Summary
هنا ، نحن تصف كيفية إنتاج ، وتوسيع ، وبعدها immunolabel الحصين الخلايا العصبية السلف (الشخصيات) في الثقافة (3D) ثلاثي الأبعاد. المقبل ، وذلك باستخدام تقنيات التصور الهجين ، علينا أن نظهر كيف يمكن استخدام الصور الرقمية من cryosections immunolabelled لإعادة بناء ورسم خريطة للموقف المكاني للخلايا في جميع أنحاء immunopositive neurosphere 3D بأكمله.
Abstract
أهمية الطوبوغرافيا (3D) 3 الابعاد في التأثير على الخلايا الجذعية العصبية والسلف (مجلس الشعب) هو النمط الظاهري على نطاق واسع حتى الآن اعترف تحديا للدراسة. عندما ينفصل عن المخ الجنينية أو بعد الولادة ، واحد الشخصيات تتكاثر في تعليق لتشكيل neurospheres. الخلايا الوليدة داخل هذه الثقافات اعتماد عفويا الأنساب تنموية متميزة (الخلايا العصبية ، oligodendrocytes ، والنجمية) على مدى التوسع على الرغم من أن تتعرض لنفس الوسط خارج الخلية. يلخص هذا التطور لاحظ العديد من المراحل على مدى تكوين الخلايا العصبية وgliogenesis في مرحلة ما بعد الولادة الدماغ وغالبا ما تستخدم لدراسة البيولوجيا الأساسية للمجلس الوطنى ضمن بيئة تسيطر عليها. تقييم الأثر الكامل للتضاريس 3D وتحديد المواقع الخلوية داخل هذه الثقافات على مصير مجلس الشعب ، على أية حال ، من الصعب. في توطين البروتينات المستهدفة وتحديد الأنساب مجلس الشعب التي كيمياء سيتولوجية مناعية ، يجب أن يكون مطلي التعويم الحر neurospheres على ركيزة مقطوع أو متسلسل. هذا أمر مطلوب لضمان تجهيز يعادل permeabilization الخلية وصول الأجسام المضادة في جميع أنحاء المجال. ونتيجة لذلك ، يمكن للصور epifluorescent 2D أو إعادة البناء من cryosections مبائر من مداخن 3D - Z سوى تقديم المعلومات المكانية عن موقف شرائح منفصلة داخل الخلية الجسدية أو 3D الرقمية ولا تصور الموقف الخلوية في المجال سليمة. هنا ، أن أؤكد مجددا على تضاريس الثقافة neurosphere والسماح التحليل المكاني للتعبير البروتين في جميع أنحاء ثقافة بأكملها ، نقدم بروتوكول للعزلة ، والتوسع ، وsectioning المسلسل في مرحلة ما بعد الولادة neurospheres الحصين مناسبة للمناعي epifluorescent مبائر أو البروتينات الهدف. ويتم تحليل Connexin29 (Cx29) كمثال على ذلك. المقبل ، وذلك باستخدام مزيج من تحرير الرسم والنمذجة 3D برامج التطبيق الصارم للحفاظ على التفاصيل البيولوجية ، ونحن تصف كيفية إعادة تجميع المواقع 3D الهيكلية لهذه الصور والخرائط رقميا الخلايا المسمى داخل neurosphere كاملة. هذه المنهجية يمكن تصور وتحليل للموقف من البروتينات الخلوية والخلايا المستهدفة في جميع أنحاء 3D التضاريس ثقافة بأكملها ، وسوف يسهل تحليل أكثر تفصيلا للالعلاقات المكانية بين الخلايا على مدى تكوين الخلايا العصبية وgliogenesis في المختبر.
وساهم كل من Imbeault فالنزويلا على قدم المساواة وينبغي النظر في الكتاب المشترك الأول.
Protocol
1. عزل الخلايا الاصلية العصبية
إبقاء الأنسجة وحلول البرد في جميع الأوقات خلال بروتوكول العزلة!
- قبل البدء الثقافات الخاص ، وإعداد الحلول الأوراق المالية التالية :
- تفارق وسائل الاعلام (26 ملي NaHCO 3 ، 124 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 5 ملي بوكل ، 0.1 ملي CaCl 2 * 2H 2 O ، 3.2 ملي MgCl 2 * 6H 2 O ، 10 ملي D - غلوكوز ، 100 U / مل البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل . الستربتوميسين تصفية العقيمة وتخزينها في 10-15 aliquots مل -20 درجة مئوية في إعداد تركيزات المخزون من الانزيمات المستخدمة لتفارق الخليوي في المقطر مزدوجة O 2 H ، معقمة وتصفية المحل في aliquots -20 درجة مئوية : البروتيني العصبية (25 ملغ / مل) ، غراء (10 ملغ / مل) ، DNAseI (10 ملغ / مل) في اليوم من هذه التجربة ، إضافة إلى 15 مل من الانزيمات وسائل الإعلام التفكك بتركيزات النهائية التالية : 1 ملغ / مل البروتيني ، 0.1mg / يمكن الاحتفاظ مل غراء ، 0.1 ملغ / مل تشريح أولا الدناز الحل النهائي التي تحتوي على تركيزات الانزيم على الجليد أثناء عملية التشريح.
- صيانة وسائل الإعلام : متوسطة Dulbecco لتعديل النسر F12 (DMEM/F12) ، 2 مم L - الجلوتامين ، 100 U / مل البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين ، 1X B27 الملحق. يمكن الاحتفاظ به لمدة تصل إلى 3 أشهر في 4 درجات مئوية دون B27 تكملة الشهر وتصل الى واحد في 4 درجات مئوية مع ملحق B27.
- عوامل النمو : تحضير aliquots الأسهم من 0.1 ميكروغرام / مل المؤتلف الإنسان عامل نمو البشرة (hEGF) و 10 ميكروغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية - 2 (FGF - 2) في DMEM/F12 + 0.1 ٪ ألبومين المصل البقري (BSA). المحل في -20 درجة مئوية.
- لتخدير القاتلة C57BL / 6 الجراء الماوس ، يتم حقن الفئران intraperitoneally مع Euthansol يوم بعد الولادة 0-3.
- إزالة بعناية من قبل تشريح أدمغة القياسية وتخزينها في صحن يحتوي على 60 مم الاصطناعي السائل النخاعي (ACSF : 26 مم NaHCO 3 ، 124 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 5 ملي بوكل ، CaCl 2 مم 2 * 2H 2 O ، 1.3 ملي MgCl 2 * 6H 2 O و 10 ملي D - غلوكوز ، 100 U / مل البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين). الرقم الهيدروجيني إلى 7.3 إذا لزم الأمر ومعقمة تصفية aliquots إلى 50 مل ، في مخزن -20 درجة مئوية.
- باستخدام شفرة حلاقة والدماغ عن طريق إزالة كتلة المخيخ والدماغ مع الغراء الغراء Krazy ، منقاري الجانب الأعلى ، الجانب الظهري باتجاهك ، على أن تشاك vibratome. ويستخدم لايكا مايكروسيستمز VT1000S vibratome في هذا البروتوكول.
- تشوك الموقف في vibratome وإضافة ACSF والجليد في المقصورات المناسبة.
- قطع شرائح من 500 ميكرون سمك باستخدام السرعة بين 3،5-4،5 وتواتر 8.5.
- جمع شرائح تحتوي على تشكيل الحصين في الأطباق التي تحتوي على ACSF.
- باستخدام stereomicroscope ، إزالة الحصين بين مم -1.60 -2.40 ملم وbregma (حتى يبدأ في المنطقة CA3 ventrally منحنى) ووضعه في طبق جاف جديد (بدون ACSF). ويستخدم مجهر تشريح MZ6 ايكا في هذا البروتوكول.
- حالما يتم جمع كل الحصين ، اللحم المفروم مع الأنسجة مشرط (حتى يتم التوصل إلى مظهر متجانس ومسالة).
- نقل الأنسجة المفروم لأنبوب البولي بروبلين 15 مل تحتوي على 2.5 مل من وسائل الإعلام التي تحتوي على الأنزيم البروتيني التفكك العصبية ، غراء ، والدناز الأول (راجع الخطوة رقم 1 لإعداد الحل). ملاحظة إذا كان هناك الكثير من الأنسجة المصدر (على سبيل المثال ، في الفترة من 6 الجراء) انها فكرة جيدة لاستخدام 2 قنينة من 2.5 مل تفارق وسائل الاعلام للحفاظ على انزيم الأمثل : نسبة الأنسجة. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45-60 دقيقة مع التناوب. ويستخدم الفرن ProBlot Labnet التهجين 6 (تم شراؤها من خلال العلم مندل) في هذا البروتوكول لتعيين الإعداد تناوب 4.
- إضافة 10 مل من نسيج الثقافة العقيمة فوسفات البوتاسيوم مخزنة المالحة (kPBS : 137 مم كلوريد الصوديوم ، و 2.7 ملي بوكل ، 10 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.4) ، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. يتم استخدام أجهزة الطرد المركزي إيبندورف (نموذج 5702) في هذا البروتوكول.
- تجاهل وطاف بيليه resuspend في 5 مل من kPBS.
- فصل الأنسجة التي سحن خلال ماصة باستور.
- تعليق الطرد المركزي في الخلية 300 x ج لمدة 5 دقائق.
- خلايا Resuspend في 3 مل من المتوسط الصيانة ، باستخدام خلايا العد التريبان الأزرق والخلايا في 60 لوحة أطباق غير ملتصقة ملم (تستخدم الأطباق كورنينج التقيد الترا قليلة ملزمة في هذا البروتوكول ، انظر المواد) في كثافة الخلايا 2.5 × 5 10 / طبق في 5 مل من المتوسط الصيانة. ويمكن استخدام أطباق بتري في مكان أطباق التقيد منخفضة جدا ولكن سيتطلب الثقافات يمكن استغلالها في الصباح وبعد الظهر كل يوم خلال التوسع في أول 6 أيام في المختبر (DIV) لمنع الطلاء والتمايز عفوية.
- إضافة إلى تركيز hEGF النهائية من 20 نانوغرام / مل وFGF - 2 إلى تركيز النهائي من 10 نانوغرام / مل مباشرة بعد الطلاء. إضافة عوامل نمو إضافية كل يومين خلال مرحلة التوسع حتى اليوم في جمع 14 DIV. (أشرطة الفيديو في مقياس من neurospheres توسيع تمثل 100 ميكرون).
** ملاحظة : وسائل الإعلام قد تصبح صفراء حول DIV 10 من مرحلة التوسع. إذا حدث هذا ، إضافة آخر 1 مل ميntenance وسائل الإعلام. إذا كان الاعلام الصفراء مرة أخرى في اليوم التالي ، إضافة آخر 1 مل من وسائل الإعلام الصيانة -- الحفاظ على القيام بذلك عند الاقتضاء خلال مرحلة التوسع الخاص -- تذكر لضبط حجم عوامل النمو وفقا لذلك للحفاظ على تركيزات الصحيح النهائي.
2. المسلسل Cryosectioning
- اضغط برفق لneurospheres قبل التثبيت لضمان فصل المجالين جيدا في وقت التثبيت.
- إضافة الفورمالدهيد الصف الجزيئية مباشرة على ثقافات إلى تركيز النهائي من 3.7 ٪ ويحضن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة مع اهتزاز بطيء. يستخدم راقصة Stovall في هذا البروتوكول لتعيين سرعة دوران 2.5.
- جمع neurospheres في أنبوب البولي بروبلين 15 مل وتدور باستمرار في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
- تجاهل وطاف بيليه resuspend في 10 مل فوسفات الصوديوم مخزنة المالحة (nPBS : 154 مم كلوريد الصوديوم ، و 10 العازلة الفوسفات ملم). لاحظ تغير في استخدام الحل من kPBS لnPBS.
- تدور باستمرار في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
- Resuspend في السكروز 50-10 مل 20 ٪ (W / V) في حل nPBS.
- إبقاء neurospheres عند درجة 4 على الأقل 24 ساعة لcryoprotect الثقافات.
- ملء cryomold الأمثل المتاح مع مجمع القطع (أكتوبر) درجة الحرارة.
- تصب بلطف حل تحتوي على السكروز neurospheres الى الطبق.
- تستخدم لتحديد المجالات stereomicroscope ممثل من مختلف الأحجام مع الأقل دليل على خلل ميكانيكي. عند تنفيذ هذا الإجراء للمرة الأولى ، قد تكون مكسورة بعض الثقافات أو تمزقها. وسيتم الحفاظ على التشكل بشكل جيد مع الممارسة.
- نضح بلطف كل neurosphere يصل الى تلميح ماصة 1 مل (الحفاظ على وحدة التخزين التي تحتوي على السكروز حل لإزالة الحد الأدنى) ووضعه في مجمع أكتوبر العلامة موقعك التقريبي على القالب بحيث يمكنك العثور على المجالات في وقت لاحق.
- ذات مرة كنت قد وضعت لمجالات عدة في cryomold ، فلاش تجميد العينات باستخدام ثاني أكسيد الكربون حتى 2 أكتوبر هو الأبيض.
- علامة الموقع من المجالات الخاصة بك على المكعب والبوب المكعب من العفن
- باستخدام الملقط قبل المبردة ، ومكان المكعب على قطعة من ورق الترشيح المضمون سابقا إلى تشوك مع أكتوبر
- مكان أكثر أكتوبر المجمع حول المكعب وتجميد التمسك كتلة تحتوي على مجالات استخدام ثاني أكسيد الكربون 2. بدلا من ذلك المكان تشوك (مع ورقة فلتر) في ناظم البرد ، بخ أكتوبر مجمع على ورق التصفية ، والمكعب مكان مباشرة في أكتوبر الانتظار حتى أكتوبر بيضاء والثابت. ويستخدم CM1900 ايكا ناظم البرد في هذا البروتوكول.
- مرة واحدة في مجمع أكتوبر تصبح بيضاء ، قد وضع على كتلة تشوك القطع ، ثم الانتظار على الأقل 30 دقيقة لدرجة الحرارة للتوازن.
- قطع التسلسلي 10 ميكرومتر المقاطع يبحثون عن علامات الخاصة بك والتحقق في كثير من الأحيان تحت المجهر لأقسام neurosphere. مكان إلى أقسام كثيرة كما يمكنك على شريحة واحدة. ملاحظة قد لا تكون قادرا على رؤية الشرائح القليلة الأولى من neurosphere الخاص ضمن نطاق ، وجمع حتى يتسنى لجميع المقاطع حتى ترى الخلايا والحفاظ على المقاطع 3-5 قبل البدء وهذا في نهاية المجال الخاص بك. وسيتم أيضا هذه المقاطع الأمامي والخلفي للكيمياء سيتولوجية مناعية يمكن معالجتها. وعند أداء ملون مباين النووية immunostaining هو مفتاح ذلك لأنها سوف تسمح لك لاكتشاف الخلايا واحد في القطبين neurosphere يست بادية للعيان تحت المجهر القياسية المرحلة مقلوب.
- أبواب المحل في -20 درجة مئوية.
3. كيمياء سيتولوجية مناعية
- إزالة الشرائح من -20 درجة مئوية ، وذوبان الجليد من خلال تطبيق nPBS بلطف على جميع أقسام وتفرخ على RT لمدة 5 دقائق.
- نفض الغبار قبالة nPBS الزائدة وتطبق على الفور الأجسام المضادة الأولية مخففة في آب العازلة (0.3 ٪ تريتون X - 100 ، المصل البقري بنسبة 0.3 ٪ في nPBS الزلال ، ودرجة الحموضة 7.2). ستحتاج ~ 100 ميكرولتر لكل شريحة. في هذا البروتوكول ، ونحن في توطين Cx29 ذرية الوطنى المنفصلة الحالية في الثقافة neurosphere 3D.
- قطع مع تغطية parafilm لتغطية الفروع ولكن لا يتجاوز حجم الشريحة المجهر ، حيث سيتم استخلاصها الضد خارج الشريحة بواسطة التناضح إذا parafilm يصل أو يتجاوز عرض الشرائح. سوف parafilm منع التبخر. يحضن بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في غرفة رطبة. الحرص على تعويم parafilm على أقسام وانها لا تسمح للانضمام إلى الشريحة. ومع ذلك ، لا إزالة أو تغيير موضع parafilm يطبق مرة واحدة كما يجب الحرص على عدم تطبيق أي قوة القص على أقسام وبالتالي تعطيل التشكل.
- إضافة ~ 1 nPBS مل مباشرة إلى أقسام وتطفو قبالة parafilm. بدلا من ذلك ، ضع الشريحة مباشرة عموديا في جرة coplin حتى parafilm يطفو بعيدا. لا تقم بإزالة parafilm حتى يطفو بعيدا بشكل مستقل من التلاعب كما كنت قد تعطل بنية هشة neurosphere. بمجرد أن يتم إيقاف parafilm الشريحة ، 5 دقائق في احتضان RT. نفض الغبار قبالة nPBS وتستمر أكثر من 3 في RT يغسل لمدة 5 دقائق.
- تطبيق الضد الثانوية مخففة في العازلة في آب واحتضان RT : 1ساعة في غرفة رطبة كما هو موضح أعلاه. سوف تتطلب من جديد ~ 100 ميكرولتر / الشريحة.
- كرر nPBS يغسل في الخطوة 4. تطبيق ملون مباين النووية في غسل الثالثة 3 (33258 هويشت 0.5 ميكروغرام / مل في nPBS) لمدة 5 دقائق ، والمضي قدما في غسل النهائي لمدة 5 دقائق على RT.
- جبل في وسائل الاعلام الخاصة بك لمكافحة تتلاشى يفضل تركيب وساترة ، وتأمين ساترة مع أول nailpolish في الزوايا ثم في جميع أنحاء حواف لمنع الخسائر (في حالة استخدام الجلسرين وسائل الاعلام).
- الشروع في جمع الصور باستخدام مجهر أو epifluorescent مبائر. في هذا البروتوكول ، ونحن استخدام DMRA2 ايكا ، وكاميرا هاماماتسو أوركا ER ، وOpenLab v3.56 البرمجيات. في هذا المثال ، يتم التقاط الصور على ثلاث قنوات : (1) المرحلة النقيض من ذلك ، (3) الأشعة فوق البنفسجية الزرقاء (لايكا A4 المكعب : تصفية مجموعات تحويلة 360 / 40 ، 400 دي ، SP BP470/40) والأحمر (لايكا Y3 المكعب : تركيبات تصفية تحويلة BP535/50 ، دي 565 ، SP 610 / 75). اطلاق النار على كل مقطع المسلسل إيلاء اهتمام وثيق لأول والأجزاء الأخيرة من خلال تتبع باستخدام أقطاب هويشت 33258 توسيم حيث كشف الحمض النووي للخلايا مرحلة واحدة أمر صعب.
4. المحاذاة
- عندما cryosections هي محمولة على ذوبان الجليد على خطوط المجهر ، فإنها تتحرك وتناوب قليلا جدا. يجب تصحيح هذه الانحرافات. وعلاوة على ذلك ، عندما يتم تصوير المسلسل في كل قسم ، قد قلب كل صورة لا تكون في نفس الموقع على الشاشة. ونتيجة لذلك ، يجب أن يكون لكل قسم إعادة ترتيب تسلسلي رقمية بدقة مع المقطع السابق للحفاظ على مورفولوجيا دقيقة. هذا التوافق يتطلب عناية فائقة ودقيقة لالتهندس الخلوي والتفاصيل الطوبوغرافية.
- يتم حفظ الصور المتسلسلة من كل قناة والحانات مقيم في نطاق 10 و 50 ميكرومتر ميكرومتر (التي أنشئت في مجال البرمجيات v3.56 OpenLab) كملفات TIFF الفردية واستيرادها إلى CS4 فوتوشوب باستخدام حجم قماش مستوى 3300 بكسل 2550 x و قرار من 72 بكسل / بوصة. ويجب اتخاذ الحذر الانتباه إلى حجم قماش في هذا الاستيراد للحفاظ على مقياس دقيق. حجم قماش ، والقرار هي مفتاح النمذجة لاحقة في مايا. وينبغي أن تستخدم شريط النطاق ، كما أنقذ طبقة منفصلة في Photoshop ، للتحقق من أن أي تغيير على الأبعاد XY يحدث أثناء المحاذاة في Photoshop.
- المقبل ، وربط ثلاثة (أو أكثر) طبقات المقابلة لنفس المقطع (أي ربط كل مرحلة والأشعة فوق البنفسجية ، وCy3 سلسلة صورة لكل قسم). هذا يؤكد أنه عندما يتم محاذاة طبقة واحدة ، كما يتم محاذاة الطبقات الأخرى المرتبطة بهذا المقطع في نفس الوقت. بدلا من ذلك ، يمكنك تأمين طبقة المرحلة مرة واحدة في المكان المناسب (أنظر أدناه) ، ثم محاذاة الطبقات المرتبطة بها من هذا الباب إلى طبقة المرحلة.
- لتبدأ ، وجعل جميع طبقات غير مرئية بالنقر على "العين" أيقونة في إطار طبقات.
- بدوره على النقيض من المرحلة الأولى والثانية من الصور المقاطع المسلسل neurosphere على بالنقر على أيقونة "العين" في نافذة الطبقات. زيادة الشفافية في القسم الثاني. تحت علامة التبويب "صورة" فتح "التناوب صورة" واختر "تعسفي". تدوير الجزء الثاني حتى تكون قادرة على تحديد نقاط التواصل بين الهيكلية الهندسية والصور. ومن المفيد مقارنة ذهابا وإيابا مع قناة الأشعة فوق البنفسجية (33258 هويشت المسمى المقاطع).
- تكرار لجميع أقسام التسلسلي لاحقة مقارنة "أقرب الجيران" (أي القسم الأمامي الفوري مع القسم الخلفي فورا) حتى يتم محاذاة بدقة جميع أبواب وقنوات جميع.
- إنشاء طائرة في V10 مايا التي هي من نفس النسب مثل ملف فوتوشوب.
5. تقسيمات الخلية
- من سطر وضع واجهة المستخدم مايا ، تغيير شريط القوائم الافتراضية الخاصة من الرسوم المتحركة لإعداد الأسطح.
- استخدام المجال تقسيم البدائية لخلق خلايا الجسم.
- مع neurosphere المحدد ، يبدأ التلاعب رؤوسه من خلال النقر على زر الفأرة الأيمن على الكائن واختيار من قائمة فيرتكس تمييز. بمزيد من التفصيل على سطح الكرة عن طريق تغيير مستوى العرض من قائمة العلامات.
- من تقسيم السطوح التبويب من القائمة الرئيسية ، فتح مربع خيارات طي التسلسل الهرمي وتعيين عدد من المستويات إلى 2. انهيار المجال.
- تغيير شريط القوائم من السطوح إلى المضلعات.
- مع المجال المحدد ، فتح أداة الهندسة سكولبت من علامة التبويب شبكة من القائمة الرئيسية.
- صقل سطح الخلية إلى شكلها النهائي توظيف مجموعة أدوات الهندسة سكولبت من أداة التبويب إعدادات.
- كرر هذه العملية لإنشاء هيئات مختلفة من الخلايا لمحاكاة مجموعة متنوعة من الشخصيات ومجلس الشعب الحالي في neurosphere ذرية. في هذه المظاهرة ، وعشر هيئات مختلفة من الخلايا تشكل أساسا لneurosphere.
- حدد التصنيف الخلية وتجميد التحويلات.
- مع خلايا المنشأ التصنيف الخاص ، وسيتم تصميمه تظليل السطح بين سنتين وتمثل كل من الخلايا معربا عنالبروتين من الفوائد (في مثالنا Cx29 إيجابية الخلايا) والخلايا حيث البروتين هو غائب. هنا ، يتم تعيين أي خلية مع Cx29 تفاعلية مناعية Cx29 إيجابية. في هذا المثال ، ليس على غرار توطين التحت خلوية على الرغم من هذا التحليل هو ممكن مع تعديلات على تظليل.
- فتح نافذة Hypershade من علامة التبويب> شبابيك التقديم المحررين من القائمة الرئيسية.
- اختيار شادر المنحدر من سطح المواد التبويب.
- فتح محرر سمة وتعيين لون تظليل ، الإنارة ، لون المحيط ، خريطة نتوء ، وسمات منظاري اللون.
- تعيين البراونية 3D الملمس إلى عقدة اللون والملمس المحيطة 2D فركتل إلى عقدة اهتززت الخرائط.
- حدد الإدخال شادرس الناتجة اتصالات وإخراج وتصدير الشبكة المحدد.
- حدد التصنيف الخلية وفتح مربع خيارات تصدير التحديد.
- اختيار نوع الملف mayaAscii وإلغاء تحديد مربع تضمين هذه المدخلات. تصدير التحديد.
6. الخلية رسم الخرائط
- فتح ملف محاذاة المقاطع في المسلسل CS4 فوتوشوب.
- إنشاء مفتاح من السكتات الدماغية رصاص للاحتفال مواقع كل خلية السلف في الفروع التسلسلي. في هذه المظاهرة ، وهو مفتاح لثلاث ضربات -- سوف تستخدم لبيان ما إذا كانت توجد خلية في واحد أو اثنين أو ثلاثة أقسام -- ساحة الصلبة ، مربع مع خط متقطع ، ومربع مع الصليب. ويعرف هذا المفتاح مزيد من السكتات الدماغية عن طريق اللون -- في هذا المثال ، تمثل الخلايا الحمراء معربا عن البروتين لدينا مصلحة ، Cx29 ، والأبيض يمثل التعبير عن الخلايا لا Cx29.
- بدوره على طبقة وتبدأ المرحلة بمناسبة وسط كل خلية السلف مع السكتة الدماغية قلم رصاص الأبيض. استخدام طبقة منفصلة داخل مجلد المقطع الذي لبناء الخرائط الخاصة بك.
- تبديل بين الأقسام لتحديد موقع الخلايا ضمان أن يتم الرمز بشكل صحيح الخلايا على أكثر من مقطع واحد.
- مع طبقة Cx29 قيد التشغيل ، حدد الخلايا التي تقع في المناطق حيث يتم التعبير عن Cx29 إيجابيا.
- اختر الأمر التعبئة من علامة التبويب تحرير من شريط القائمة الرئيسية للفوتوشوب وتغيير ضربات الأبيض إلى الأحمر.
- مع استكمال الخرائط وحفظ كل قسم على هيئة صورة JPEG في مجلد منفصل sourceimages المشروع مايا. للقيام بذلك ، فإن المشروع الجديد مايا أولا أن يتم إنشاؤه.
7. استيراد وتركيب خرائط في 3D
- من سطر وضع واجهة المستخدم مايا ، تغيير شريط القوائم الافتراضية الخاصة من الرسوم المتحركة لإعداد المضلعات.
- استيراد الملفات وplanes.mb scaleBar.mb من المجلد المشاهد المشاريع.
- مع الطائرة المختارة ، تعيين تظليل لامبرت من خلال النقر على زر الفأرة الأيمن على الكائن وفتح تعيين التبويب والمواد الجديدة.
- في محرر سمة فوق مربع متقلب للحق السمة لون المواد.
- من القائمة المنبثقة ، اختر ملف من المقطع القوام 2D.
- تحت القسم في ملف سمات محرر سمة ، انقر فوق رمز الملف على يمين صورة السمة الاسم.
- اختر القسم الاول من المجلد sourceimages.
- التبديل الكاميرا من إطار مساحة العمل من عرض وجهة نظر إلى الأعلى العرض الافتراضي الهجائي عن طريق فتح علامة التبويب لوحات.
- حدد أداة المضلع إنشاء شبكة من علامة التبويب من القائمة الرئيسية ، وتتبع الخطوط العريضة لهذا الباب.
- اختيار أول خريطة من المجلد sourceimages وإسناد ذلك إلى الطائرة المضلع التي أنشئت حديثا في أعقاب الخطوات التي أنشئت لإنشاء الطائرة المضلع.
- مع الكائن المحدد ، اختر من القائمة فوق البنفسجية تمييز من خلال النقر على زر الفأرة الأيمن على متن الطائرة.
- حدد كافة الطائرات فوق البنفسجية النقاط وفتح محرر الملمس الأشعة فوق البنفسجية من علامة التبويب Windows من القائمة الرئيسية.
- مقياس نسبيا من الأشعة فوق البنفسجية لتناسب الطائرة المقطع.
- كرر هذه العملية لكل قسم من neurosphere ضمان أن المسافات بين كل مقطع تتوافق مع ارتفاع شريط واسع.
8. تحديد موقع الخلية دراسات الرموز السلف في 3D
- من سطر وضع واجهة المستخدم مايا ، تغيير شريط القوائم من الرسوم المتحركة الافتراضية الخاصة به الإعداد لحيوية.
- ولم يبق منه سوى الجزء الأول من neurosphere مرئية ، إخفاء كل أقسام أخرى من خلال تغيير إعدادات العرض من علامة التبويب عرض من القائمة الرئيسية.
- مع أداة منحنى السيرة الذاتية مربع الخيارات مفتوحة ، حدد 1 الخطي من إعدادات المنحنى السيرة الذاتية.
- عرض مشهد من الكاميرا عرض أعلى ، تبدأ توزيع النقاط على الخرائط الخلية خلق منحنى واحد للخلايا Cx29 سلبية واحدة للخلايا Cx29 إيجابية.
- المنحنيات المسطحة الناتجة عن ذلك عند عرضها من الكاميرا الجانبية الرأي. تحديد سماكة المقاطع من خلال تحويل نقاط المنحنى في المحور ص باستخدام شريط مقياس المستوردة من الصور المجهرية كدليل.
- كرر هذه العملية لكل قسم من neurosphere.
- استيراد الملف من المجلد cellTyoplogy.ma مشاهد من المشروع وتكرار تصنيف الخلايا لخلايا كل Cx29 سلبية وإيجابية Cx29 داخل neurosphere.
- فتح نافذة Hypershade من علامة التبويب> شبابيك التقديم المحررين من القائمة الرئيسية.
- استيراد شادرس بنيت قبل تكليفهم إلى خلايا للتصنيف.
- من نافذة Outliner ، إزالة اسم الملف من البداية من الكائنات المستوردة. هذا وسوف تصبح مهمة في مراحل لاحقة من عملية النمذجة.
- حدد علامة التبويب الجسيمات من القائمة الرئيسية ، وخلق لانبعاثات الجسيمات منحنى السيرة الذاتية أولا.
- فتح علامة التبويب particleShape1 وتحت سمات الانبعاثات تغيير عدد من ماكس -1 إلى عدد من النقاط على المنحنى الخاص بك أولا.
- في التبويب سمات تجعل تغيير نوع تجعل الجسيمات إلى السطح تضع ، (S / W). انقر على مربع تجعل نوع الحالية دون تغيير ، والشعاع من الجسيمات 0.010.
- إرفاق الجسيمات إلى القمم المنحنى عن طريق اختيار أولا ثم تحديد جزيئات تحول المنحنى. فتح الخيارات الهدف من داخل الجسيمات التبويب من القائمة الرئيسية وتعيين وزن الهدف إلى 1. انقر فوق إنشاء.
- حدد الخلايا من رقم 1 إلى 10 في النظام في إطار Outliner وفتح Instancer (استبدال) خيارات مربع من الجسيمات التبويب من القائمة الرئيسية. في مربع مثيل كائنات يجب أن يتم سرد كافة الخلايا عشرة في الترتيب.
- اختيار الاسم الصحيح particleShape من القائمة المنسدلة كائن من الجسيمات إلى علامة التبويب مثيل. انقر فوق إنشاء.
- افتراضيا ، لن يؤدي إلا إلى الخلية الأولى التي تم تحديدها استبدال الجسيمات على طول المنحنى. من أجل الحصول على جميع أنواع عشرة لدورة وتظهر بشكل عشوائي بين الجسيمات ، وهناك حاجة إلى التعبير. التعبير الثاني سوف يضمن أن الخلايا ينبعث بشكل عشوائي في الطريق نفسه في كل مرة يتم تعديل أوضاعها والمتزلج نطاق.
- مع باعث المحدد ، فتح محرر السمة. في التبويب particleShape ، في إطار ديناميكي إضافة سمة انقر على مربع العامة. الكتابة تحت اسم طويل random_index. في التبديل سمة من نوع عددي إلى الجسيمات الواحدة (مجموعة) وضرب إضافة.
- في الجسيمات الواحدة (صفيف) سمات التبويب ، تمت إضافة مربع random_index. بالنقر على زر الفأرة الأيمن فوق مساحة فارغة ، حدد إنشاء التعبير... من القائمة المنسدلة مربع.
- اكتب النص في التعبير : مربع -- particleShape1.random_index = راند (10) ، وإذا كان (particleShape1.particleId == 1) البذور (1) ؛
- لإكمال التعبير فتح Instancer (استبدال الهندسة) في التبويب محرر سمة والعامة في كائن> خيارات random_index حدد الفهرس من القائمة المنسدلة. جلب شريط تمرير الوقت إلى الإطار الأول وضرب اللعب ، هي الآن أنواع الخلايا الموزعة عشوائيا بين الجسيمات.
- كرر هذه العملية لكل قسم من neurosphere. ضمان متمايزة كل مؤشر باعث جديدة ، instancer ، والعشوائية بالاسم والمنظمة على النحو المناسب في إطار Outliner.
9. تقديم / التركيب
- في التقديم عن طريق قسم من نافذة إعدادات التحميل ، تغيير العارض من البرامج لمايا راي العقلية.
- فتح علامة الجودة وتحت Raytracing تأملات تغيير الإعداد إلى الصفر. فتح علامة التبويب وتغيير Framebuffer Colorclip من Premultiply الخام ألفا وازل.
- فتح قناة مربع / محرر طبقة وتغيير وضع طبقة من محرر لتقديم العرض.
- حدد الخلايا المستوردة للتصنيف وانقر فوق إنشاء طبقة جديدة وتعيين رمز الكائنات المحددة.
- إعادة تسمية انسداد المحيطة طبقة.
- بالنقر على زر الفأرة الأيمن فوق طبقة التي أنشئت حديثا ، حدد سمات من القائمة.
- إلى يمين مربع renderLayer ، انقر على زر المسبقة وحدد انسداد من القائمة المنسدلة.
- حدد علامة التبويب وتغيير mib_amb_occlusion1 عينات 16-256.
- إعادة فتح قناة مربع / طبقة محرر وتحت علامة التبويب خيارات ، فتح مربع الخيارات تقديم كل الطبقات.
- حدد المجمع والحفاظ على الطبقات.
- مع طبقة مختارة ambientOcclusion ، تغييره من عادي إلى ضرب من القائمة المنسدلة مربع قائمة فقط فوق طبقة.
- تقديم مرورين من neurosphere ، مرة واحدة مع طبقة ambientOcclusion تشغيل ومرة واحدة مع masterLayer قيد التشغيل. حفظ الصور والملفات IFF في مجلد الصور المشاريع.
- فتح كل الصور في فوتوشوب CS4. وضع طبقة ambientOcclusion على رأس masterLayer وتعيينه إلى ضرب. إنشاء خلفية وتتسطح الصورة.
Discussion
يصف هذا البروتوكول إجراء للثقافة ومتسلسل cryosection بعد الولادة الشخصيات الحصين وتوطين التعبير بواسطة بروتين مناعي ، وأخيرا إعادة بناء وتحليل الموقف الطوبوغرافية للخلايا داخل immunopositive neurosphere في 3D بأكمله. عن طريق الجمع بين الخلية والبيولوجيا ثقافة تقنيات المعالجة ، والتصوير المجهري (OpenLab ، الإرتجال وغيرها من برامج تحليل الصور) ، أو رسم برامج تحرير قدرات (أدوبي فوتوشوب) ، والرسوم المتحركة وقدرات 3D compositing البرمجيات (أوتوديسك مايا) ، ونحن تقديم منهجية لإعادة بناء الخليوي تكوين الثقافات كلها من الصور 3D 2D المسلسل السماح لاعادة اعمار لموقف المؤمنين الخلوية وبروتين تعبير في جميع أنحاء ثقافة neurosphere. ويمكن الجمع بين هذا البروتوكول مع فعالية مساوية للتسجيل وإعادة بناء أجزاء المسلسل epifluorescent رقيقة أو مبائر مداخن Z - سمكا من خلال المقاطع التسلسلي. لأن التوسع النسيلي من الشخصيات واحد في الثقافة neurosphere يلخص العديد من مراحل لوحظ على مدى تكوين الخلايا العصبية وgliogenesis في مرحلة ما بعد الولادة في الدماغ ، وتأثير هيكلها 3D يمثل مصير مجلس الشعب محددا هاما في ذرية يتعرضون لنفس الوسط التجريبية 1. الاختلاف في نسب البروتين والتعبير في القلب والمحيط الخارجي للأقسام neurosphere المسلسل يوحي بأن العوامل المادية متعددة بما في ذلك موقف الخلية ، والإجهاد الميكانيكية ، وقوة القص تلعب أدوارا هامة في تنظيم المجلس الوطنى البيولوجيا 2. علاوة على ذلك ، وقد تبين connexin تعبير البروتين ، وتحليلها هنا ، لتغيير تبعا عند المثقف والشخصيات neurospheres 3D في تعليق أو مطلية على ركيزة laminin الاتصالات مع connexin بوساطة تغيير وظيفي سواء مثقف الخلايا على البلاستيك وركيزة أو في 3D مجانا العائمة الثقافات 3. أثر موقف الخليوي في مصير المجلس الوطنى لا يزال غير واضح. فمن الصعب فنيا لتحليل تأثير الموقع المكاني داخل الثقافة 3D على الأحياء نظرا إلى أن المجلس الوطنى لتقييم مستضدي الانساب والبروتينات يتطلب إشارات اختلال البنية 3D لتمكين permeabilization الخلية والوصول إلى جميع خلايا الجسم المضاد. هنا ، وتبين لنا أن منهجية التصور الهجين يوفر وسيلة لتحديد ما إذا كان يحمل بروتينات معينة تعريب الموضعية فريدة من نوعها في الثقافة 3D ، يمكن استخدامها لاستنتاج واختبار وظيفة البروتين والتنظيم فيما يتعلق توطين الإقليمية داخل neurosphere ، وربما الأهم من ذلك ويوفر البيانات اللازمة لالموضعية دراسة تأثير التضاريس وتحديد المواقع 3D الخليوي في مجلس الشعب في مصير الثقافة 3D.
Disclosures
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها جامعة أوتاوا جنة رعاية الحيوان والمجلس الكندي للرعاية الحيوان.
Acknowledgments
نشكر ايفان دسرت] ومارك ليونارد للحصول على المساعدة من الخبراء التقنيين في مجال إنتاج الفيديو وتحريرها ، ومات كوك للحصول على المساعدة في جمع البيانات ، وسارة Gelbard للمساعدة التحرير الخبراء. وقد تم تمويل العمل من المنح التي تعمل من المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR ، MOP 62626) لSALB ، وهي مبادرة للتدريب في مجال البحوث الاستراتيجية الصحية لبرنامج المنح وSALB SF (CIHR برنامج التدريب في Lipidomics الاعصاب ، TGF 9121) ، والبنية التحتية بدعم من مؤسسة الابتكار وأونتاريو الكندية الاستئماني الابتكار لسادس. تلقت منحة دراسية عليا SI أونتاريو في مجال العلوم والتكنولوجيا بمساهمات من اتحاد البحوث باركنسون. NV يتلقى معهد الشيخوخة وCIHR برنامج التدريب في Lipidomics الاعصاب بعد الزمالة المهنية. نحن نعترف بامتنان دعم البرامج التعليمية والتقنية التي تقدمها أبحاث أوتوديسك.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthansol | Reagent | Merck & Co. | ||
| Krazy Glue | Reagent | Home Hardware | ||
| VT1000S vibratome | Equipment | Leica Microsystems | ||
| Neural protease | Reagent | Sigma-Aldrich | P6141 | Stock solutions stored at -20°C |
| Papain | Reagent | Sigma-Aldrich | P4762 | Stock solutions stored at -20°C |
| DNAse I | Reagent | Roche Group | 11 284 932 001 | Stock solutions stored at -20°C |
| MZ6 Dissecting Microscope | Equipment | Leica Microsystems | ||
| ProBlot 6 Hybridization Oven | Equipment | Labnet International | ||
| Centrifuge 5702 | Equipment | Eppendorf | ||
| kPBS | Reagent | BioShop Canada | PBS404 | |
| B27 Supplement | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
| Ultra Low Binding Tissue Culture Dishes | Disposable | Corning | 3261 | |
| Human Epidermal growth Factor | Reagent | Invitrogen | 13247-051 | Stock solutions stored at -20°C |
| Fibroblast growth factor-2 | Reagent | Invitrogen | 13256-029 | Also known as basic fibroblast growth factor (bFGF) Stock solutions stored at -20°C |
| 37% formaldehyde (molecular grade) | Reagent | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Belly Dancer Shaker | Equipment | Stovall Life Sciences, IBI Sciences | ||
| Tissue- Tek Cryomold | Disposable | Sakura Finetek | 4566 | |
| Tissue-Tek OCT compound | Reagent | Sakura Finetek | 4583 | |
| Whatman Grade 703 Blotting Paper | Disposable | VWR international | 28298-020 | |
| CM1900 Cryostat | Equipment | Leica Microsystems | ||
| Polyclonal Anti-Cx29 Primary Antibody | Reagent | Kindly provided by Dr David Paul, Harvard Medical School | Stored 1:1 in glycerol at -20°C | |
| Cy3-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | Stored 1:1 in glycerol at -20°C | |
| H–chst 33258 | Reagent | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| DMRA2 epiflourescent microscope, Orca ER camera, OpenLab v3.56 | Equipment/ Software | Leica Microsystems | This protocol can be performed with any epifluorescent or confocal microscope. | |
| Photoshop CS4 | Software | Adobe | Graphic software | |
| Maya v10 | Software | Autodesk | Modeling software | |
| Computer | Equipment | Intel | Processor: Intel Corei7 920, Memory:12GB DDR3 Video card: Nvidia GTX 285 (1GB RAM) |
|
* All other standard chemical reagents listed in the protocol are from Sigma-Aldrich. All other standard tissue culture reagents are from Invitrogen. |
||||
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
- Campos, L. S. Neurospheres: insights into neural stem cell biology. J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).
- Imbeault, S. The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells. BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).
