı sakaroz içeren çözüm hacmi tutmak) içine yavaşça her neurosphere aspirat ve OCT bileşik içine yerleştirin. Daha sonra küreler bulabilmeniz için kalıp üzerinde yaklaşık konumunuzu işaretleyin.
12. Bir kez cryomold birkaç küreler içine yerleştirilen, CO ₂ Ekim beyaz kadar kullanarak örnekleri flaş dondurma.
13. Küp, küre yerini Mark ve küp kalıp dışarı pop
14. Önceden soğutulmuş forseps kullanarak, daha önce, OCT ile bir mandren güvenli bir parça filtre kağıdı üzerine küp yer.
15. Ekim bileşik küpün etrafında daha fazla koyun ve CO ₂ kullanılarak küreler içeren blok bağlı dondurmak. Alternatif Kriyostat mandren (filtre kağıdı ile), filtre kağıdı üzerine fışkırtma Ekim bileşik ve Ekim doğrudan yer küp yer. OCT beyaz ve sert olana kadar bekleyin. Leica CM1900 Kriyostat bu protokol kullanılır.
16. OCT bileşik beyaz olduktan sonra, sıcaklık dengelenmesi için en az 30 dakika bekleyin, sonra kesme blok üzerine mandreni koyabilir.
17. Seri 10 mm bölüm işaretleri için dışarı bakarak ve neurosphere bölümler için mikroskop altında genellikle kontrol kesin. Bir slayt üzerine gibi birçok bölüm olarak yerleştirin. Sizin neurosphere ilk birkaç dilim kapsamında, hücreleri görene kadar, bu nedenle tüm bölümleri toplamak ve bu başlamadan önce ve kürenin sonunda 3-5 bölümleri tutmak mümkün olmayabilir. Bu ön ve arka bölümleri de immünsitokimya işlemden geçecektir. Bu nedenle immün yapan bir nükleer counterstain anahtar standart ters faz mikroskobunda kolayca belirgin değildir neurosphere kutuplarda tek hücreleri algılamak için izin verecek gibi.
18. -20 ° C'de saklayın bölümleri

3. İmmünositokimya

1. -20 ° C ve çözülme, tüm bölümler üzerinde nPBS hafifçe uygulayarak ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe slaytları çıkarın.
2. Aşırı nPBS Flick ve Ab tampon seyreltilmiş birincil antikor (% 0.3 nPBS albümin Triton X-100,% 0.3 sığır serumu, pH 7.2) hemen uygulayın. ~ Slayt başına 100 mcL gerekecektir. Bu protokol, 3D neurosphere kültüründe mevcut ayrık NPC yavrularında Cx29 yerelleştirilmesine.
3. Parafilm ile kaplayın bölümleri kapsayacak şekilde ama parafilm slayt genişliği ulaşır veya aşarsa antikor slayt osmoz tarafından çekilir olacak gibi mikroskop lamı boyutunu aşmayacak şekilde kesti. Parafilm buharlaşmasını önler. Nemli bir odasında 4 ° C'de bir gece inkübe edin. Bölümleri üzerinde parafilm float özen ve slayt uygun izin vermez. Ancak, kaldırmak ya da bakım bölümleri üzerinde herhangi bir kesme kuvveti uygulamak ve böylece morfolojisi bozmaya alınmalıdır olarak bir kez uygulanır parafilm yerleştirme değiştirmez.
4. ~ 1 ml nPBS bölümlerine doğrudan ekleyin ve parafilm kapalı yüzer. Alternatif olarak, parafilm uzakta yüzen kadar, bir coplin kavanoza dikey slayt doğrudan yerleştirin. Kırılgan neurosphere yapısını bozabilir olarak manipülasyon bağımsız uzakta yüzen kadar parafilm çıkarmayın. Parafilm slayt sonra, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. NPBS kapalı Flick ve 5 dakika boyunca RT 3 daha yıkar devam.
5. 1 RT Ab tampon ve inkübe seyreltilmiş ikincil antikor uygulayınyukarıda açıklandığı gibi nemli odasında saat. Tekrar ~ 100 mcL / slayt gerekecektir.
6. 4. adımı nPBS yıkar yineleyin. 5 dakika süreyle ^3. yıkama (Hoechst 33.258 0.5 mg / nPBS mL) bir nükleer counterstain uygulayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca son yıkama ile devam edin .
7. Oje ilk köşelerinde lamel güvenliği, tercih edilen anti-solmaya montaj medya ve kapak Dağı sonra tüm kenarlarında (gliserol tabanlı medya kullanıyorsanız) kaybını önlemek için.
8. Epifluorescent veya konfokal mikroskop kullanarak resim koleksiyonu geçin. Bu protokol, bir Leica DMRA2, Hamamatsu Orca ER kamera ve openlabın v3.56 yazılımı kullanın. Bu örnekte, görüntülerin üç kanal yakalanır: (1) Faz-kontrast, (3) Mavi UV (Leica A4 küp: Filtre kombinasyonları Ex 360/40, Di 400, Sp BP470/40) ve Red (Leica Y3 küp. : Filtre kombinasyonları Ex BP535/50, Di 565, Sp 610/75). Hoechst 33.258 etiketleme, tek hücre faz algılama zordur DNA kullanarak kutupları takip ederek ilk ve son bölümleri yakından ilgilenerek her seri bölümünde vur.

4. Hizalama

1. Cryosections çözülme mikroskop çizgileri üzerine monte edildiğinde, hareket ve çok hafif dönecektir. Bu sapmaların düzeltilmesi gerekir. Ayrıca, her seri bölümünde görüntülü, her görüntünün merkezi ekranda aynı yerde olmayabilir. Sonuç olarak, her sayısallaştırılmış seri bölümü dikkatle doğru morfolojisi korumak için önceki bölümde realigned olmalıdır. Bu uyum, hücre mimarisini ve topografik detay dikkatli ve hassas bir dikkat gerektirir.
2. 10 mikron ve 50 mikron (openlabın v3.56 yazılım kuruldu), her kanal ve yerleşik ölçekli barlar Seri görüntüleri tek tek TIFF dosyaları olarak kaydedilir ve 3300 x 2550 piksel standart bir tuval boyutu ve çözünürlüğü 72 ile Photoshop CS4 ithal piksel / inç. Doğru bir skala korumak için bu ithalat tuval boyutuna dikkat alınmalıdır. Tuval boyutunu ve çözünürlüğü Maya sonraki modelleme için anahtardır. Photoshop ayrı bir katman olarak kaydedilir ölçek çubuğu, XY boyutları hiçbir değişiklik Photoshop uyum sırasında oluşur doğrulamak için kullanılmalıdır.
3. Daha sonra, aynı bölümde (yani, her bölüm için her aşamasında, UV ve Cy3 görüntü serisi link) karşılık gelen üç (veya daha fazla) katmanları arasında bağlantı. Bu bir katman hizalanmış, o bölüm ile ilgili diğer katmanları da, aynı zamanda uyumlu olduğunu garanti eder. Alternatif olarak, uygun pozisyonlar (aşağıya bakın) bir faz katmanı kilitleyin ve sonra faz katmanı bu bölümün ilgili katmanı hizalamak.
4. Başlamak için, katmanlar penceresinde "göz" ikonuna tıklayarak tüm katmanları görünmez olun.
5. Kat penceresinden "göz" simgeleri tıklayarak neurosphere seri bölümlerinin birinci ve ikinci faz kontrastlı görüntüler açın. İkinci bölümde şeffaflık artırın. "Görüntü" sekmesi altında, "imaj döndürme" açık ve "keyfi seçin." Ikinci bölümde görüntüleri arasında geometrik ve yapısal bitişiklik noktaları tespit edebilmek kadar döndürün. UV kanal (Hoechst 33.258 etiketli bölümler) ile ileri ve geri karşılaştırmak için yararlıdır.
6. Tüm bölümleri ve tüm kanalları doğru hizalanır kadar "en yakın komşu" (yani, hemen hemen arka bölümü ile ön bölüm) karşılaştırarak sonraki tüm seri bölümler için tekrarlayın.
7. Photoshop dosyası olarak aynı oranlarda Maya v10 bir düzlem oluşturun.

5. Hücre Tipoloji

1. Durum Satırı Maya kullanıcı arayüzü, Menü Çubuğu, varsayılan Animasyon ayarı Yüzeyler değiştirin.
2. Hücre gövdesi oluşturmak için ilkel bir alt bölümü küresi kullanın.
3. Neurosphere seçildiğinde, nesne üzerinde farenin sağ tuşuna tıklayarak ve İşaretleme Menü Vertex seçerek köşeleri manipüle başlar. Kürenin yüzey işaretleme Menü Görüntü Seviye değiştirerek daha fazla ayrıntılı.
4. Ana menünün Subdivision Yüzeyler sekmesinden Çöküşü Hiyerarşi seçenekleri kutusunu açmak ve 2 düzeyleri sayısını ayarlamak. Kürenin aç.
5. Menü Çubuğu Yüzeyler gelen Çokgenler değiştirin.
6. Küre seçili durumdayken, ana menü Mesh sekmesini Şekillendirici Geometri Aracı'nı açın.
7. Aracı Ayarlar sekmesini Şekillendirici Geometri araç seti istihdam nihai formu hücre yüzeyinde daraltın.
8. NPC'ler ve NPC döl mevcut neurosphere çeşitli simüle etmek için farklı hücre organları oluşturmak için bu işlemi tekrarlayın. Bu gösteri, on farklı hücre organları neurosphere temelini oluşturur.
9. Hücre tipolojisi ve Freeze Dönüşümler seçin.
10. Tipolojisi hücreler kurulmuş, iki yüzey shader ifade hem de hücreleri temsil etmek üzere dizayn edilecektirfaiz protein (bizim örneğimizde Cx29-pozitif hücreler) ve hücrelerin protein yoktur. Burada, herhangi bir hücreyi Cx29 immünoreaktivite Cx29-pozitif olarak belirlenmiştir. Bu örnekte böyle bir analiz shader değişiklikler ile mümkün olmasına rağmen, hücre içi lokalizasyonu örnek değildir.
11. Ana menüsünden Windows> Rendering Editörler sekmesini Hypershade penceresini açın.
12. Ramp Shader yüzey malzemeleri sekmesini seçin.
13. Öznitelik Düzenleyicisi'ni açın ve shader Renk, Enkandesan, Ambient Renk, Bump Map ve Specular Renk nitelikleri ayarlayın.
14. Ortam Renk Bump Mapping düğüm düğüm ve 2D Fraktal doku Brown 3D Doku atayın.
15. Çıkan shader Giriş ve Çıkış Bağlantıları seçin ve seçili şebeke ihracat.
16. Hücre tipolojisi seçin ve İhracat Seçim seçenekleri kutusunu açmak.
17. Dosya türünü seçin mayaAscii ve işaretini kaldırın bu girdilerin kutusu ekleyin. İhracat Seçimi.

6. Hücre Haritalama

1. Photoshop CS4 hizalanmış seri bölümleri dosyayı açın.
2. Kalem vuruşları seri bölümlerde her progenitör hücre konumları işaretlemek için bir anahtar oluşturulması. Bu gösteri, önemli bir üç vuruş - - kesik bir çizgi ile sağlam bir kare, bir kare ve bir çapraz bir kare bir hücre, bir, iki, ya da üç bölüm yer olup olmadığını belirtmek için kullanılır. Bu tuş vuruşları daha fazla renk ile tanımlanır, bu örnekte, kırmızı, faiz, Cx29 bizim protein ifade hücreleri temsil eder ve beyaz Cx29 ifade hücreleri temsil eder.
3. Faz katman açın ve beyaz Kalem inme her progenitör hücre merkezinde işaretleme başlamak. Haritalarını oluşturmak için hangi bölüm klasörü içinde ayrı bir katman kullanın.
4. Birden fazla bölümünde hücrelerin düzgün bir şekilde belirtilir emin hücreleri konumunu bulmak için bölümler arasında geçiş yapma.
5. Cx29 katmanı açıkken, Cx29 olumlu ifade bölgelerde sonbahar hücreleri seçin.
6. Photoshop'un ana menü çubuğunda Düzen sekmesinden Doldur komutunu seçin ve kırmızı beyaz konturları değiştirmek.
7. Haritalar ile her bölüm Maya proje sourceimages klasöründe ayrı bir jpeg resim olarak kaydedin. Bunu yapmak için, yeni bir Maya proje ilk kez oluşturulan gerekecektir.

7. 3D Haritalar İthalat ve Montaj

1. Durum Satırı Maya kullanıcı arayüzü, Menü Çubuğu, varsayılan Animasyon ayarı Çokgenler değiştirin.
2. Projeler sahneleri klasöründen planes.mb ve scaleBar.mb dosyaları içe aktarın.
3. Düzlem seçildiğinde, bir nesne üzerinde farenin sağ tuşuna tıklayarak ve Ata Yeni Malzeme sekme açma Lambert shader atayın.
4. Öznitelik Düzenleyicisi malzeme Renk özniteliği sağ damalı kutusunu tıklatın.
5. Pop-up menü, 2D Textures bölümünden Dosyası'nı seçin.
6. Öznitelik Düzenleyicisi Dosya Öznitelikleri bölümünde altında, Resim Adı özniteliği sağ dosya simgesini tıklayın.
7. İlk bölümde sourceimages klasörü seçin.
8. Paneller sekmesini açarak Perspektif görünümünde varsayılan ortografik Üstten görünüm Workspace pencerenin kamera açın.
9. Ana menünün Mesh sekmesinden Poligon Aracı Oluşturma seçin ve bölümün anahat iz.
10. Ilk harita sourceimages klasörü seçin ve çokgenin düzlemi oluşturmak için kurulmuş olan adımları izleyerek, yeni oluşturulan poligon düzlem atamak.
11. Nesne seçiliyken, düzlem üzerinde farenin sağ tuşuna tıklayarak İşaretleme Menü UV seçin.
12. Bütün uçakların UV noktaları seçin ve ana menüsünden Windows sekmesinden UV Texture Editor açın.
13. Düzlemini uygun orantılı UV Ölçeği.
14. Her bölüm arasındaki boşluk, ölçek çubuğu yüksekliğine karşılık emin neurosphere her bölüm için bu işlemi tekrarlayın.

8. 3D Progenitör Hücre Tipolojileri Konumlandırılması

1. Durum Satırı Maya kullanıcı arayüzü, Menü Çubuğu varsayılan Animasyon Dynamics ayarı değiştirin.
2. Neurosphere görünür yalnızca ilk bölümünü bırakıp, ana menünün Görüntü sekmesinden ekran ayarlarını değiştirerek diğer tüm bölümleri gizleyebilirsiniz.
3. CV Curve Aracı seçenekleri kutusu açıkken, 1'i seçin CV Curve Ayarlar Doğrusal.
4. Top görüş kamerası, sahne görüntüleme Cx29 negatif hücreler için eğrisi ve Cx29-pozitif hücreler için hücre haritalarına atama başlar.
5. Ortaya çıkan eğriler Yan görüş kamerası bakıldığında düzdür. Bir kılavuz olarak mikroskobu görüntüleri ithal ölçek çubuğunu kullanarak eğrinin y ekseninde noktaları değişen bölümlerin kalınlığı oluşturulması.
6. Neurosphere her bölüm için bu işlemi tekrarlayın.
7. Projenin sahneleri klasörü cellTyoplogy.ma dosya İthalat ve neurosphere içinde Cx29-negatif ve Cx29-pozitif hücreler için hücre tipoloji çoğaltmak.
8. Ana menüsünden Windows> Rendering Editörler sekmesini Hypershade penceresini açın.
9. İthalat tipoloji hücreleri atanarak önceden inşa shader.
10. Outliner Pencere, ithal edilen nesnelerin başından itibaren dosya adını çıkarın. Bu modelleme sürecinin ilerleyen aşamalarında önemli hale gelecektir.
11. Parçacıklar sekmesini seçin ve ana menüden İlk CV Curve için bir parçacık emitör oluşturmak.
12. ParticleShape1 sekmesini açın ve Emisyon Öznitelikler altında -1 'den ilk eğri üzerinde puan sayısı Max Sayısı değiştirmek.
13. Oluştur sekmesi phpBB Yüzey (s / w) Parçacık oluşturulma Tipi Öznitelikleri. Aşağıdaki Şu Render Türü kutusunda tıklayın ve parçacıklar 0.010 Radius değiştirmek.
14. Parçacıklar, ilk eğri seçtikten sonra vardiya parçacıklar seçerek eğri vertices takın. Ana menünün Parçacıklar sekmesi içinde Hedef seçeneklerini açın ve 1 Hedef Ağırlık ayarlayabilirsiniz. Oluştur'u tıklatın.
15. Outliner Pencere için 1 numara ile 10 hücreleri seçin ve Parçacıklar sekmesinden ana menü seçenekleri kutusunda Instancer (Yedek) açın. Örnek Nesneler kutusunda, tüm on hücreleri sırasına göre listelenmiş olmalıdır.
16. Derece sekmesine Parçacık Nesne listesi açılan doğru particleShape adı seçin. Oluştur'u tıklatın.
17. Varsayılan olarak, sadece ilk hücre seçildi eğrisi boyunca parçacıkların yerini alacak. On tür parçacıklar arasında rastgele olarak ortaya çıkmakta ve döngü elde etmek için, bir ifade gereklidir. İkinci ifade, hücreler aynı şekilde rastgele Range Slider repositioned her zaman yayarlar sağlayacaktır.
18. Yayıcı seçildiğinde, Öznitelik Düzenleyicisi açın. ParticleShape sekmesinde, Ekle Dinamik Nitelik altında Genel kutusunu tıklatın. Uzun Adı altında random_index yazın. Skaler başına partikül (dizi) ve vurmak için Öznitelik Türü anahtarı ekleyin.
19. Başına Parçacık (Array) sekmesini Nitelikleri, random_index kutusu eklenmiştir. Boş alan üzerinde sağ fare tuşuna tıklayarak, İfade Oluştur'u seçin ... Açılan kutudan.
20. İfade metni yazın: kutusu - particleShape1.random_index = rand (10) if (particleShape1.particleId == 1) tohumu (1);
21. Ifade Öznitelik Düzenleyicisi ve aşağı açılan liste Genel Seçenekler> Nesne İndeksi seçin random_index Instancer (Geometri Yedek) sekmesini açın tamamlamak için. Ilk karesi için zaman kaydırıcıyı getirin ve oynattı, hücre tipleri parçacıklar arasında rastgele dağıtılır.
22. Neurosphere her bölüm için bu işlemi tekrarlayın. Her yeni yayıcı, instancer ve rastgele dizin adı farklılaşmış ve Outliner Pencere uygun olarak düzenlenen olduğundan emin olun.

9 - Görüntüleştirim / Compositing

1. Render Render Ayarları penceresi bölümünü kullanarak, Maya Software, mental ray render değiştirin.
2. Kalite sekmesini açın ve sıfır ayarı Yansımalar Işınizleme altında değiştirebilirsiniz. Framebuffer sekmesini açın ve Alpha işaretini kaldırın ve Ham Premultiply Colorclip değiştirmek.
3. Kanal Kutusu / Katman Düzenleyicisi'ni açın ve oluşturulma için kullanılan ekran Katman Editör ayarını değiştirin.
4. Tipoloji ithal hücreleri seçin ve yeni bir katman oluşturun ve atayın seçilen nesnelerin simgesini tıklayın.
5. Katman ambient tıkanıklığı yeniden adlandırın.
6. Yeni oluşturulan katman üzerinde sağ fare tuşuna tıklayarak menüden öznitelikleri seçin.
7. RenderLayer kutusunun sağında, Presets düğmesine tıklayın ve açılan listeden Tıkanıklığı seçin.
8. Mib_amb_occlusion1 sekmesini seçin ve 16 ila 256 Örnekleri değiştirmek.
9. Kanal Kutusu / Katman Editor yeniden açın ve Seçenekler sekmesi altında, Tüm Katmanlar seçenekleri kutusunda oluşturulma açık.
10. Kompozit seçin ve katmanları tutmak.
11. Seçilen ambientOcclusion tabakası ile, sadece katman listesinin üstündeki açılan kutusunda çarpın Normal olarak değiştirin.
12. MasterLayer açık bir kez açık ve ambientOcclusion tabakası ile bir kez, iki geçiş neurosphere işleyin. Projeler images klasörünü iff dosyaları olarak kaydedin.
13. Photoshop CS4 hem de görüntüleri açın. AmbientOcclusion tabakası masterLayer üstüne yerleştirin ve Multiply olarak ayarlayın. Bir arka plan oluşturun ve görüntü düzleştirmek.

Discussion

Bu protokol, kültür ve seri cryosection post-natal hipokampal NPC'ler, bir yordam açıklanır İmmuno protein ekspresyonu yerelleştirmeniz ve nihayet tüm 3D neurosphere içinde immünopozitif hücreleri topografik konumu yeniden ve analiz. Hücre biyolojisi kültürü ve işleme teknikleri, mikroskopi görüntüleme (openlabın, Doğaçlama ve diğer görüntü analiz yazılımları) birleştirerek, grafik düzenleme yazılımı kapasiteleri (Adobe Photoshop), 3D animasyon ve kompozisyon yazılım kapasiteleri (Autodesk Maya), biz yeniden bir metodoloji mevcut sadık bir neurosphere kültür boyunca hücresel konum ve protein ifade yeniden inşası için izin seri 2D görüntüleri 3D kültürlerin tüm hücresel bileşimi. Bu protokol, kayıt ve kalın seri bölümleri ile epifluorescent ince seri bölümleri veya konfokal Z-yığınlarının rekonstrüksiyonu eşit etkinliği ile kombine edilebilir. Çünkü doğum sonrası beyindeki nöron ve gliogenesis boyunca gözlenen birçok aşamadan neurosphere kültür özetlediği tek NPC'ler klonal genişleme, 3D yapısının etkisi aynı deneysel ortam ¹ ​​maruz döl önemli bir NPC kaderini belirleyici temsil eder. Seri neurosphere bölümleri, merkez ve çevre soy ve protein ekspresyonu Farklılıklar NPC biyoloji ² düzenleyen hücre konumu, mekanik stres ve kesme kuvveti de dahil olmak üzere birden çok fiziksel faktörler önemli rol oynamaktadır. Ayrıca, Konneksin protein ekspresyonu, burada analiz NPC'ler 3D süspansiyon neurospheres veya hücreleri, plastik ve yüzey veya 3D ücretsiz kültür olup olmadığını değişmiş fonksiyonel Konneksin aracılı iletişim laminin substrat kaplama olarak kültüre bağlı olarak değişiklik gösterilmiştir kayan kültürler ^3. NPC kaderi hücresel pozisyon etkisi belirsizliğini korumaktadır. Bu teknik, soy ve sinyalizasyon proteinler antijenik değerlendirme 3D mimarisi bozulması hücre permeabilization ve tüm hücrelerin antikor erişimi sağlamak için ihtiyaç duyduğu verilen NPC biyoloji 3D kültür içinde mekansal konumu etkisini analiz etmek zordur. Burada, biz melez bir görselleştirme metodoloji bazı proteinler, benzersiz 3D kültür pozisyonel lokalizasyonu sergi olup olmadığını belirleyen bir vasıta olduğunu, belki de en önemlisi, bölgesel lokalizasyon açısından neurosphere içinde protein fonksiyonu ve düzenleme anlaması ve test etmek için kullanılır, ve olabilir 3D topografya ve hücresel konumlandırma 3D kültür NPC kaderi üzerindeki etkilerini incelemek için gerekli olan konumsal veri sağlar.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Euthansol	Reagent	Merck & Co.
Krazy Glue	Reagent	Home Hardware
VT1000S vibratome	Equipment	Leica Microsystems
Neural protease	Reagent	Sigma-Aldrich	P6141	Stock solutions stored at -20°C
Papain	Reagent	Sigma-Aldrich	P4762	Stock solutions stored at -20°C
DNAse I	Reagent	Roche Group	11 284 932 001	Stock solutions stored at -20°C
MZ6 Dissecting Microscope	Equipment	Leica Microsystems
ProBlot 6 Hybridization Oven	Equipment	Labnet International
Centrifuge 5702	Equipment	Eppendorf
kPBS	Reagent	BioShop Canada	PBS404
B27 Supplement	Reagent	Invitrogen	17504-044
Ultra Low Binding Tissue Culture Dishes	Disposable	Corning	3261
Human Epidermal growth Factor	Reagent	Invitrogen	13247-051	Stock solutions stored at -20°C
Fibroblast growth factor-2	Reagent	Invitrogen	13256-029	Also known as basic fibroblast growth factor (bFGF) Stock solutions stored at -20°C
37% formaldehyde (molecular grade)	Reagent	Sigma-Aldrich	F8775
Belly Dancer Shaker	Equipment	Stovall Life Sciences, IBI Sciences
Tissue- Tek Cryomold	Disposable	Sakura Finetek	4566
Tissue-Tek OCT compound	Reagent	Sakura Finetek	4583
Whatman Grade 703 Blotting Paper	Disposable	VWR international	28298-020
CM1900 Cryostat	Equipment	Leica Microsystems
Polyclonal Anti-Cx29 Primary Antibody	Reagent	Kindly provided by Dr David Paul, Harvard Medical School		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
Cy3-conjugated donkey anti-rabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
H–chst 33258	Reagent	Sigma-Aldrich	861405
DMRA2 epiflourescent microscope, Orca ER camera, OpenLab v3.56	Equipment/ Software	Leica Microsystems		This protocol can be performed with any epifluorescent or confocal microscope.
Photoshop CS4	Software	Adobe		Graphic software
Maya v10	Software	Autodesk		Modeling software
Computer	Equipment	Intel		Processor: Intel Corei7 920, Memory:12GB DDR3 Video card: Nvidia GTX 285 (1GB RAM)
* All other standard chemical reagents listed in the protocol are from Sigma-Aldrich. All other standard tissue culture reagents are from Invitrogen.