Localisation des protéines en 3D de la culture de cellules souches neuronales: une méthodologie de visualisation hybride

Summary

Ici, nous décrivons la façon de produire, développer et immunolabel postnatale hippocampique cellules progénitrices neurales (PNJ) en trois dimensions (3D) de la culture. Ensuite, en utilisant des technologies de visualisation hybride, nous montrons comment des images numériques de cryocoupes immunomarquées peut être utilisé pour reconstruire et cartographier la position spatiale des cellules à travers le immunopositives Neurosphère 3D complet.

Abstract

L'importance des trois dimensions (3D) de la topographie en influençant souches neurales et de cellules progénitrices (NPC) phénotype est largement reconnue mais difficile à étudier. Lorsque dissociée de cerveau embryonnaire ou post-natale, des PNJ unique prolifèrent en suspension pour former neurosphères. Les cellules filles au sein de ces cultures adoptent spontanément distinctes lignées de développement (neurones, oligodendrocytes, astrocytes et) au cours de l'expansion en dépit d'être exposés au même milieu extracellulaire. Cette progression de récapitule plusieurs des stades observés au cours de la neurogenèse et la gliogénèse en post-natal du cerveau et est souvent utilisé pour étudier la biologie NPC de base dans un environnement contrôlé. Évaluation de l'impact complet de la topographie 3D et de positionnement au sein de ces cultures cellulaires sur le sort de NPC est cependant difficile. Pour localiser et d'identifier les protéines cibles lignées NPC par immunocytochimie, flottant neurosphères doit être plaquée sur un substrat ou coupes sériées. Ce traitement est nécessaire pour assurer perméabilisation cellulaire équivalent et l'accès des anticorps à travers la sphère. En conséquence, les images 2D épifluorescence du cryocoupes ou reconstructions 3D confocale de Z-piles ne peuvent fournir de l'information spatiale sur la position de la cellule au sein discrète physique ou numérique 3D et les tranches ne visualisez pas la position cellulaire dans la sphère intacte. Ici, pour réitérer la topographie de la culture et permettre Neurosphère analyse spatiale de l'expression protéique à travers toute la culture, nous présentons un protocole pour l'isolement, l'expansion et la coupe de série de post-natals neurosphères hippocampique adapté à immunodétection épifluorescence ou confocale de protéines cibles. Connexin29 (Cx29) est analysée comme un exemple. Ensuite, en utilisant un hybride de l'édition graphique et la modélisation 3D des logiciels appliqués rigoureusement à maintenir détails biologiques, nous décrivons comment ré-assembler le positionnement 3D structurelle de ces images et cartographier numériquement cellules marquées au sein de l'Neurosphère complète. Cette méthodologie permet la visualisation et l'analyse de la position cellulaire des protéines cibles et les cellules à travers la topographie de la culture 3D entier et facilitera une analyse plus détaillée des relations spatiales entre les cellules au cours de la neurogenèse et la gliogénèse in vitro.

Les deux Imbeault et Valenzuela contribué de façon égale et doivent être considérés conjointe premiers auteurs.

Protocol

1. Isolement des cellules progénitrices neurales

Gardez les tissus et les solutions à froid en tout temps pendant protocole d'isolement!

1. Avant de commencer vos cultures, de préparer les solutions mères suivantes:
   • La dissociation des médias (26 mM NaHCO _3, 124 mM NaCl, 5 mM de KCl, 0,1 mM CaCl ₂ * 2H ₂ O, 3,2 mM MgCl ₂ * 6H ₂ O, 10 mM de D-glucose, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / mL . streptomycine filtre stérile et stocker dans 10-15 ml aliquotes à -20 ° C. Préparer le bilan des concentrations des enzymes utilisées pour la téléphonie cellulaire dissociation dans une double distillation H ₂ O, filtre stérile et des aliquots conserver à -20 ° C: la protéase neuronaux (25 mg . / mL), la papaïne (10 mg / ml), DNaseI (10 mg / ml) sur la journée de l'expérience, ajouter des enzymes pour 15 ml de la dissociation des médias à l'concentrations finales suivantes: 1 mg / mL de la protéase, 0,1 mg / mL papaïne, 0,1 mg / ml solution de DNase I. Dissection contenant des concentrations d'enzyme finale peuvent être conservés sur la glace pendant le processus de dissection.
   • Entretien avec les médias: milieu de Dulbecco modifié Eagle F12 (DMEM/F12), 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / mL de streptomycine, 1X B27 supplément. Peut être conservé jusqu'à 3 mois à 4 ° C sans supplément et B27 jusqu'à un mois à 4 ° C avec B27 supplément.
   • Les facteurs de croissance: Préparer des aliquotes des stocks de 0,1 pg / mL facteur humain recombinant de croissance épidermique (hEGF) et 10 pg / mL facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF-2) dans DMEM/F12 + 0,1% d'albumine sérique bovine (BSA). Conserver à -20 ° C.
2. Pour anesthésier mortellement C57BL / 6 souriceaux, les souris sont injectées par voie intrapéritonéale avec Euthansol le jour postnatal 0-3.
3. Retirer délicatement le cerveau par une dissection standard et stocker dans un plat de 60 mm contenant du liquide céphalorachidien artificiel (ACSF: 26 mM NaHCO _3, 124 mM NaCl, 5 mM de KCl, ₂ mM de CaCl2 * 2H ₂ O, 1,3 mM MgCl ₂ 6H ₂ O * , 10 mM de D-glucose, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / mL de streptomycine). pH à 7,3 si le filtre nécessaire et stérile dans 50 ml aliquotes, conserver à -20 ° C.
4. En utilisant une lame de rasoir, le cerveau de bloc en enlevant le cervelet et le cerveau colle avec Krazy Glue, côté rostrales place, face dorsale en face de vous, sur le mandrin vibratome. Un Leica Microsystems VT1000S vibratome est utilisé dans ce protocole.
5. Chuck Position dans le vibratome et ajouter ACSF et de la glace dans les compartiments appropriés.
6. Couper les tranches de 500 um d'épaisseurs en utilisant une vitesse comprise entre 3.5 à 4.5 et la fréquence de 8,5.
7. Recueillir les tranches contenant la formation hippocampique dans des plats contenant ACSF.
8. En utilisant un microscope stéréoscopique, retirez hippocampes entre bregma -1.60 mm et -2,40 mm (jusqu'à ce que la région CA3 commence à la courbe ventralement) et placer dans un nouveau plat à sec (sans ACSF). Un Leica MZ6 loupe binoculaire est utilisé dans ce protocole.
9. Une fois tous les hippocampes sont collectées, émincer les tissus avec un scalpel (jusqu'à un aspect homogène et liquéfié est atteint).
10. Transfert tissus hachés à un tube en polypropylène de 15 ml contenant 2,5 ml contenant les médias de dissociation de la protéase de neurones, la papaïne, et DNAse I (voir l'étape n ° 1 pour la préparation de la solution). Notez que si il ya beaucoup de tissus de source (par exemple, à partir de 6 chiots), il est une bonne idée d'utiliser 2 flacons de 2,5 ml de milieu de dissociation de maintenir l'enzyme optimale: ratio tissus. Incuber à 37 ° C pendant 45-60 min avec rotation. Un four Labnet ProBlot hybridation 6 (acheté par Mandel scientifique) est utilisé dans ce protocole fixé à 4 mise en rotation.
11. Ajouter 10 ml de phosphate de potassium des tissus stériles de la culture une solution saline tamponnée (kbps: 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de tampon phosphate, pH 7,4) et centrifuger à 300 xg pendant 5 min. Une centrifugeuse Eppendorf (modèle 5702) est utilisé dans ce protocole.
12. Rejeter le surnageant et remettre le culot dans 5 ml de kpbs.
13. Dissocier les tissus par trituration à travers une pipette Pasteur.
14. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 xg pendant 5 min.
15. Resuspendre les cellules dans 3 mL de milieu de maintenance, les cellules comptent bleu trypan et les cellules de la plaque de 60 mm non adhérente plats (plats Corning adhésion Ultra-Low de liaison sont utilisés dans ce protocole, voir Matériaux) à une densité de 2,5 x 10 ⁵ cellules / plat dans 5 mL de milieu d'entretien. Boîtes de Pétri peuvent être utilisés à la place de plats adhésion Ultra-Low, mais les cultures auront besoin d'être exploitées dans la matinée et l'après-midi tous les jours lors de l'expansion pendant les 6 premiers jours in vitro (DIV) pour éviter le placage et différenciation spontanée.
16. Ajouter hEGF à une concentration finale de 20 ng / mL et le FGF-2 à une concentration finale de 10 ng / mL immédiatement après placage. Ajouter les facteurs de croissance supplémentaires tous les deux jours pendant la phase d'expansion jusqu'à ce jour de la collecte sur les DIV 14. (Barres d'échelle dans la vidéo de neurosphères expansion représentent 100 um.)

** Remarque: Les médias peuvent devenir jaune autour DIV 10 de la phase d'expansion. Si cela se produit, ajouter un autre 1 mL Mailes médias ntenance. Si le support est à nouveau jaune le jour suivant, ajouter un autre 1 mL de médias d'entretien - continuer à faire ce que nécessaire lors de votre phase d'expansion - n'oubliez pas d'ajuster le volume des facteurs de croissance en conséquence pour maintenir les concentrations final correct.

2. Cryosectioning série

1. Tap neurosphères délicatement avant la fixation d'assurer sphères sont bien séparés au moment de la fixation.
2. Ajouter moléculaires de formaldéhyde de qualité directement à la culture à une concentration finale de 3,7% et incuber à température ambiante (RT) pendant 20 min avec agitation lente. Une danseuse du ventre Stovall est utilisé dans ce protocole réglé à une vitesse de rotation de 2,5.
3. Recueillir neurosphères dans un tube en polypropylène de 15 mL et spin bas à 300 xg pendant 5 min.
4. Rejeter le surnageant et remettre le culot dans 10 ml de phosphate de sodium solution saline tamponnée (SNBV: 154 mM NaCl, 10 mM de tampon phosphate). Notez le changement dans l'utilisation de solution de Kpbs SNBV.
5. Isoler à 300 xg pendant 5 min.
6. Remettre en suspension dans ml de saccharose 5-10 20% (p / v) dans SNBV.
7. Gardez neurosphères à 4 ° C pendant au moins 24 h à cryoprotect cultures.
8. Remplissez un cryomold jetable avec la température de coupe optimale (PTOM) composé.
9. Verser délicatement la solution de saccharose contenant neurosphères dans un plat.
10. Utiliser un microscope stéréoscopique pour localiser les sphères représentant de différentes tailles avec le moins de preuves d'une rupture mécanique. Lorsque vous effectuez cette procédure pour la première fois, certaines cultures peuvent être brisés ou arrachés. Morphologie sera bien entretenu avec la pratique.
11. Doucement aspirer chaque Neurosphère en une pointe de pipette 1 ml (maintenir le volume de saccharose contenant solution enlevé au minimum) et le placer dans le composé octobre Marquer votre position approximative sur le moule de sorte que vous pouvez trouver les sphères plus tard.
12. Une fois que vous avez placé quelques sphères dans le cryomold, flash-congeler les échantillons à l'aide de CO ₂ jusqu'à ce que l'OCT est blanc.
13. Marquez l'emplacement de vos sphères sur le cube et le cube pop hors du moule
14. L'utilisation de pré-réfrigérée pince, placer le cube sur un morceau de papier filtre préalablement fixé à un mandrin avec octobre
15. Mettre davantage composé OCT autour du cube et congeler pour faire adhérer le bloc contenant les sphères utilisant du CO _2. Alternativement placer le mandrin (avec un papier filtre) dans le cryostat, squirt composé OCT sur un papier filtre, et le cube placer directement dans octobre Attendez jusqu'à ce que l'OCT est blanc et dur. Un Leica CM1900 cryostat est utilisé dans ce protocole.
16. Une fois que le composé OCT devient blanc, vous pouvez placer le mandrin sur le bloc de coupe, puis attendez au moins 30 min pour la température de s'équilibrer.
17. Couper série 10 sections um veille à vos marques et de vérifier souvent sous un microscope pour les sections Neurosphère. Placez autant de sections que vous pouvez sur une seule lame. Notez que vous pouvez ne pas être en mesure de voir les tranches de premières de votre Neurosphère sous la portée, afin de recueillir toutes les sections jusqu'à ce que vous voyez les cellules et de garder les 3-5 sections avant ce départ et à la fin de votre sphère. Ces sections antérieures et postérieures seront également traitées pour l'immunocytochimie. Une contre-coloration nucléaire lors de l'exécution immunomarquage est donc essentielle car elle vous permettra de détecter des cellules individuelles au niveau des pôles Neurosphère pas évident en microscopie phase standard inversé.
18. Sections Conserver à -20 ° C.

3. Immunocytochimie

1. Retirer les lames de -20 ° C et le dégel en appliquant SNBV doucement sur toutes les sections et incuber à température ambiante pendant 5 min.
2. Flick Off SNBV excès et d'appliquer immédiatement anticorps primaire dilué dans du tampon Ab (0,3% Triton X-100, 0,3% de sérum albumine bovine dans SNBV, pH 7,2). Vous aurez besoin d'environ 100 uL par diapositive. Dans ce protocole, nous localisons Cx29 dans la progéniture NPC discrets présents dans la culture Neurosphère 3D.
3. Couvrir avec du parafilm coupé pour couvrir les sections, mais ne pas dépasser la taille de la lame de microscope comme anticorps seront tirés de la lame, par osmose, si l'parafilm atteint ou dépasse la largeur de la diapositive. Le parafilm permettra d'éviter l'évaporation. Incuber une nuit à 4 ° C dans une chambre humide. Prenez soin de laisser flotter le parafilm sur les sections et ne lui permettent pas d'adhérer à la diapositive. Toutefois, ne pas supprimer ou modifier le placement du parafilm fois appliquée comme il faut prendre soin de ne pas appliquer une force de cisaillement sur les sections et ainsi perturber la morphologie.
4. Ajouter environ 1 ml SNBV directement aux sections et flotter hors du parafilm. Sinon, placer la lame à la verticale directement dans une jarre de Coplin jusqu'à ce que le parafilm s'envole. Ne retirez pas la parafilm jusqu'à ce qu'il s'envole, indépendamment de la manipulation que vous peut perturber la structure Neurosphère fragiles. Une fois le parafilm est hors de la diapositive, incuber 5 min à température ambiante. Flick Off SNBV et continuer avec 3 lavages à température ambiante pendant 5 min.
5. Appliquer anticorps secondaire dilué dans du tampon Ab et incuber à température ambiante pendant 1h dans une chambre humide tel que décrit ci-dessus. Vous aurez à nouveau besoin de ~ 100 ul / diapositive.
6. Répétez lave SNBV à l'étape 4. Appliquer une contre-coloration nucléaire dans le lavage 3 ^ème (Hoechst 33258 0,5 pg / mL dans SNBV) pendant 5 min et passez à le lavage final pendant 5 min à température ambiante.
7. Mont préféré dans votre anti-fade supports de montage et de lamelle, la sécurisation de la lamelle avec le premier vernis à ongles dans les coins, puis sur tout le pourtour pour éviter la perte (si vous utilisez une base de glycérol médias).
8. Procéder à la collecte d'images en utilisant un microscope à épifluorescence ou confocal. Dans ce protocole, nous utilisons un DMRA2 Leica, un Hamamatsu Orca ER caméra, et OpenLab v3.56 logiciel. Dans cet exemple, les images sont capturées sur trois canaux: (1) en contraste de phase, (3) Bleu UV (Leica A4 cube: Filtre combinaisons Ex 360/40, Di 400, Sp. BP470/40) et Rouge (Leica Y3 cube : combinaisons de filtres Ex BP535/50, Di 565, Sp. 610/75). Tirez sur chaque section de série attentifs à la première et la dernière section, en suivant les pôles en utilisant Hoechst 33258 marquage de l'ADN où la détection de phase de cellules unique est difficile.

4. Alignement

1. Lorsque le dégel cryocoupes sont montés sur les lignes de microscope, ils se déplacer et faire pivoter très légèrement. Ces écarts doivent être corrigées. Par ailleurs, lorsque chaque section de série est imagé, le centre de chaque image peut ne pas être au même endroit sur l'écran. En conséquence, chaque section numérisée de série doit être soigneusement alignée avec la section précédente afin de préserver la morphologie précise. Cet alignement requiert une attention particulière et précise à cytoarchitecture et détails topographiques.
2. Images de série de chaque canal et des barres d'échelle résident de 10 um et 50 um (établi en OpenLab v3.56 logiciel) sont sauvegardés comme des fichiers TIFF individuels et importé dans Photoshop CS4 en utilisant une taille de toile standard de 3300 x 2550 pixels et une résolution de 72 pixels / pouce. Une attention particulière à la taille de toile doit être pris dans cette importation de maintenir une échelle exacte. La taille de la toile et la résolution sont essentielles à la modélisation ultérieure dans Maya. La barre d'échelle, enregistré comme une couche séparée dans Photoshop, devrait être utilisée pour vérifier qu'aucun changement aux dimensions XY survenant lors de l'alignement dans Photoshop.
3. Ensuite, relier les trois (ou plus) couches correspondant à la même section (par exemple, le lien entre chaque phase, aux UV, et Cy3 série d'images pour chaque section). Ceci assure que quand une couche est aligné, d'autres couches associé à cette section sont également alignés dans le même temps. Alternativement, vous pouvez verrouiller la couche de phase une fois dans la position appropriée (voir ci-dessous), puis aligner les calques liés de cet article à la couche de phase.
4. Pour commencer, faites de toutes les couches invisibles en cliquant sur "l'oeil" icône dans la fenêtre des calques.
5. Tourner la première et seconde images à contraste de phase des sections Neurosphère série en cliquant sur "l'oeil" des icônes dans la fenêtre des calques. Accroître la transparence de la deuxième section. Sous la rubrique «image» onglet, ouvrez "rotation d'image" et choisissez "arbitraire". Tournez la deuxième section jusqu'à ce que vous êtes en mesure d'identifier les points de contiguïté géométriques et structurelles entre les images. Il est utile de comparer avant et en arrière avec le canal UV (Hoechst 33258 marqué sections).
6. Répétez l'opération pour toutes les sections suivantes de série comparant "proches voisins" (c'est à dire, la section immédiate antérieure avec la section immédiate postérieure) jusqu'à ce que toutes les sections et tous les canaux sont alignées avec précision.
7. Créez un plan de Maya V10 qui est de la même proportion que le fichier Photoshop.

5. Typologie cellulaire

1. De la ligne d'état de l'interface utilisateur de Maya, le changement de la Barre de menus dans son cadre d'animation par défaut à des surfaces.
2. Utilisez une sphère primitive lotissement pour créer le corps de la cellule.
3. Avec la Neurosphère sélectionné, commencer à manipuler ses sommets en cliquant sur le bouton droit de la souris sur l'objet et en sélectionnant dans le menu Vertex marquage. Poursuivre l'élaboration de la surface de la sphère en changeant le niveau d'affichage du menu de marquage.
4. De Subdivision Surfaces l'onglet du menu principal, ouvrez la Hiérarchie Réduire options de la boîte et de définir le nombre de niveaux à 2. Réduire la sphère.
5. Changer la barre des menus à partir de surfaces en polygones.
6. Avec la sphère sélectionné, ouvrez l'outil de géométrie Sculpt partir de l'onglet Mesh du menu principal.
7. Affiner la surface de la cellule à sa forme finale employant les outils de géométrie de l'outil de Sculpt l'onglet Paramètres.
8. Répétez ce processus pour créer des corps cellulaires différents pour simuler la variété de PNJ et de présenter la descendance PNJ dans le Neurosphère. Dans cette démonstration, dix corps cellulaires différents à la base de l'Neurosphère.
9. Sélectionnez la typologie des cellules et des transformations Freeze.
10. Avec les cellules de votre typologie établie, deux shaders de surface sera conçu pour représenter les deux cellules exprimantla protéine d'intérêt (dans notre exemple Cx29 cellules positives) et les cellules où la protéine est absente. Ici, aucune cellule avec Cx29 immunoréactivité est désigné Cx29-positif. Dans cet exemple, la localisation subcellulaire n'est pas modélisé bien une telle analyse est possible avec des modifications pour les shaders.
11. Ouvrez la fenêtre Hypershade partir de Windows Rendu éditeurs> onglet du menu principal.
12. Choisir un shader rampe à partir de matériaux de surface de l'onglet.
13. Ouvrez l'éditeur d'attributs et définir la couleur des shaders, Incandescence, la couleur ambiante, Bump Map, et les attributs de couleur spéculaire.
14. Assigner une texture 3D brownien au nœud couleur ambiante et une texture 2D fractale au nœud Bump Mapping.
15. Sélectionnez l'entrée résultante des shaders et des connexions de sortie et d'exporter le réseau sélectionné.
16. Sélectionnez la typologie de cellules et d'ouvrir la sélection Exporter options de la boîte.
17. Choisissez le type de fichier mayaAscii et décochez la case Inclure ces entrées. Exporter la sélection.

6. Cartographie cellulaire

1. Ouvrez le fichier de série alignée sections dans Photoshop CS4.
2. Établir une clé de coups de crayon pour marquer les emplacements de chaque cellules progénitrices dans les sections de série. Dans cette démonstration, une clé de trois coups - un carré, un carré avec une ligne pointillée, et un carré avec une croix - sera utilisé pour indiquer si une cellule se trouve dans un, deux ou trois sections. Cette clé de coups est encore défini par la couleur - dans cet exemple, le rouge représente les cellules exprimant notre protéine d'intérêt, Cx29, et le blanc représente des cellules n'exprimant pas Cx29.
3. Tournez la couche de phase et de commencer à marquer le centre de chaque cellule progénitrices avec un coup de crayon blanc. Utiliser un calque séparé dans le dossier la section qui permet de construire vos cartes.
4. Basculer entre les sections de localiser la position des cellules en sorte que les cellules sur plus d'une section sont correctement notée.
5. Avec la couche Cx29 allumé, sélectionnez les cellules qui se situent dans les régions où Cx29 est positivement exprimé.
6. Choisissez la commande Remplir de la barre d'onglet Edition de Photoshop menu principal et le changement des traits du blanc au rouge.
7. Avec les cartes terminées, enregistrer chaque section comme une image séparée JPEG dans le dossier du projet sourceimages Maya. Pour ce faire, un nouveau projet de Maya devrez d'abord être créé.

7. Importation et Assemblage Cartes en 3D

1. De la ligne d'état de l'interface utilisateur de Maya, le changement de la Barre de menus dans son cadre d'animation par défaut à des polygones.
2. Importez les fichiers et les planes.mb scaleBar.mb des scènes de projets dans le dossier.
3. Avec le plan sélectionné, attribuez un shader Lambert en cliquant sur le bouton droit de la souris sur l'objet et l'ouverture sur l'onglet Matériel attribuer de nouveaux.
4. Dans l'éditeur d'attributs cliquez sur la case à damiers à la droite de l'attribut couleur des matériaux.
5. Dans le menu pop-up, choisissez Fichier de la section 2D Textures.
6. Sous Fichier des attributs de la section dans l'éditeur d'attributs, cliquez sur l'icône du fichier à droite de l'attribut Nom de l'image.
7. Choisissez la première section du dossier sourceimages.
8. Mettez la caméra de la fenêtre Workspace de la vue en perspective à la vue par défaut Haut orthographiques en ouvrant l'onglet Panneaux.
9. Sélectionnez l'outil Créer un polygone à partir de l'onglet Mesh du menu principal et tracer le contour de la section.
10. Choisissez la première carte à partir du dossier sourceimages et l'affecter au plan un polygone nouvellement créé en suivant les étapes établies pour créer le plan de polygones.
11. Avec l'objet sélectionné, choisissez UV à partir du menu de marquage en cliquant sur le bouton droit de la souris sur l'avion.
12. Sélectionnez tous les points avions UV et ouvrir l'éditeur de texture UV partir de l'onglet Windows du menu principal.
13. Échelle de la proportion des UV pour s'adapter au plan de coupe.
14. Répétez ce processus pour chaque section de la Neurosphère veillant à ce que les espaces entre chaque section correspondent à la hauteur de la barre d'échelle.

8. Localiser les typologies de cellules souches en 3D

1. De la ligne d'état de l'interface utilisateur de Maya, le changement de la barre de menus à partir de son animation paramètre par défaut pour la dynamique.
2. Ne laissant que la première section de la Neurosphère visibles, cacher toutes les autres sections en modifiant les paramètres d'affichage de l'onglet Affichage du menu principal.
3. Avec la boîte de l'outil Courbe CV options ouvertes, sélectionnez une linéaire de la courbe des paramètres CV.
4. Visualisation de la scène de la caméra de haut, commence l'attribution des points aux cartes cellulaires créer une courbe pour les cellules Cx29-négatifs et un pour les cellules Cx29-positif.
5. Les courbes résultantes sont plats vus depuis un appareil photo vue de côté. Établir l'épaisseur des sections en déplaçant les points de la courbe dans l'axe des y en utilisant la barre d'échelle importés des images de microscopie comme un guide.
6. Répétez ce processus pour chaque section de la Neurosphère.
7. Importer le fichier à partir du dossier cellTyoplogy.ma scènes du projet et de reproduire la typologie des cellules à la fois pour les cellules Cx29-négatifs et positifs Cx29 dans le Neurosphère.
8. Ouvrez la fenêtre Hypershade partir de Windows Rendu éditeurs> onglet du menu principal.
9. Importer les shaders précédemment construit les assignant à des cellules de la typologie.
10. De la fenêtre Outliner, retirez le nom du fichier, du début des objets importés. Cela va devenir importante dans les étapes ultérieures du processus de modélisation.
11. Sélectionnez l'onglet Particules partir du menu principal et de créer un émetteur de particules pour la première courbe CV.
12. Ouvrez l'onglet particleShape1 et sous les attributs d'émission changer le comte Max de -1 au nombre de points sur votre première courbe.
13. Dans le Render attributs onglet changer le type de rendu de particules à la surface Dupont (s / p). Cliquez sur la zone Type de rendu en cours ci-dessous et changer le rayon des particules 0,010.
14. Fixer les particules à des sommets de la courbe en sélectionnant d'abord les particules, puis passer la sélection de la courbe. Ouvrez les options But de l'intérieur sur l'onglet Particules du menu principal et mettre l'objectif de poids à 1. Cliquez sur Créer.
15. Sélectionnez les cellules à partir du numéro 1 à 10 dans l'ordre dans la fenêtre Outliner et ouvrez le Instancer (remplacement) boîte d'options de l'onglet Particules du menu principal. Dans la zone Objets du Tribunal, tous les dix cellules doivent être énumérés dans l'ordre.
16. Choisissez le nom correct du particleShape la liste déroulante de l'objet particule à l'onglet instance. Cliquez sur Créer.
17. Par défaut, seule la première cellule qui a été sélectionnée remplacer les particules le long de la courbe. Afin d'obtenir tous les dix types de comparaître et de cycle au hasard parmi les particules, une expression est nécessaire. Une deuxième expression fera en sorte que les cellules émettent aléatoirement de la même manière chaque fois que le curseur de plage est repositionné.
18. Avec l'émetteur sélectionné, ouvrez l'éditeur d'attributs. Dans l'onglet particleShape, sous Attribut dynamique Ajouter cliquez sur la boîte générale. Sous Nom de longue écriture random_index. En interrupteur de type Attribut de scalaire à particule par (array) et appuyez sur Ajouter.
19. Dans la particule par (Array) onglet Attributs, une boîte de random_index a été ajouté. En cliquant sur le bouton droit de la souris sur l'espace vide, sélectionnez Créer expression ... à partir du menu déroulant.
20. Tapez le texte dans l'expression: boîte - particleShape1.random_index = rand (10); if (particleShape1.particleId == 1) semences (1);
21. Pour compléter l'expression ouverte de la Instancer (Remplacement géométrie) dans l'onglet Éditeur d'attribut et dans Options générales Objet> Indice random_index sélectionner dans la liste déroulante. Amener le curseur de temps à la première image et appuyez sur le jeu, les types de cellules sont maintenant distribués au hasard parmi les particules.
22. Répétez ce processus pour chaque section de la Neurosphère. Assurez-vous que chaque indice nouvel émetteur, instancer et aléatoire est différencié par son nom et organisée de façon appropriée dans la fenêtre Outliner.

9. Rendu / Compositing

1. Dans le rendu en utilisant la section des paramètres de rendu de la fenêtre, changer le moteur de rendu du logiciel Maya à mental ray.
2. Ouvrez l'onglet Qualité et sous Raytracing changer les Réflexions mise à zéro. Ouvrez l'onglet Framebuffer et changer le Colorclip partir Prémultiplier Raw pour Alpha et décocher.
3. Ouvrez le coffre-Manche / Layer Editor et changez le réglage du rédacteur couche d'affichage pour le rendu.
4. Sélectionnez les cellules importées de la typologie et cliquez sur Créer nouveau calque et attribuez icône sélectionnée objets.
5. Renommez l'occlusion ambiante couche.
6. En cliquant sur le bouton droit de la souris sur le calque nouvellement créé, sélectionnez Attributs dans le menu.
7. À la droite de la boîte de renderLayer, cliquez sur le bouton Presets et sélectionnez l'occlusion de la liste déroulante.
8. Sélectionnez l'onglet mib_amb_occlusion1 et changer le échantillons de 16 à 256.
9. Rouvrir la Manche Box / Layer Editor et sous l'onglet Options, ouvrez le rendre toutes les options boîte de Couches.
10. Sélectionnez Composite et de garder les couches.
11. Avec la couche ambientOcclusion sélectionnée, elle change de la normale à partir de Multipliez le menu déroulant juste au-dessus de la liste des calques.
12. Rendu deux passes du Neurosphère, une fois avec la couche ambientOcclusion allumé et une fois avec le masterLayer allumé. Enregistrer les images comme des fichiers IFF en images des projets dans le dossier.
13. Ouvrez les deux images dans Photoshop CS4. Placez la couche ambientOcclusion au sommet de la masterLayer et réglez Multiply. Créer un fond et d'aplatir l'image.

Discussion

Ce protocole décrit une procédure pour la culture et de série cryosection post-natale PNJ hippocampe, localiser l'expression des protéines par immunodétection, et enfin reconstruire et analyser la position topographique des cellules immunopositives au sein de l'ensemble Neurosphère 3D. En combinant la biologie cellulaire et la culture des techniques de traitement, l'imagerie microscopique (OpenLab, d'improvisation et d'autres logiciels d'analyse d'image), graphique capacités logiciel de montage (Adobe Photoshop), et l'animation 3D et les capacités du logiciel de compositing (Autodesk Maya), nous présentons une méthodologie pour reconstruire la toute composition cellulaire des cultures 3D à partir d'images 2D de série permettant la reconstitution fidèle de la position de cellulaire et l'expression des protéines à travers une culture Neurosphère. Ce protocole peut être combiné avec une efficacité égale à l'enregistrement et la reconstruction de sections minces épifluorescence serial ou confocale Z-piles dans des sections plus épaisses de série. Parce que l'expansion clonale des PNJ unique récapitule la culture Neurosphère de nombreuses étapes observées au cours de la neurogenèse et la gliogénèse en post-natal du cerveau, l'impact de sa structure 3D représente un déterminant important de PNJ sort dans la progéniture exposée au même milieu expérimental ^1. Divergences dans la lignée et l'expression des protéines dans le noyau et la périphérie des sections Neurosphère série suggère que plusieurs facteurs physiques, y compris la position des cellules, le stress mécanique et la force de cisaillement jouent un rôle important dans la régulation de la biologie PNJ ^2. Par ailleurs, l'expression des protéines connexine, analysé ici, a été démontré que le changement selon le moment où les PNJ sont cultivées comme neurosphères 3D en suspension ou en plaqué sur un substrat de laminine avec fonctionnelle connexine communication médiatisée altérée si les cellules sont cultivées sur plastique et substrat ou en 3D gratuitement flottant cultures ^3. L'impact de la position de cellulaires sur le sort de PNJ reste incertaine. Il est techniquement difficile d'analyser l'impact de la localisation spatiale au sein de la culture en 3D sur la biologie PNJ étant donné que l'évaluation antigénique du lignage et de protéines de signalisation requiert la perturbation de l'architecture 3D pour permettre perméabilisation cellulaire et l'accès à toutes les cellules d'anticorps. Ici, nous montrons que la visualisation d'une méthodologie hybride offre un moyen de déterminer si certaines protéines exposition unique dans la culture localisations positionnel 3D, peut être utilisé pour inférer et de tester la fonction des protéines et la réglementation en matière de localisation régionale au sein de l'Neurosphère, et, peut-être plus important , fournit les données de position nécessaires pour étudier l'impact de la topographie 3D et de positionnement sur le destin cellulaire NPC dans la culture 3D.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Euthansol	Reagent	Merck & Co.
Krazy Glue	Reagent	Home Hardware
VT1000S vibratome	Equipment	Leica Microsystems
Neural protease	Reagent	Sigma-Aldrich	P6141	Stock solutions stored at -20°C
Papain	Reagent	Sigma-Aldrich	P4762	Stock solutions stored at -20°C
DNAse I	Reagent	Roche Group	11 284 932 001	Stock solutions stored at -20°C
MZ6 Dissecting Microscope	Equipment	Leica Microsystems
ProBlot 6 Hybridization Oven	Equipment	Labnet International
Centrifuge 5702	Equipment	Eppendorf
kPBS	Reagent	BioShop Canada	PBS404
B27 Supplement	Reagent	Invitrogen	17504-044
Ultra Low Binding Tissue Culture Dishes	Disposable	Corning	3261
Human Epidermal growth Factor	Reagent	Invitrogen	13247-051	Stock solutions stored at -20°C
Fibroblast growth factor-2	Reagent	Invitrogen	13256-029	Also known as basic fibroblast growth factor (bFGF) Stock solutions stored at -20°C
37% formaldehyde (molecular grade)	Reagent	Sigma-Aldrich	F8775
Belly Dancer Shaker	Equipment	Stovall Life Sciences, IBI Sciences
Tissue- Tek Cryomold	Disposable	Sakura Finetek	4566
Tissue-Tek OCT compound	Reagent	Sakura Finetek	4583
Whatman Grade 703 Blotting Paper	Disposable	VWR international	28298-020
CM1900 Cryostat	Equipment	Leica Microsystems
Polyclonal Anti-Cx29 Primary Antibody	Reagent	Kindly provided by Dr David Paul, Harvard Medical School		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
Cy3-conjugated donkey anti-rabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
H–chst 33258	Reagent	Sigma-Aldrich	861405
DMRA2 epiflourescent microscope, Orca ER camera, OpenLab v3.56	Equipment/ Software	Leica Microsystems		This protocol can be performed with any epifluorescent or confocal microscope.
Photoshop CS4	Software	Adobe		Graphic software
Maya v10	Software	Autodesk		Modeling software
Computer	Equipment	Intel		Processor: Intel Corei7 920, Memory:12GB DDR3 Video card: Nvidia GTX 285 (1GB RAM)
* All other standard chemical reagents listed in the protocol are from Sigma-Aldrich. All other standard tissue culture reagents are from Invitrogen.