Lokalisera Protein i 3D Neural Stem Cell Culture: en hybrid Visualisering Methodology

Summary

Här beskriver vi hur man kan producera, expandera och immunolabel postnatal hippocampus neurala progenitorceller (NPC) i tre-dimensionell (3D) kultur. Nästa, med hjälp av hybrid-visualisering teknik, visar vi hur digitala bilder av immunolabelled kryosnitt kan användas för att rekonstruera och kartlägga de rumsliga position immunopositive celler i hela 3D neurosphere.

Abstract

Vikten av 3-dimensionell (3D) topografi att påverka neurala stamceller och stamceller (NPC) som är fenotyp allmänt känt men utmanande att studera. När skiljas från embryonala eller postnatal hjärna kommer enda NPCs föröka sig i suspension att bilda neurospheres. Dotter celler inom dessa kulturer antar spontant tydliga utvecklings härstamningar (nervceller, oligodendrocyter och astrocyter) under loppet av expansion trots att utsättas för samma extracellulära miljön. Denna progression rekapitulerar många av de stadier som observerats under loppet av neurogenes och gliogenesis i postnatal hjärnan och används ofta för att studera grundläggande NPC biologi i en kontrollerad miljö. Bedöma den fulla effekten av 3D-topografi och cellulära positionering inom dessa kulturer på NPC öde är dock svårt. För att lokalisera målproteiner och identifiera NPC härstamningar genom immuncytokemi måste fritt flytande neurospheres beläggas på ett substrat eller serie snittades. Denna bearbetning krävs för att säkerställa likvärdig cell permeabilization och antikroppar på hela klotet. Som ett resultat kan 2D epifluorescent bilder av kryosnitt eller konfokala rekonstruktioner av 3D Z-staplar ger bara geografisk information om cellens position inom diskreta fysiska eller digitala 3D-skivor och inte visualisera cellulära position i den intakta sfären. Här upprepa topografi neurosphere kultur och tillåta rumslig analys av protein uttryck i hela kulturen, presenterar vi ett protokoll för isolering, expansion och seriell sektionering av postnatal hippocampus neurospheres lämplig för epifluorescent eller konfokala immunodetection av målproteiner. Connexin29 (Cx29) analyseras som ett exempel. Nästa, programvaror med hjälp av en hybrid av grafisk redigering och 3D-modellering tillämpas strikt för att bevara den biologiska detalj beskriver vi hur att återmontera 3D strukturella placeringen av dessa bilder och digitalt karta märkta celler i hela neurosphere. Denna metod gör det möjligt för visualisering och analys av cellulära ställning målproteiner och celler i hela 3D-kulturen topografi och kommer att underlätta en mer detaljerad analys av rumsliga relationer mellan celler under loppet av neurogenes och gliogenesis in vitro.

Både Imbeault och Valenzuela bidragit lika och bör betraktas gemensamt första författare.

Protocol

1. Isolering av neurala stamceller

Håll vävnader och lösningar kallt hela tiden under isolering protokollet!

1. Innan du börjar kulturer, förbereda följande stamlösningar:
   • Dissociation media (26 mm NaHCO _3, 124 mM NaCl, 5 mm KCl, 0,1 mM CaCl ₂ * 2H ₂ O, 3,2 mM MgCl ₂ * 6H ₂ O, 10 mm D-glukos, 100 U / ml penicillin, 100 mikrogram / ​​ml . streptomycin Sterila filtret och förvara i 10-15 ml alikvoter vid -20 ° C. Bered lager koncentrationer av enzymer som används för cellulära dissociation i dubbeldestillerat H ₂ O, sterilt filter och alikvoter förvara vid -20 ° C: Neural proteas (25 mg . / mL), papain (10 mg / ml), DNAseI (10 mg / ml) På dagen för experimentet, lägga enzymer till 15 ml Dissociation Media på följande slutliga koncentrationer: 1 mg / ml proteas, 0,1 mg / mL papain, 0,1 mg / ml DNAse I. Dissection lösning innehållande slutliga enzymet koncentrationer kan hållas på is under dissekering processen.
   • Underhåll Media: Dulbecco ändrade Eagles medelstora F12 (DMEM/F12), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 mikrogram / ml streptomycin, 1X B27 tillskott. Kan förvaras upp till 3 månader vid 4 ° C utan B27 komplettera och upp till en månad vid 4 ° C med B27 tillägg.
   • Tillväxtfaktorer: Förbered lager alikvoter av 0,1 mikrogram / ml humant rekombinant epidermal tillväxtfaktor (hEGF) och 10 mikrogram / ml fibroblast tillväxtfaktor-2 (FGF-2) i DMEM/F12 + 0,1% bovint serumalbumin (BSA). Förvara vid -20 ° C.
2. Dödligt att söva C57BL / 6 valpar mus, möss injiceras intraperitonealt med Euthansol på postnatal dag 0-3.
3. Ta försiktigt bort hjärnor av standard dissekering och förvara i en 60 mm maträtt som innehåller artificiella cerebrospinalvätska (ACSF: 26 mm NaHCO _3, 124 mM NaCl, 5 mm KCl, 2 mM CaCl ₂ * 2H ₂ O, 1,3 mM MgCl ₂ * 6H ₂ O , 10 mm D-glukos, 100 U / ml penicillin, 100 mikrogram / ml streptomycin). pH till 7,3 vid behov och sterila filtret i 50 ml-portioner, förvara vid -20 ° C.
4. Använda ett rakblad, blockera hjärnan genom att ta bort lillhjärnan och limma hjärnan med Krazy Lim, rostralt uppåt ryggsidan mot dig, på vibratome chucken. En Leica Microsystems VT1000S vibratome används i detta protokoll.
5. Placera chuck i vibratome och lägga ACSF och is i rätt fack.
6. Skär skivor av 500 ìm tjocklek med en hastighet på mellan 3,5-4,5 och frekvens 8,5.
7. Samla skivor som innehåller hippocampus formation i maträtter som innehåller ACSF.
8. Använda ett stereomikroskop, ta bort hippocampi mellan bregma -1,60 mm och -2,40 mm (tills CA3 regionen börjar kurvan ventralt) och placera i en ny torr skål (utan ACSF). En Leica MZ6 dissekera mikroskop används i detta protokoll.
9. När alla hippocampi samlas, finhacka vävnad med skalpell (tills en homogen och flytande utseende uppnås).
10. Överföring malet vävnad till ett 15 ml polypropylen rör som innehåller 2,5 ml Dissociation media som innehåller neurala proteas, papain och DNAse I (se steg # 1 för beredning av lösningar). Notera om det finns en hel del källa vävnad (t.ex. från 6 ungar) är det en bra idé att använda 2 injektionsflaskor med 2,5 ml dissociation media för att bibehålla optimal enzym: vävnad förhållande. Inkubera vid 37 ° C i 45-60 min med rotation. En Labnet ProBlot 6 hybridisering ugn (köps via Mandels vetenskapliga) har används i detta protokoll inställd rotationsriktning inställningen 4.
11. Tillsätt 10 ml av steril vävnadsodling kaliumfosfat saltlösning (kbps: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM fosfatbuffert, pH 7,4) och centrifugera vid 300 xg under 5 minuter. Ett Eppendorf centrifug (modell 5702) används i detta protokoll.
12. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 5 ml kbps.
13. Dissociera vävnad genom trituration genom en pasteurpipett.
14. Centrifugera cellsuspension vid 300 xg under 5 minuter.
15. Resuspendera cellerna i 3 ml Underhåll medium räkna celler med hjälp av Trypan Blå och celler platta i 60 mm icke-häftande rätter (Corning Ultra-Low följsamhet bindande rätter används i detta protokoll, se material) med en täthet av 2,5 x 10 ⁵ celler / fat i 5 ml underhåll medium. Petriskålar kan användas i stället för Ultra-Low följsamhet rätter men kulturer kräver inte exploaterats på morgonen och eftermiddagen varje dag under expansion för de första 6 dagarna in vitro (DIV) för att förhindra plätering och spontan differentiering.
16. Lägg hEGF till en slutlig koncentration på 20 ng / ml och FGF-2 till en slutlig koncentration på 10 ng / ml omedelbart efter plätering. Lägg till ytterligare tillväxtfaktorer varannan dag under expansionsfasen fram till insamlingen dag DIV 14. (Skala barer i videon att utöka neurospheres representerar 100 ìm.)

** Obs: media kan bli gult runt DIV 10 i expansionsfasen. Om detta inträffar, lägga till ytterligare 1 ml Maintenance medier. Om media är återigen gula följande dag, lägga till ytterligare 1 ml Underhåll media - fortsätter att göra det som behövs under din expansionsfas - kom ihåg att justera volymen av tillväxtfaktorer därför att behålla rätt slutkoncentrationer.

2. Serial Cryosectioning

1. Knacka neurospheres försiktigt före fixering för att säkerställa områden är väl åtskilda vid tidpunkten för fixering.
2. Lägg molekylära kvalitet formaldehyd direkt till kulturer till en slutlig koncentration av 3,7% och inkubera vid rumstemperatur (RT) i 20 minuter med långsam skakning. En Anaheim magdansös används i detta protokoll inställd på en rotationshastighet på 2,5.
3. Samla neurospheres i ett 15 ml polypropylen rör och spinn ner vid 300 xg under 5 minuter.
4. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 ml natriumfosfat saltlösning (nPBS: 154 mM NaCl, 10 mM fosfatbuffert). Notera förändringen i lösningen användning från kbps till nPBS.
5. Spinn ner vid 300 xg under 5 minuter.
6. Resuspendera om 5-10 ml 20% sackaros (w / v) lösning i nPBS.
7. Håll neurospheres vid 4 ° C under minst 24 h till cryoprotect kulturer.
8. Fyll en disponibel cryomold med Optimal Cutting Temperatur (oktober) Compound.
9. Häll försiktigt den sackaroslösning innehåller neurospheres i en skål.
10. Använd ett stereomikroskop för att lokalisera representativa områden av varierande storlek med minsta tecken på mekaniska störningar. När du utför denna procedur för första gången, kan vissa kulturer brytas eller trasiga. Morfologi blir fint underhålls med praktik.
11. Försiktigt aspirera varje neurosphere upp i en 1 mL pipettspets (hålla volymen av sackaros med-lösning bort till ett minimum) och placera det i oktober förening. Märk din ungefärliga position på formen så att du kan hitta sfärerna senare.
12. När du väl har placerat ett par kulor i cryomold, flash-frysa proverna med hjälp av CO ₂ tills oktober är vit.
13. Markera platsen för din sfärer på kuben och pop kuben ut av mögel
14. Med hjälp av färdiga kylda pincett, placera kuben på en bit filterpapper som tidigare fast på en chuck med oktober
15. Placera fler oktober förening runt kuben och frysa att följa fältet med kulor med hjälp av CO _2. Alternativt placera chuck (med filtrerpapper) i kryostat, spruta oktober förening på filterpapper, och placera kub direkt i oktober Vänta tills oktober är vit och hård. En Leica CM1900 kryostat används i detta protokoll.
16. När oktober förening blir vit, kan du placera chucken på skärande blocket, sedan vänta minst 30 minuter för temperaturen att uppnå jämvikt.
17. Skär seriella 10 mikrometer sektioner ser efter dina märken och kontroll ofta under ett mikroskop för neurosphere sektioner. Placera så många avsnitt som du kan på en bild. Observera att du kanske inte kan se de första skivor av dina neurosphere omfattas, så samla alla avsnitt tills du ser celler och hålla 3-5 avsnitt före denna början och i slutet av din sfär. Dessa främre och bakre delarna kommer också att behandlas för immuncytokemi. En nukleär motfärg när du utför immunfärgning är därför viktig eftersom den kommer att tillåta dig att upptäcka enstaka celler vid neurosphere polerna inte utan vidare under normala inverterad fas mikroskopi.
18. Förvara sektioner vid -20 ° C.

3. Immuncytokemi

1. Ta bort bilder från -20 ° C och tina genom att nPBS försiktigt över alla sektioner och inkuberas vid RT i 5 min.
2. Flick bort överflödigt nPBS och omedelbart tillämpa primära antikroppen späds i Ab buffert (0,3% Triton X-100, 0,3% bovint serumalbumin i nPBS, pH 7,2). Du behöver ~ 100 mikroliter per bild. I detta protokoll lokalisera vi Cx29 i diskret NPC avkommor som finns i 3D neurosphere kultur.
3. Täck med parafilm skär för att täcka de delar, men inte överskrida storleken på objektglas som antikroppar kommer att dras från glaset genom osmos om parafilm når eller överskrider bredden på bilden. Den parafilm kommer att förhindra avdunstning. Inkubera över natten vid 4 ° C i en fuktig kammare. Var noga med att flyta parafilm över avsnitten och inte gör det möjligt att ansluta sig till bilden. Men ta inte bort eller ändra parafilm placering gång tillämpas måste man vara försiktig att inte tillämpa någon tvärkraft på avsnitten och därmed störa morfologi.
4. Tillsätt ~ 1 ml nPBS direkt till sektionerna och flyta bort parafilm. Alternativt, placera bilden vertikalt direkt i en Coplin burk tills parafilm flyter bort. Ta inte bort parafilm tills den flyter bort oberoende av manipulation som du kan störa sköra neurosphere struktur. När parafilm är utanför bilden, inkubera 5 min vid RT. Flick off nPBS och fortsätt med ytterligare 3 tvättar i RT i 5 min.
5. Applicera sekundär antikropp späds ut i Ab buffert och inkubera vid RT för 1h på en fuktkammare som beskrivits ovan. Du kommer återigen att kräva ~ 100 mikroliter / bild.
6. Upprepa nPBS tvättar i steg 4. Applicera en nukleär motfärg i den 3: ^e tvätt (Hoechst 33.258 0,5 mikrogram / ​​ml i nPBS) i 5 minuter och fortsätta med den sista tvätten i 5 minuter vid RT.
7. Montera i önskad anti-fade montering media och täckglas, säkra täckglas med nagellack först i hörnen då alla runt kanterna för att förhindra förlust (om du använder en glycerol-baserad media).
8. Gå vidare till bildsamling med en epifluorescent eller konfokalmikroskop. I detta protokoll använder vi en Leica DMRA2, en Hamamatsu Orca ER kameran och OpenLab v3.56 programvara. I detta exempel är bilder tagna på tre kanaler: (1) faskontrast, (3) blå UV (Leica A4 kub: Filter kombinationer Ex 360/40, Di 400, Sp BP470/40) och Röd (Leica Y3 kub : Filter kombinationer Ex BP535/50, 565 Di, Sp 610/75). Skjut varje seriell avsnitt ägnar stor uppmärksamhet åt den första och den sista delarna genom att spåra polerna med Hoechst 33.258 märkning av DNA där fas upptäckt av enskilda celler är svårt.

4. Justering

1. När kryosnitt är tö-monteras på mikroskopet linjer, kommer de att flytta och rotera en aning. Dessa avvikelser måste korrigeras. Dessutom, när varje seriell sektion avbildas kan mitten av varje bild inte vara på samma plats på skärmen. Som ett resultat måste varje digitaliserade seriell avsnitt noggrant sammanfalla med föregående avsnitt för att bevara exakt morfologi. Denna anpassning kräver en noggrann och exakt uppmärksamhet cytoarchitecture och topografiska detaljer.
2. Seriell bilder av varje kanal och bosatt barer skala från 10 mikrometer och 50 ìm (etablerat i OpenLab v3.56 programvara) sparas som individuella TIFF-filer och importeras till Photoshop CS4 med en vanlig duk storlek på 3300 x 2550 pixlar och en upplösning på 72 pixels / inch. Noggrann uppmärksamhet på duk storlek måste tas i denna import för att upprätthålla en noggrann skala. Duken storlek och upplösning är nyckeln till efterföljande modellering i Maya. Skalan bar, sparas som ett separat lager i Photoshop, bör användas för att kontrollera att ingen förändring av XY dimensioner inträffar under justering i Photoshop.
3. Nästa länk de tre (eller fler) lager som motsvarar samma avsnitt (dvs. länka varje fas, UV, och Cy3 bildserie för varje avsnitt). Detta försäkrar att när ett lager är justerad, är andra skikt förenade med den delen också i linje på samma gång. Alternativt kan du låsa fasen lagret en gång i lämpligt läge (se nedan) och sedan anpassa tillhörande lager av det avsnittet till fas lagret.
4. Till att börja med att göra alla lager osynlig genom att klicka på "ögat"-ikonen i lager-fönstret.
5. Slå den första och andra bilder faskontrast av neurosphere seriella avsnitten om genom att klicka på "öga" ikoner i lager-fönstret. Öka insynen i det andra avsnittet. Under "Bild" fliken, öppna "image rotation" och välj "godtyckliga". Vrid den andra delen tills du kan identifiera punkter geometriska och strukturella kopplingar mellan bilderna. Det är bra att jämföra fram och tillbaka med UV-kanal (Hoechst 33.258-märkta avsnitt).
6. Upprepa för alla efterföljande serienummer sektioner jämföra "närmsta grannar" (dvs de omedelbara främre sektionen med omedelbar bakre delen) tills alla sektioner och alla kanaler är korrekt justerade.
7. Skapa en plan i Maya V10 som är av samma proportioner som i Photoshop-filen.

5. Cell typologi

1. Från Status Line of Mayas användargränssnitt, ändra menyraden från dess standard Animation inställning till ytor.
2. Använd en primitiv uppdelning sfär för att skapa cellkroppen.
3. Med neurosphere valt att börja manipulera sitt hörn genom att klicka med höger musknapp på objektet och välja Vertex från Märkning menyn. Vidareutveckla ytan av sfären genom att ändra Display nivå från markeringen menyn.
4. Från Indelning Ytor fliken i huvudmenyn, öppna Collapse Hierarkin alternativen rutan och ange antal nivåer till 2. Komprimera sfären.
5. Ändra menyraden från ytor till polygoner.
6. Med sfären utvalt, öppnar Sculpt Geometry Tool Mesh-fliken i huvudmenyn.
7. Begränsa ytan av cellen till sin slutliga form anställa Sculpt Geometry verktygsuppsättning från Tool fliken Inställningar.
8. Upprepa denna process för att skapa olika cell organ för att simulera olika NPC: er och NPC avkomma finns i neurosphere. I denna demonstration, tio olika cell organ utgör grunden för neurosphere.
9. Markera cellen typologi och transformationer Freeze.
10. Med cellerna i din indelning som fastställs kommer två ytan shaders vara utformade för att representera både celler som uttryckerproteinet av intresse (i vårt exempel Cx29-positiva celler) och celler där proteinet är frånvarande. Här är en cell med Cx29 immunreaktivitet utsetts Cx29-positiv. I detta exempel är subcellulära lokalisering inte modelleras även om en sådan analys är möjligt med ändringar av shaders.
11. Öppna Hypershade fönstret från Windows> Rendering Editors fliken i huvudmenyn.
12. Välj en ramp Shader från ytan material fliken.
13. Öppna Attribut Editor och ställ in shaders Färg, glöd, Omgivningstemperatur Färg, Bump Karta och Speglande attribut Färg.
14. Tilldela en Brownsk 3D textur till Ambient Färg noden och en 2D Fractal textur till Bump Mapping noden.
15. Välj den resulterande shaders In-och utgångsanslutningar och exportera det markerade nätverket.
16. Markera cellen typologi och öppna Export Selection-alternativ.
17. Välj den filtyp mayaAscii och avmarkera Inkludera dessa ingångar låda. Exportera markering.

6. Cell Kartläggning

1. Öppna anpassade seriella avsnitt fil i Photoshop CS4.
2. Upprätta en nyckel Pencil slag för att ange var varje stamcellstransplantation i serie avsnitt. I denna demonstration, en viktig av tre slag - en solid torg, ett torg med en streckad linje, och en fyrkant med ett kryss - kommer att användas för att ange om en cell är belägen i en, två eller tre sektioner. Denna nyckel av stroke definieras närmare av färg - i det här exemplet representerar röda celler som uttrycker vårt proteinet av intresse, Cx29 och vita representerar celler inte uttrycker Cx29.
3. Vrid Fas lager på och börja märkning mitten av varje stamcellstransplantation med en vit penna stroke. Använd ett separat lager inom sektionen mappen med att bygga dina kartor.
4. Växla mellan sektionerna för att lokalisera celler läge att se till att celler på mer än en sektion är korrekt betecknas.
5. Med Cx29 skiktet slagits på väljer du de celler som ligger i de regioner där Cx29 är positivt uttryck.
6. Välj kommandot Fyll på Redigera-fliken Photoshop huvudmeny bar och ändra den vita streck till rött.
7. Med kartorna fullföljts, varje avsnitt som en separat JPEG-bild i sourceimages mappen i Maya projektet. För att göra detta kommer ett nytt Maya-projekt måste först skapas.

7. Importera och Montering kartor i 3D

1. Från Status Line of Mayas användargränssnitt, ändra menyraden från dess standard Animation inställningen till polygoner.
2. Importera planes.mb och scaleBar.mb filer från projekten scenerna mappen.
3. Med planet valt tilldela en Lambert skuggning genom att klicka med höger musknapp på objektet och öppnar tilldela nya fliken Material.
4. I Attribut Editor klickar rutiga rutan till höger om material Färg attribut.
5. Från popup-menyn väljer du Arkiv från 2D-texturer avsnitt.
6. Enligt filattributen avsnittet i Attribute Editor på ikonen till höger om bildens namn attribut.
7. Välj det första avsnittet från sourceimages mappen.
8. Slå på kameran i Workspace fönstret utifrån att den förvalda ortografiska uppifrån genom att öppna paneler fliken.
9. Välj Create Polygon Tool Mesh fliken i huvudmenyn och följ utsidan av avsnittet.
10. Välj den första kartan från sourceimages mappen och tilldela den till den nyinrättade polygonen plan att följa stegen inrättats för att skapa en polygon planet.
11. Med objektet markerat väljer UV märkningen menyn genom att klicka på höger musknapp över planet.
12. Markera alla plan UV-poäng och öppna UV Texture Editor från Windows-fliken i huvudmenyn.
13. Skala den proportionellt av UV att passa avsnittet planet.
14. Upprepa denna process för varje avsnitt av de neurosphere se till att ytorna mellan varje avsnitt motsvarar höjden på skalan baren.

8. Hitta Typologies stamceller i 3D

1. Från Status Line of Mayas användargränssnitt, ändra menyraden från dess standard Animation inställningen till Dynamics.
2. Vilket innebär att endast den första delen av neurosphere synliga, dölja alla andra avsnitt genom att ändra inställningarna för displayen på fliken Visa i huvudmenyn.
3. Med CV Curve Tools alternativrutan öppen väljer en linjär från CV Curve inställningar.
4. Visa scenen från början Visa kameran, börja tilldela poäng till cellen kartorna skapa en kurva för Cx29-negativa celler och en för Cx29-positiva celler.
5. Den resulterande kurvorna är platta när de ses från sidan kamera. Upprätta tjockleken på avsnitten genom att flytta punkter på kurvan i y-axeln med hjälp av skalan baren importeras från mikroskopi bilder som guide.
6. Upprepa denna process för varje avsnitt av neurosphere.
7. Importera cellTyoplogy.ma filen från scenerna mapp i projektet och duplicera cellen typologi för både Cx29-negativa och Cx29-positiva celler i neurosphere.
8. Öppna Hypershade fönstret från Windows> Rendering Editors fliken i huvudmenyn.
9. Importera tidigare byggt shaders tilldela dem till cellerna i typologi.
10. Från Outliner fönstret, ta bort filnamnet från början av den importerade objekt. Detta kommer att bli viktigt i senare skeden av modellering processen.
11. Välj Partiklar fliken från huvudmenyn och skapa en partikel emitter för första CV-kurvan.
12. Öppna particleShape1 fliken och under Utsläpp Attribut ändra Max count från -1 till det antal poäng på din första kurvan.
13. I Render fliken Attribut ändra typen Particle Render till Blobby Surface (s / v). Klicka på Aktuella Render rutan nedan och ändra radien av partiklarna 0,010.
14. Fäst partiklar till hörnen på kurvan genom att först välja partiklarna sedan på SKIFT välja kurvan. Öppna Mål alternativ inifrån Partiklar fliken i huvudmenyn och ställ målvikt till 1. Klicka på Skapa.
15. Markera celler från nummer 1 till 10 i ordning i Outliner fönster och öppna Instancer (Replacement) optioner låda från partiklarna fliken i huvudmenyn. I dom Objekt box bör alla tio celler listas i ordning.
16. Välj rätt particleShape namn från rullgardinsmenyn i Particle Object att dom fliken. Klicka på Skapa.
17. Som standard kommer bara den första cellen som valdes ersätta partiklar längs kurvan. För att få alla tio typer ska visas och cykla slumpmässigt bland partiklarna, är ett uttryck behövs. En andra uttryck kommer att säkerställa att cellerna avger slumpmässigt på samma sätt varje gång Range Slider är flyttas.
18. Med sändaren utvalt, öppnar Attribut Editor. I particleShape fliken Lägg till attributet dynamic klicka på Allmänt rutan. Under långa namn skriver random_index. I attributtyp byta från Skalär till Per partikel (matris) och klicka på Lägg till.
19. I per partikel (Array) fliken Attribut har en random_index låda lagts till. Om du klickar på höger musknapp över den tomma rymden, välj Skapa Expression ... från rullgardinsmenyn.
20. Skriv texten i Expression: Box - particleShape1.random_index = rand (10), om (particleShape1.particleId == 1) utsäde (1);
21. För att slutföra uttrycket öppna Instancer (Geometri Replacement) flik i Attribute Editor och i General Options> Objekt Index välja random_index från drop down-listan. Ta den tid reglaget till den första bildrutan och tryck play, är de celltyper nu slumpmässigt fördelas mellan partiklar.
22. Upprepa denna process för varje avsnitt av neurosphere. Se till att varje ny sändare, instancer och slumpmässiga index är differentierad efter namn och organiseras på lämpligt sätt i Outliner fönster.

9. Rendering / Compositing

1. I Render Använda delen av Renderingsinställningar fönstret, ändra renderaren från Maya Software mental ray.
2. Öppna fliken Kvalitet och under Raytracing ändra Reflektioner inställningen till noll. Öppna Framebuffer fliken och ändra Colorclip från RAW till Alpha och avmarkera Premultiply.
3. Öppna Kanal Box / lager Editor och ändra inställningen Layer Editor från Display att rendera.
4. Markera den importerade cellerna i typologi och klicka på Skapa nytt lager och tilldela utvalda objekt ikon.
5. Byt namn på lagret omgivande ocklusion.
6. Om du klickar på höger musknapp över den nyinrättade lagret, välj Attribut från menyn.
7. Till höger om renderLayer rutan, klicka på Presets knappen och välj Ocklusion från drop down-listan.
8. Välj mib_amb_occlusion1 fliken och ändra Prover från 16 till 256.
9. Öppna kanalen Box / lager Redaktör och under fliken Alternativ öppna Render Alla lager-alternativ.
10. Välj Komposit och hålla lager.
11. Med den valda ambientOcclusion lager, ändra från Normal till Multiply i rullgardinsmenyn ovanför lagret listan.
12. Render två passager av neurosphere, en gång med ambientOcclusion lagret påslagen och en gång med masterLayer påslagen. Spara bilderna som IFF filer i projekten bilder mappen.
13. Öppna båda bilderna i Photoshop CS4. Placera ambientOcclusion lager ovanpå masterLayer och ställ in den att föröka sig. Skapa en bakgrund och platta till bilden.

Discussion

Detta protokoll beskriver en procedur till kultur och serie cryosection postnatal hippocampus NPC, lokalisera proteinuttryck av immunodetection och slutligen rekonstruera och analysera topografiska läge immunopositive celler i hela 3D neurosphere. Genom att kombinera kultur cellbiologi och tekniker bearbetning, mikroskopi imaging (OpenLab, improvisation och annan bild mjukvaror analys), grafiska redigeringsprogram kapacitet (Adobe Photoshop), och 3D-animering och montage kapacitet programvara (Autodesk Maya) presenterar vi en metod för att rekonstruera Hela cellulära sammansättning av 3D kulturer från seriella 2D-bilder gör det möjligt att troende återuppbyggnaden av cellulära position och proteinuttryck under en neurosphere kultur. Detta protokoll kan kombineras med samma effektivitet till registrering och rekonstruktion av epifluorescent tunna serie avsnitt eller konfokala Z-stackar genom tjockare serie avsnitt. Eftersom klonal expansion av enstaka NPCs i neurosphere kultur rekapitulerar många av de stadier som observerats under loppet av neurogenes och gliogenesis i postnatal hjärna, representerar effekterna av dess 3D-struktur en viktig bestämningsfaktor NPC öde i avkomman utsatts för samma experimentella miljön ^1. Skillnader i härstamning och proteinuttryck i centrum och periferi seriella neurosphere avsnitt tyder på att flera fysiska faktorer inklusive cell position, mekanisk stress och tvärkraft spelar en viktig roll i regleringen av NPC biologi ^2. Dessutom har connexin proteinuttryck, analyseras här, visat att ändras beroende på när NPC odlas som 3D neurospheres i suspension eller pläterade på en laminin substrat med funktionell connexin-medierad kommunikation förändras om celler odlas på plast och substrat eller i 3D gratis -flytande kulturer ^3. Effekten av cellulära position på NPC öde är fortfarande oklart. Det är tekniskt utmanande att analysera effekterna av fysisk plats inom 3D-kultur på NPC biologi med tanke på att antigen bedömning av härstamning och signalproteiner kräver avbrott i 3D-strukturen för att aktivera cellen permeabilization och antikroppar tillgång till alla celler. Här visar vi att en hybrid visualisering metodik ger en möjlighet att avgöra om vissa proteiner har mycket speciella positionella lokaliseringar i 3D kulturen, kan användas för att dra slutsatser och testa proteiners funktion och reglering med hänsyn till regionala lokalisering inom neurosphere, och, kanske viktigast av allt ger positionsdata som krävs för att studera effekten av 3D-topografi och cellulära placering på NPC öde i 3D kultur.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Euthansol	Reagent	Merck & Co.
Krazy Glue	Reagent	Home Hardware
VT1000S vibratome	Equipment	Leica Microsystems
Neural protease	Reagent	Sigma-Aldrich	P6141	Stock solutions stored at -20°C
Papain	Reagent	Sigma-Aldrich	P4762	Stock solutions stored at -20°C
DNAse I	Reagent	Roche Group	11 284 932 001	Stock solutions stored at -20°C
MZ6 Dissecting Microscope	Equipment	Leica Microsystems
ProBlot 6 Hybridization Oven	Equipment	Labnet International
Centrifuge 5702	Equipment	Eppendorf
kPBS	Reagent	BioShop Canada	PBS404
B27 Supplement	Reagent	Invitrogen	17504-044
Ultra Low Binding Tissue Culture Dishes	Disposable	Corning	3261
Human Epidermal growth Factor	Reagent	Invitrogen	13247-051	Stock solutions stored at -20°C
Fibroblast growth factor-2	Reagent	Invitrogen	13256-029	Also known as basic fibroblast growth factor (bFGF) Stock solutions stored at -20°C
37% formaldehyde (molecular grade)	Reagent	Sigma-Aldrich	F8775
Belly Dancer Shaker	Equipment	Stovall Life Sciences, IBI Sciences
Tissue- Tek Cryomold	Disposable	Sakura Finetek	4566
Tissue-Tek OCT compound	Reagent	Sakura Finetek	4583
Whatman Grade 703 Blotting Paper	Disposable	VWR international	28298-020
CM1900 Cryostat	Equipment	Leica Microsystems
Polyclonal Anti-Cx29 Primary Antibody	Reagent	Kindly provided by Dr David Paul, Harvard Medical School		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
Cy3-conjugated donkey anti-rabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
H–chst 33258	Reagent	Sigma-Aldrich	861405
DMRA2 epiflourescent microscope, Orca ER camera, OpenLab v3.56	Equipment/ Software	Leica Microsystems		This protocol can be performed with any epifluorescent or confocal microscope.
Photoshop CS4	Software	Adobe		Graphic software
Maya v10	Software	Autodesk		Modeling software
Computer	Equipment	Intel		Processor: Intel Corei7 920, Memory:12GB DDR3 Video card: Nvidia GTX 285 (1GB RAM)
* All other standard chemical reagents listed in the protocol are from Sigma-Aldrich. All other standard tissue culture reagents are from Invitrogen.