Het lokaliseren van Eiwit in 3D Neural Stem Cell Culture: een hybride Visualisatie Methodologie

Summary

Hier beschrijven we hoe te produceren, uit te breiden, en immunolabel postnatale hippocampus neurale progenitor cellen (NPC's) in drie-dimensionale (3D) cultuur. Vervolgens met behulp van hybride visualisatie technieken, laten we zien hoe digitale beelden van immunolabelled vriescoupes kunnen worden gebruikt om te reconstrueren en in kaart van de ruimtelijke positie van immunopositive cellen in het gehele 3D-neurosphere.

Abstract

Het belang van 3-dimensionale (3D) topografie in het beïnvloeden van neurale stamcellen en voorlopercellen cel (NPC) fenotype is algemeen bekend toch uitdagend om te studeren. Bij het los van embryonale of postnatale brein, zal enkele NPC's verspreiden in suspensie te neurospheres te vormen. Dochter cellen binnen deze culturen spontaan vast te stellen verschillende ontwikkelings lineages (neuronen, oligodendrocyten en astrocyten) in de loop van de uitbreiding ondanks het feit dat bloot aan dezelfde extracellulaire milieu. Deze progressie recapituleert veel van de podia die gedurende de loop van de neurogenese en gliogenesis in post-natale hersenen en wordt vaak gebruikt om elementaire NPC biologie studeren binnen een gecontroleerde omgeving. Het beoordelen van de volledige impact van 3D topografie en cellulaire positionering binnen deze culturen op NPC lot is echter moeilijk. Te lokaliseren doelwit eiwitten en NPC lijnen door middel van immunocytochemie te identificeren, moet vrij zwevende neurospheres worden uitgeplaat op een substraat of serie coupes. Deze verwerking is nodig om gelijkwaardige cel permeabilisatie en antistoffen in het hele gebied te garanderen. Als gevolg hiervan kan 2D epifluorescerende beelden van vriescoupes of confocale reconstructies van 3D Z-stacks alleen ruimtelijke informatie over de cel positie in discrete fysieke of digitale 3D-plakken en niet te visualiseren cellulaire positie in het intacte sfeer. Hier, aan de topografie van het neurosphere cultuur herhalen en laten ruimtelijke analyse van proteïne-expressie in de hele cultuur, presenteren we een protocol voor isolatie, uitbreiding, en seriële snijden van post-natale hippocampus neurospheres geschikt voor epifluorescerende of confocale immunodetectie van target eiwitten. Connexin29 (Cx29) is geanalyseerd als een voorbeeld. Vervolgens met een hybride van grafische bewerking en 3D-modeling software streng toegepast op biologisch detail te behouden, beschrijven we hoe de 3D-structurele positionering van deze beelden opnieuw te monteren en digitaal kaart gelabelde cellen binnen de gehele neurosphere. Deze methodologie maakt visualisatie en analyse van de cellulaire positie van target eiwitten en cellen in het gehele 3D-cultuur topografie en vergemakkelijkt een meer gedetailleerde analyse van de ruimtelijke relaties tussen de cellen in de loop van neurogenese en gliogenesis in vitro.

Zowel Imbeault en Valenzuela droegen gelijk en moeten worden beschouwd joint eerste auteurs.

Protocol

1. Isolatie van Neurale Cellen Progenitor

Houd de weefsels en oplossingen koud te allen tijde tijdens de isolatie-protocol!

1. Voorafgaand aan het starten van uw culturen, de voorbereiding van de volgende voorraad oplossingen:
   • Dissociatie media (26 mM NaHCO _3, 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,1 mM CaCl ₂ * 2H ₂ O, 3,2 mM _MgCl2 * 6H ₂ O, 10 mM D-glucose, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml . streptomycine Steriel filter en op te slaan in 10-15 ml porties bij -20 ° C. Maak voorraad concentraties van enzymen die worden gebruikt voor cellulaire dissociatie in dubbel gedistilleerd H ₂ O, steriel filteren en op te slaan fracties bij -20 ° C: Neural protease (25 mg . / ml), papaïne (10 mg / ml), DNAseI (10 mg / ml) Op de dag van het experiment, toe te voegen enzymen om 15 ml van dissociatie Media op de volgende uiteindelijke concentraties: 1 mg / ml protease, 0,1 mg / mL papaïne, 0,1 mg / ml DNAse I. Dissection oplossing die uiteindelijke enzympreparaat concentraties kunnen worden bewaard op ijs tijdens de dissectie proces.
   • Onderhoud Media: Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium F12 (DMEM/F12), 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 1x B27 te vullen. Kan worden gehouden voor maximaal 3 maanden bij 4 ° C zonder B27 aanvullen en tot een maand bij 4 ° C met B27 te vullen.
   • Groeifactoren: Bereid voorraad aliquots van 0,1 ng / ml humaan recombinant epidermale groeifactor (hEGF) en 10 ug / ml fibroblast groeifactor-2 (FGF-2) in DMEM/F12 + 0,1% bovine serum albumine (BSA). Bewaren bij -20 ° C.
2. Om dodelijk C57BL / 6 muis pups verdoven, zijn muizen intraperitoneaal geïnjecteerd met Euthansol op de postnatale dag 0-3.
3. Verwijder voorzichtig hersenen door standaard dissectie en op te slaan in een 60 mm schotel met kunstmatige hersenvocht (ACSF: 26 mm NaHCO _3, 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl ₂ * 2H ₂ O, 1,3 mM _MgCl2 * 6H ₂ O , 10 mM D-glucose, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine). pH op 7,3, indien nodig en steriele filter in 50 ml porties, bewaren bij -20 ° C.
4. Met behulp van een scheermesje, blokkeren de hersenen door het verwijderen van de kleine hersenen en lijm hersenen met Krazy Glue, rostraal kant naar boven, dorsale zijde naar u toe, op de vibratome boorkop. Een Leica Microsystems VT1000S vibratome wordt gebruikt in dit protocol.
5. Plaats chuck in de vibratome en voeg ACSF en ijs in de juiste vakken.
6. Snijd plakken van 500 micrometer dikte met een snelheid tussen 3,5-4,5 en de frequentie van 8,5.
7. Verzamel plakjes met de hippocampus formatie in gerechten met ACSF.
8. Met behulp van een stereomicroscoop, verwijder hippocampus tussen bregma -1,60 mm en -2,40 mm (tot aan de CA3 regio gaat curve ventraal) en doe dit in een nieuwe droge schaal (zonder ACSF). Een Leica MZ6 dissectiemicroscoop wordt gebruikt in dit protocol.
9. Zodra alle hippocampus worden verzameld, gehakt weefsel met een scalpel (tot een homogeen en vloeibaar verschijning is bereikt).
10. Overdracht gehakt in weefsel tot een 15 ml polypropyleen buisje met 2,5 ml Dissociatie media met neurale protease, papaïne, en DNAse I (zie stap 1 voor oplossing voorbereiding). Let op als er een heleboel van de bron weefsel (bijvoorbeeld van 6 pups) is het een goed idee om 2 flesjes van 2,5 ml dissociatie media te gebruiken om een ​​optimale enzym te behouden: weefsel verhouding. Incubeer bij 37 ° C gedurende 45-60 min. met rotatie. Een LabNet ProBlot 6 hybridisatie oven (gekocht via Mandel Scientific) wordt gebruikt in dit protocol ingesteld op rotatie-instelling 4.
11. Voeg 10 ml steriel weefselkweek kaliumfosfaat zoutoplossing (KPBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM fosfaatbuffer, pH 7,4) en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Een Eppendorf centrifuge (model 5702) wordt in dit protocol.
12. Gooi supernatant en resuspendeer pellet in 5 ml KPBS.
13. Distantiëren weefsel door trituratie door middel van een Pasteur pipet.
14. Centrifugeer celsuspensie op 300 xg gedurende 5 minuten.
15. Resuspendeer cellen in 3 ml Onderhoud medium, tellen cellen met behulp van trypan Blue en de plaat cellen in 60 mm niet-klevende gerechten (Corning Ultra-Low therapietrouw binding gerechten worden gebruikt in dit protocol, zie ook Materiaal) met een dichtheid van 2,5 x 10 ⁵ cellen / schotel in 5 ml van onderhoud medium. Petrischalen kan worden gebruikt in plaats van de Ultra-Low naleving van gerechten, maar culturen eerst moet worden aangeboord in de ochtend en 's middags elke dag uitbreiding voor de eerste 6 dagen in vitro (DIV) naar plating en spontane differentiatie te voorkomen.
16. Voeg hEGF tot een uiteindelijke concentratie van 20 ng / ml en FGF-2 tot een uiteindelijke concentratie van 10 ng / ml direct na het plating. Voeg extra groeifactoren om de twee dagen tijdens de expansie fase tot collectie dagen op DIV 14. (Schaal bars in video van het uitbreiden van neurospheres vertegenwoordigen 100 urn.)

** Opmerking: de media kunnen worden geel rond DIV 10 van de expansiefase. Als dit gebeurt, nog een 1 mL Maintenance media. Als het afdrukmateriaal opnieuw geel de volgende dag, nog een 1 ml Onderhoud media - blijven doen als nodig is tijdens je expansiefase - vergeet niet om het volume van groeifactoren dienovereenkomstig aan te passen om de juiste eindconcentraties te houden.

2. Serial Cryosectioning

1. Tik op neurospheres voorzichtig voorafgaand aan de fixatie om ervoor te zorgen bollen zijn goed gescheiden op het moment van fixatie.
2. Voeg moleculair-biologische kwaliteit formaldehyde rechtstreeks naar de culturen tot een uiteindelijke concentratie van 3,7% en incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 20 min met langzame schudden. Een Stovall Belly Dancer is gebruikt in dit protocol ingesteld op een rotatiesnelheid van 2,5.
3. Verzamel neurospheres in een 15 ml polypropyleen buizen en de spin neer op 300 xg gedurende 5 minuten.
4. Gooi supernatant en resuspendeer pellet in 10 ml natrium-fosfaat-gebufferde zoutoplossing (nPBS: 154 mM NaCl, 10 mM fosfaatbuffer). Let op de verandering in de oplossing het gebruik van KPBS naar nPBS.
5. Spin neer op 300 xg gedurende 5 minuten.
6. Resuspendeer 5-10 ml 20% sucrose (w / v) oplossing in nPBS.
7. Houden neurospheres bij 4 ° C gedurende ten minste 24 uur om culturen cryoprotect.
8. Vul een wegwerp cryomold met Optimal Cutting Temperatuur (LGO) Compound.
9. Voorzichtig giet de sucrose oplossing die neurospheres in een schaal.
10. Gebruik een stereomicroscoop representatief sferen van verschillende afmetingen vinden met het minste bewijs van mechanische verstoring. Bij het uitvoeren van deze procedure voor de eerste keer, kunnen sommige culturen worden gebroken of gescheurd. Morfologie zal netjes worden onderhouden met de praktijk.
11. Zuig voorzichtig elke neurosphere op in een 1 ml pipet tip (houd het volume van de sucrose-oplossing met daarin verwijderd om een ​​minimum) en plaats deze in de LGO verbinding. Markeer uw geschatte locatie op de mal, zodat je later kunt u de bollen.
12. Als je eenmaal een paar bollen geplaatst in de cryomold, flash-bevriezing van de monsters met behulp van CO ₂ tot oktober is wit.
13. Markeer de locatie van uw bollen op de kubus en de pop de kubus uit de mal
14. Met behulp van pre-gekoelde pincet, plaatst u de kubus op een stuk filtreerpapier eerder bevestigd aan een klauwplaat met oktober
15. Plaats meer LGO stof rond de kubus en de bevriezing om het blok met de bollen met behulp van CO ₂ houden. Alternatief plaats de boorkop (met filter papier) in de cryostaat, spuiten oktober compound op filtreerpapier en plaats kubus direct in oktober Wacht tot oktober is wit en hard. Een Leica CM1900 cryostaat wordt gebruikt in dit protocol.
16. Zodra de LGO compound wit wordt, kunt u de boorkop plaatsen op het snijden blok, wacht dan minstens 30 minuten voor de temperatuur van het evenwicht.
17. Snijd seriële 10 micrometer secties op zoek naar uw merken en te controleren vaak onder een microscoop voor neurosphere secties. Plaats zoveel secties als je kunt op een dia. Merk op dat u niet in staat om de eerste paar plakjes uw neurosphere onder de werkingssfeer, zodat verzamel alle onderdelen totdat je cellen en de 3-5 secties voor dit begin en het einde van je bol te houden zien. Deze voorste en achterste delen zullen ook worden verwerkt voor immunocytochemie. Een nucleaire tegenkleuring bij het uitvoeren van immunokleuring is daarom cruciaal omdat het u zal toestaan ​​om enkele cellen bij de neurosphere polen niet meteen duidelijk onder standaard omgekeerde fase microscopie op te sporen.
18. Bewaar secties bij -20 ° C.

3. Immunocytochemie

1. Verwijder de dia's van -20 ° C en ontdooien door het toepassen van nPBS zachtjes over alle afdelingen en incuberen bij RT gedurende 5 minuten.
2. Flick overtollige nPBS en onmiddellijk van toepassing zijn primair antilichaam verdund in Ab-buffer (0,3% Triton X-100, 0,3% bovine serum albumine in nPBS, pH 7,2). U moet ~ 100 ul per slide. In dit protocol, we lokaliseren Cx29 in discrete NPC nakomelingen aanwezig zijn in 3D neurosphere cultuur.
3. Bedek met parafilm gesneden om de delen te dekken, maar niet om de grootte van de microscoop slide dan als antilichaam zal worden opgesteld van de dia door osmose, indien de parafilm bereikt of overschrijdt de breedte van de dia. De Parafilm voorkomt verdamping. Incubeer overnacht bij 4 ° C in een vochtige kamer. Zorg ervoor dat de parafilm zweven over de secties en niet toelaten om zich te houden aan de dia. Echter, niet verwijderen of te wijzigen parafilm plaatsing eenmaal toegepast als zorg moet worden genomen dat er geen dwarskracht op de onderdelen toe te passen en daardoor verstoren morfologie.
4. Direct toe te voegen ~ 1 mL nPBS naar secties en vlotter uit de parafilm. Als alternatief, plaats de dia verticaal direct in een Coplin pot totdat de parafilm drijft weg. Verwijder de parafilm totdat hij drijft weg onafhankelijk van manipulatie zoals u wellicht verstoren fragiele neurosphere structuur. Zodra de Parafilm is uit de glijbaan, incubeer 5 min bij RT. Flick uit nPBS en ga verder met 3 meer wasbeurten bij RT gedurende 5 minuten.
5. Van toepassing secundair antilichaam verdund in Ab-buffer en incuberen bij RT voor eenh in een vochtige kamer zoals hierboven beschreven. Je zult weer nodig ~ 100 pi / dia.
6. Herhalen nPBS wast in stap 4. Breng een nucleaire tegenkleuring in de 3 ^e was (Hoechst 33258 0,5 ug / ml in nPBS) gedurende 5 minuten en ga verder met de laatste te wassen voor 5 min bij RT.
7. Monteren in de gewenste anti-fade montage media en dekglaasje, het veiligstellen van de dekglaasje met nagellak eerst in de hoeken dan al rond de randen om verlies te voorkomen (bij gebruik van een glycerol-based media).
8. Ga verder met foto collectie met behulp van een epifluorescerende of een confocale microscoop. In dit protocol maken we gebruik van een Leica DMRA2, een Hamamatsu Orca ER camera, en Openlab v3.56 software. In dit voorbeeld worden de beelden vastgelegd op drie kanalen: (1) Fase-contrast, (3) Blue UV (Leica A4 cube: Filter combinaties Ex 360/40, Di 400, Sp BP470/40) en rood (Leica Y3 kubus : Filter combinaties Ex BP535/50, Di 565, Sp 610/75). Schiet elke seriële sectie met veel aandacht voor de eerste en de laatste delen door het volgen van de polen met behulp van Hoechst 33258 etikettering van DNA, waar fase detectie van enkele cellen is moeilijk.

4. Alignment

1. Wanneer de vriescoupes zijn dooi gemonteerd op de microscoop lijnen, zullen ze bewegen en draaien heel licht. Deze afwijkingen moeten worden gecorrigeerd. Bovendien, wanneer elke seriële sectie is afgebeeld, kan het midden van elk beeld niet op dezelfde locatie op het scherm. Als gevolg hiervan moet elk gedigitaliseerd seriële gedeelte zorgvuldig worden afgestemd met de vorige paragraaf om nauwkeurige morfologie behouden. Deze aanpassing vereist een zorgvuldige en nauwkeurige aandacht voor cytoarchitecture en topografische details.
2. Seriële beelden van elk kanaal en inwoner schaal bars van 10 um en 50 um (opgericht in Openlab v3.56 software) worden opgeslagen als individuele TIFF-bestanden en geïmporteerd in Photoshop CS4 met behulp van een standaard canvas afmeting van 3300 x 2550 pixels en een resolutie van 72 pixels / inch. Zorgvuldige aandacht voor canvasgrootte moeten worden genomen in deze import een nauwkeurige schaal te houden. Het doek grootte en de resolutie zijn de sleutel tot de volgende modellen in Maya. De schaal bar, opgeslagen als een aparte laag in Photoshop, moeten worden gebruikt om te controleren of er geen verandering in de XY afmetingen optreedt tijdens de uitlijning in Photoshop.
3. Vervolgens verbinden de drie (of meer) lagen die overeenkomt met de dezelfde afdeling (dat wil zeggen, link elke fase, UV, en Cy3 imago series voor elk deel). Dit zorgt ervoor dat wanneer een laag is afgestemd, andere lagen verbonden met dat gedeelte ook aansluiten op hetzelfde moment. U kunt ook een keer blokkeren de fase laag in de juiste positie (zie hieronder) en maak er een nette de bijbehorende lagen van die sectie om de fase laag.
4. Om te beginnen, maken alle lagen onzichtbaar door te klikken op het "oog" icoon in de lagen venster.
5. Draai de eerste en tweede fase-contrast-beelden van de neurosphere seriële secties over door te klikken op het "oog" pictogrammen in de lagen venster. Vergroten van de transparantie van de tweede sectie. Onder de "Image" tab, open "beeldrotatie" en kies "arbitrair." Draai de tweede sectie totdat u in staat zijn om punten van geometrische en structurele nabijheid tussen de beelden te identificeren. Het is nuttig om heen en weer te vergelijken met de UV-kanaal (Hoechst 33258-gelabeld secties).
6. Herhaal dit voor alle volgende seriële secties te vergelijken "buren" (dwz, de directe voorste gedeelte met de onmiddellijke achterste gedeelte) totdat alle secties en alle kanalen worden nauwkeurig uitgelijnd.
7. Maak een vliegtuig in Maya v10, dat is van dezelfde verhoudingen als het Photoshop-bestand.

5. Cel Typologie

1. Van de status Line van user interface van Maya's, wijzigt u de menubalk van het standaard Animation instelling Surfaces.
2. Gebruik een primitieve onderverdeling sfeer naar de cel lichaam te creëren.
3. Met de neurosphere geselecteerd, begint het manipuleren van de hoekpunten door te klikken op de rechter muisknop op het object en het selecteren van Vertex van de Markering Menu. Verder uit te werken het oppervlak van de bol door het veranderen van de Display Niveau van de Markering Menu.
4. Van de Onderverdeling oppervlakken tabblad van het hoofdmenu, open het Collapse Hiërarchie opties box en stel het aantal niveaus tot en met 2. Vouw de bol.
5. Wijzig de menubalk van oppervlakken veelhoeken.
6. Met de bol geselecteerd, opent u het Sculpt Tool Geometrie van de Mesh tabblad van het hoofdmenu.
7. Verfijnen het oppervlak van de cel om zijn definitieve vorm in dienst van de Sculpt Geometrie toolset van de Tool tabblad Instellingen.
8. Herhaal dit proces om de verschillende cellichamen creëren om de verscheidenheid van de NPC's en NPC nakomelingen aanwezig zijn in de neurosphere te simuleren. In deze demonstratie, tien verschillende cellichamen vormen de basis voor de neurosphere.
9. Selecteer de cel typologie en Freeze Transformaties.
10. Met de cellen van uw typologie vastgesteld, zullen twee oppervlak shaders zijn ontworpen om zowel cellen die vertegenwoordigenhet eiwit van belang (in ons voorbeeld Cx29-positieve cellen) en cellen waar het eiwit afwezig is. Hier wordt elke cel met Cx29 immunoreactiviteit aangewezen Cx29-positief. In dit voorbeeld is subcellulaire lokalisatie niet gemodelleerd, hoewel een dergelijke analyse is het mogelijk met modificaties aan de shaders.
11. Open het venster van de Hypershade Windows> Rendering Editors tabblad van het hoofdmenu.
12. Kies een Ramp Shader van de Surface materialen tabblad.
13. Open de Attribute Editor en zet de shaders Kleur, Incandescence, Ambient Kleur, Bump Map, en Specular Color attributen.
14. Wijs een Brownse 3D Texture aan de Ambient Color knoop en een 2D-Fractal textuur aan de Bump Mapping node.
15. Selecteer de daaruit voortvloeiende shaders Input en Output-aansluitingen en export van de geselecteerde netwerk.
16. Selecteer de cel typologie en open de Export Keuzemogelijkheden box.
17. Kies het bestandstype mayaAscii en schakelt u het selectievakje Inclusief deze ingangen box. Export Selection.

6. Cell Mapping

1. Open de lijn seriële secties bestand in Photoshop CS4.
2. Stel een sleutel van Potlood slagen om de locaties van elk progenitor cellen in de serie hoofdstukken te markeren. In deze demonstratie, een sleutel van drie slagen - een solide plein, een plein met een stippellijn, en een vierkant met een kruis - zal worden gebruikt om aan te geven of een cel bevindt zich in een, twee of drie delen. Deze sleutel van slagen wordt verder bepaald door kleur - in dit voorbeeld rood staat voor cellen die ons eiwit van interesse, Cx29, en witte vertegenwoordigt cellen die niet tot expressie Cx29.
3. Schakel de Phase laag op en beginnen met het markeren van de midden van elke progenitor cel met een wit potlood beroerte. Gebruik een aparte laag in de sectie map waarmee je je kaarten op te bouwen.
4. Schakelen tussen secties om de cellen positie ervoor te zorgen dat de cellen op meer dan een sectie goed worden aangeduid vinden.
5. Met de Cx29 laag aan en selecteer de cellen die vallen in de regio's waar Cx29 positief wordt uitgedrukt.
6. Kies de opdracht Vul op het tabblad Bewerken van de belangrijkste menubalk van Photoshop en verander de witte lijnen op rood.
7. Met de kaarten vervuld, tenzij elke sectie als een apart jpeg-afbeelding in de sourceimages map van de Maya-project. Om dit te doen, zal een nieuw project Maya eerst te worden gecreëerd.

7. Het importeren en assembleren kaarten in 3D

1. Van de status Line van user interface van Maya's, wijzigt u de menubalk van het standaard Animation instelling veelhoeken.
2. Importeer de planes.mb en scaleBar.mb bestanden uit de projecten scènes map.
3. Met het vliegtuig geselecteerd, wijst u een Lambert arcering door te klikken op de rechter muisknop op het object en het openen van de Wijs Nieuw Materiaal tabblad.
4. In de Attribute Editor klikt u op het geblokte vak rechts van de materialen Color attribuut.
5. Uit het pop-up menu, kies Bestand uit de 2D Textures sectie.
6. Onder het File Attributes sectie in de Attribute Editor, klik op het bestand pictogram rechts van de Image Name attribuut.
7. Kies het eerste deel van de sourceimages map.
8. Zet de camera van de Workspace venster vanuit het perspectief om de standaard orthografische Bovenaanzicht door het openen van de panels tab.
9. Selecteer de Create Veelhoek Gereedschap uit de Mesh tabblad van het hoofdmenu en teken de omtrek van de sectie.
10. Kies de eerste kaart uit de sourceimages map en toewijzen aan de nieuw gevormde veelhoek vliegtuig de stappen opgericht om de veelhoek vlak te maken.
11. Met het object geselecteerd, kiest u uit de UV-Marking Menu door op de rechter muisknop op het vliegtuig.
12. Selecteer alle vliegtuigen UV punten en open de UV Texture Editor van de Windows tabblad van het hoofdmenu.
13. Schaal de verhouding van de UV om de sectie vliegtuig passen.
14. Herhaal dit proces voor elke sectie van de neurosphere ervoor te zorgen dat de ruimten tussen elke sectie komen overeen met de hoogte van de schaal bar.

8. Lokaliseren Progenitor Cel typologieën in 3D

1. Van de status Line van user interface van Maya's, wijzigt u de menubalk van het standaard Animation instelling Dynamics.
2. Waardoor alleen het eerste gedeelte van de neurosphere zichtbaar is, verbergt alle andere secties door het veranderen van de weergave-instellingen van het tabblad Weergave van het hoofdmenu.
3. Met de CV Curve Tool de opties te openen, selecteer een Lineaire uit de CV Curve-instellingen.
4. Het bekijken van de scène uit de Top-camera, begin het toewijzen van punten om de cel te kaarten het creëren van een curve voor de Cx29-negatieve cellen en een voor de Cx29-positieve cellen.
5. De resulterende curves zijn plat wanneer bekeken vanuit een zijaanzicht camera. Bepaal de dikte van de secties door het verschuiven van de punten van de curve in de y-as met behulp van de schaal bar geïmporteerd uit de microscopie beelden als een gids.
6. Herhaal dit proces voor elke sectie van de neurosphere.
7. Importeer het cellTyoplogy.ma bestand uit de scènes folder van het project en dupliceren de cel typologie voor zowel de Cx29-negatieve en Cx29-positieve cellen in de neurosphere.
8. Open het venster van de Hypershade Windows> Rendering Editors tabblad van het hoofdmenu.
9. Importeer de eerder gebouwde shaders ze toe te kennen aan de cellen van de typologie.
10. Vanuit de Structuur-venster, verwijdert u de bestandsnaam van het begin van de geïmporteerde objecten. Dit zal belangrijk worden in latere fasen van het modelleren van proces.
11. Selecteer het tabblad Deeltjes in het hoofdmenu en maak een deeltje zender voor de eerste CV Curve.
12. Open het tabblad particleShape1 en onder Emission attributen wijzigen Max Graaf van -1 tot het aantal punten op uw eerste curve.
13. In de Render tabblad Kenmerken van de Particle Render type wijzigen naar Blobby Surface (s / w). Klik hieronder op de huidige Render vak Type en verander de straal van de deeltjes 0.010.
14. Bevestig de deeltjes naar de hoekpunten van de curve door eerst de deeltjes vervolgens shift het selecteren van de curve. Open de doel-opties vanuit de Deeltjes tabblad van het hoofdmenu en zet de streefgewicht op 1. Klik op Maken.
15. Selecteer de cellen van nummer 1 tot 10 in volgorde in de structuur venster en open de Instancer (Replacement)-opties doos van de deeltjes tabblad van het hoofdmenu. In het geval Objecten box, moeten alle tien cellen worden vermeld in volgorde.
16. Kies de juiste particleShape naam uit de keuzelijst van de Particle object naar aanleg tabblad. Klik op Maken.
17. Standaard wordt alleen de eerste cel die werd geselecteerd vervanging van de deeltjes langs de curve. Om te krijgen alle tien soorten verschijnen en fietsen willekeurig tussen de deeltjes, is een uitdrukking nodig. Een tweede uiting zal ervoor zorgen dat de cellen willekeurig uitstoten op dezelfde manier elke keer dat de Range Slider is verplaatst.
18. Met de emitter geselecteerd, opent u de Attribute Editor. In de particleShape tabblad klikt u onder Add attribuut dynamic op de Algemene doos. Onder Lange naam schrijven random_index. In attribuut type overschakelen van Scalar tot Per deeltje (matrix) en klik op Toevoegen.
19. In de per deeltje (Array) tabblad Attributen, heeft een random_index box toegevoegd. Als u op de rechter muisknop op de lege ruimte, selecteert u Expression ... uit het drop down box.
20. Typ de tekst in de Expression: box - particleShape1.random_index = rand (10), als (particleShape1.particleId == 1) zaad (1);
21. Ter afronding van de expressie van de Instancer (Geometry Replacement) tab te openen in de Attribute Editor en in het algemeen Opties> Object Index te selecteren random_index uit het drop down lijst. Breng de schuifregelaar voor tijd naar het eerste frame en druk op spelen, zijn de celtypen nu willekeurig verdeeld over de deeltjes.
22. Herhaal dit proces voor elke sectie van de neurosphere. Ervoor te zorgen dat elke nieuwe zender, instancer, en willekeurige index wordt gedifferentieerd met naam en adequaat georganiseerd in de structuur venster.

9. Rendering / Compositing

1. In de Render Met behulp gedeelte van de Render venster Instellingen, verander de renderer van Maya Software naar mental ray.
2. Open het tabblad Kwaliteit en onder Raytracing verander de instelling Reflections op nul. Open het tabblad Framebuffer en wijzig de Colorclip van Raw naar Alpha en vink Premultiply.
3. Open het Kanaal Box / laag-editor en verander de Layer-editor instelling van Weergave te maken.
4. Selecteer het geïmporteerde cellen van de typologie en klik op de nieuwe laag en wijs geselecteerde objecten pictogram.
5. Hernoem de laag ambient occlusion.
6. Als u op de rechter muisknop op de nieuw aangemaakte laag en selecteer Eigenschappen in het menu.
7. Aan de rechterkant van de renderLayer box, klik op de Presets knop en selecteer Occlusie van de drop down lijst.
8. Selecteer het tabblad mib_amb_occlusion1 en verander de monsters 16 tot 256.
9. Heropening van de Channel Box / Layer Editor en onder het tabblad Opties, open het Render Alle lagen opties box.
10. Selecteer Composiet en te houden lagen.
11. Met de geselecteerde ambientOcclusion laag, veranderen van Normaal naar Vermenigvuldigen uit het drop down box net boven de laag lijst.
12. Maken twee passen van de neurosphere, een keer met de ambientOcclusion laag ingeschakeld en een keer met de masterLayer ingeschakeld. Sla de afbeeldingen als IFF bestanden in de map afbeeldingen projecten.
13. Open beide afbeeldingen in Photoshop CS4. Plaats de ambientOcclusion laag op de top van de masterLayer en zet deze op Multiply. Maak een achtergrond en plat de afbeelding.

Discussion

Dit protocol beschrijft een procedure om cultuur en serieel cryosection postnatale hippocampus NPCs, lokaliseren eiwit-expressie door immunodetectie, en tenslotte te reconstrueren en analyseren van de topografische positie van immunopositive cellen in de hele 3D-neurosphere. Door de combinatie van celbiologie cultuur en verwerkingstechnieken, microscopie beeldvorming (Openlab, Improvisatie en andere beeldanalyse software), grafische editing software capaciteiten (Adobe Photoshop), en 3D-animatie en compositing software capaciteiten (Autodesk Maya), presenteren we een methodiek om de te reconstrueren gehele cellulaire samenstelling van de 3D-culturen uit serie 2D beelden waardoor de getrouwe reconstructie van cellulaire functie en eiwit expressie gedurende een neurosphere cultuur. Dit protocol kan gecombineerd worden met gelijk doeltreffendheid om de registratie en de wederopbouw van epifluorescerende dunne seriële secties of confocale Z-stacks door dikkere seriële secties. Omdat de klonale expansie van enkele NPC's in neurosphere cultuur recapituleert veel van de podia die gedurende de loop van de neurogenese en gliogenesis in post-natale hersenen, de impact van zijn 3D-structuur is een belangrijke NPC lot determinant in het nageslacht blootgesteld aan dezelfde experimentele milieu ^1. Divergentie in afkomst en proteïne-expressie in de kern en de periferie van de seriële neurosphere secties suggereert dat meerdere fysieke factoren, waaronder de cel positie, mechanische stress, en dwarskracht een belangrijke rol spelen in het reguleren van NPC biologie ^2. Bovendien heeft connexine eiwit expressie, geanalyseerd hier, is aangetoond dat ze veranderen afhankelijk van wanneer NPC's worden gekweekt als 3D neurospheres in suspensie of uitgeplaat op een laminine substraat met functionele connexine-gemedieerde communicatie veranderde of cellen worden gekweekt op plastic en substraat of in 3D gratis -drijvende culturen ^3. De impact van cellulaire positie op NPC lot blijft onduidelijk. Het is technisch een uitdaging om de impact van de ruimtelijke locatie te analyseren binnen de 3D-cultuur op de NPC biologie gezien het feit dat antigene beoordeling van de afstamming en signaaleiwitten vereist verstoring van de 3D-architectuur in staat te stellen cel permeabilisatie en antilichaam toegang tot alle cellen. Hier laten we zien dat een hybride visualisatie methodiek een middel om te bepalen of bepaalde eiwitten unieke positie lokalisaties tentoonstelling in 3D cultuur biedt, kan worden afgeleid en eiwit functie en regulatie test met betrekking tot de regionale lokalisatie binnen de neurosphere, en, misschien wel het allerbelangrijkste , biedt de positionele gegevens die nodig zijn om de impact van 3D topografie en cellulaire positionering op NPC lot in 3D cultuur te bestuderen.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Euthansol	Reagent	Merck & Co.
Krazy Glue	Reagent	Home Hardware
VT1000S vibratome	Equipment	Leica Microsystems
Neural protease	Reagent	Sigma-Aldrich	P6141	Stock solutions stored at -20°C
Papain	Reagent	Sigma-Aldrich	P4762	Stock solutions stored at -20°C
DNAse I	Reagent	Roche Group	11 284 932 001	Stock solutions stored at -20°C
MZ6 Dissecting Microscope	Equipment	Leica Microsystems
ProBlot 6 Hybridization Oven	Equipment	Labnet International
Centrifuge 5702	Equipment	Eppendorf
kPBS	Reagent	BioShop Canada	PBS404
B27 Supplement	Reagent	Invitrogen	17504-044
Ultra Low Binding Tissue Culture Dishes	Disposable	Corning	3261
Human Epidermal growth Factor	Reagent	Invitrogen	13247-051	Stock solutions stored at -20°C
Fibroblast growth factor-2	Reagent	Invitrogen	13256-029	Also known as basic fibroblast growth factor (bFGF) Stock solutions stored at -20°C
37% formaldehyde (molecular grade)	Reagent	Sigma-Aldrich	F8775
Belly Dancer Shaker	Equipment	Stovall Life Sciences, IBI Sciences
Tissue- Tek Cryomold	Disposable	Sakura Finetek	4566
Tissue-Tek OCT compound	Reagent	Sakura Finetek	4583
Whatman Grade 703 Blotting Paper	Disposable	VWR international	28298-020
CM1900 Cryostat	Equipment	Leica Microsystems
Polyclonal Anti-Cx29 Primary Antibody	Reagent	Kindly provided by Dr David Paul, Harvard Medical School		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
Cy3-conjugated donkey anti-rabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
H–chst 33258	Reagent	Sigma-Aldrich	861405
DMRA2 epiflourescent microscope, Orca ER camera, OpenLab v3.56	Equipment/ Software	Leica Microsystems		This protocol can be performed with any epifluorescent or confocal microscope.
Photoshop CS4	Software	Adobe		Graphic software
Maya v10	Software	Autodesk		Modeling software
Computer	Equipment	Intel		Processor: Intel Corei7 920, Memory:12GB DDR3 Video card: Nvidia GTX 285 (1GB RAM)
* All other standard chemical reagents listed in the protocol are from Sigma-Aldrich. All other standard tissue culture reagents are from Invitrogen.