Proteine ​​localizzazione in 3D Cultura cellule staminali neurali: una metodologia di visualizzazione ibrida

Summary

Qui, descriviamo come produrre, espandere e immunolabel postnatale cellule dell'ippocampo progenitrici neurali (NPC) in tre dimensioni (3D) della cultura. Successivamente, utilizzando le tecnologie di visualizzazione ibrida, che dimostrano come le immagini digitali di criosezioni immunolabelled può essere usata per ricostruire e mappare la posizione spaziale delle cellule immunopositive tutto il neurosfere 3D intero.

Abstract

L'importanza delle 3 dimensioni (3D) topografia nell'influenzare staminali neurali e cellule progenitrici (NPC) fenotipo è ampiamente riconosciuto ancora difficile da studiare. Quando dissociato dal cervello embrionale o post-natale, NPC singolo proliferare in sospensione per formare neurosfere. Cellule figlie all'interno di queste culture spontaneamente adottare distinte linee di sviluppo (neuroni, oligodendrociti ed astrociti) nel corso di espansione, pur essendo esposti alla stesso ambiente extracellulare. Questa progressione ricapitola molte delle fasi osservate nel corso della neurogenesi e gliogenesis in post-natale del cervello ed è spesso usato per studiare la biologia di base NPC in un ambiente controllato. Valutare l'impatto della topografia 3D e posizionamento cellulari all'interno di queste culture, sul destino NPC, tuttavia, è difficile. Di localizzare ed identificare proteine ​​bersaglio lignaggi NPC mediante immunocitochimica, libero di fluttuare neurosfere deve essere placcato su un substrato o sezionato in serie. Questa elaborazione è necessaria per garantire permeabilizzazione equivalente cellulare e accedere anticorpi per tutta la sfera. Come risultato, le immagini 2D epifluorescente di criosezioni confocale o ricostruzioni 3D di Z-stack può fornire solo informazioni spaziali sulla posizione di celle all'interno di discrete fette fisica o digitale 3D e non visualizzare la posizione cellulare nella sfera intatta. Qui, per ribadire la topografia della cultura neurosfere e permettere analisi spaziale di espressione della proteina durante l'intera cultura, vi presentiamo un protocollo per l'isolamento, espansione e sezionamento seriale di neurosfere dell'ippocampo post-natale adatto per immunolocalizzazione epifluorescente confocale o delle proteine ​​bersaglio. Connexin29 (Cx29) è analizzato come un esempio. Successivamente, utilizzando un ibrido di editing grafico e di modellazione 3D software applicati rigorosamente per mantenere dettaglio biologico, ci descrivono come rimontare il posizionamento 3D strutturale di queste immagini e la mappa digitale cellule marcate all'interno della neurosfere completo. Questa metodologia permette la visualizzazione e l'analisi della posizione del cellulare di proteine ​​bersaglio e cellule in tutta la topografia intera cultura 3D e faciliterà un'analisi più dettagliata delle relazioni spaziali tra le cellule nel corso della neurogenesi e gliogenesis in vitro.

Sia Imbeault e Valenzuela contribuito in maniera uguale e dovrebbe essere considerato comune primi autori.

Protocol

1. Isolamento di cellule progenitrici neurali

Mantenere i tessuti e le soluzioni a freddo in ogni momento durante il protocollo di isolamento!

1. Prima di iniziare la vostra cultura, preparare le soluzioni stock seguenti:
   • Dissociazione dei media (26 mM NaHCO _3, 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,1 mM CaCl ₂ * 2H ₂ O, 3,2 mM MgCl ₂ * 6H ₂ O, 10 mM D-glucosio, 100 U / mL di penicillina, 100 mg / ml . streptomicina filtro sterile e conservare in aliquote di 10-15 ml a -20 ° C. Preparate le concentrazioni stock di enzimi utilizzati per cellulari dissociazione in bidistillata H ₂ O, filtro sterile e aliquote conservare a -20 ° C: proteasi neurali (25 mg . / mL), la papaina (10 mg / mL), DNAseI (10 mg / mL) Il giorno dell'esperimento, aggiungere gli enzimi a 15 mL di dissociazione Media presso le seguenti concentrazioni finali: 1 mg / mL proteasi, 0.1mg / mL papaina, 0,1 mg / ml soluzione Dissection DNAsi I. contenenti concentrazioni di enzima finale può essere mantenuto in ghiaccio durante il processo di dissezione.
   • Manutenzione media: media Dulbecco modificato Eagle F12 (DMEM/F12), 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml streptomicina, 1X B27 supplemento. Può essere mantenuta per un massimo di 3 mesi a 4 ° C senza supplemento B27 e fino a un mese a 4 ° C con B27 supplemento.
   • Fattori di crescita: Preparare aliquote stock di 0,1 mg / ml fattore umano ricombinante di crescita epidermico (hEGF) e 10 mg / ml di crescita dei fibroblasti fattore-2 (FGF-2) in DMEM/F12 + 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA). Conservare a -20 ° C.
2. Per anestetizzare letale C57BL / 6 cuccioli di topo, i topi vengono iniettati per via intraperitoneale con Euthansol il giorno dopo la nascita 0-3.
3. Rimuovere con attenzione il cervello da dissezione standard e conservare in un piatto contenente 60 millimetri artificiale liquido cerebrospinale (ACSF: 26 mM NaHCO _3, 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl ₂ * 2H ₂ O, 1,3 mM MgCl ₂ * 6H ₂ O , 10 mM D-glucosio, 100 U / mL di penicillina, 100 mg / ml streptomicina). pH a 7,3, se necessario, filtrare e sterile in aliquote di 50 mL, conservare a -20 ° C.
4. Utilizzando una lama di rasoio, il cervello blocco togliendo il cervelletto e al cervello colla con Krazy Glue, lato rostrale alto, dorso rivolto verso l'alto, verso il mandrino vibratome. Una Leica Microsystems VT1000S vibratome viene utilizzato in questo protocollo.
5. Chuck posizione nel vibratome e aggiungere ACSF e ghiaccio negli scompartimenti corretta.
6. Tagliare le fette di 500 micron spessore con una velocità tra 3,5-4,5 e la frequenza di 8,5.
7. Raccolta di sezioni contenenti la formazione dell'ippocampo in piatti contenenti ACSF.
8. Utilizzando uno stereomicroscopio, rimuovere ippocampi tra bregma -1,60 mm e -2,40 mm (fino a quando la regione CA3 inizia a curva ventrale) e porre in un piatto nuovo a secco (senza ACSF). Una Leica MZ6 microscopio da dissezione viene utilizzato in questo protocollo.
9. Una volta che tutti dell'ippocampo sono raccolti, tritare il tessuto con un bisturi (fino ad un aspetto omogeneo e liquefatto è ottenuta).
10. Trasferimento di tessuto macinata un tubo di polipropilene da 15 ml contenente 2,5 ml di mezzi di dissociazione contenenti proteasi neurali, la papaina, e DNAsi I (vedi punto # 1 per la preparazione della soluzione). Nota se c'è un sacco di tessuto di origine (ad esempio, da 6 cuccioli) è una buona idea quella di usare 2 flaconcini da 2,5 ml dissociazione enzimatica mezzi per mantenere ottimale: rapporto di tessuto. Incubare a 37 ° C per 45-60 min con rotazione. Un Labnet ProBlot 6 fornetto (acquistati attraverso Mandel scientifico) viene utilizzata in questo protocollo impostato impostazione della rotazione 4.
11. Aggiungere 10 ml di sterili fosfato di potassio coltura tissutale salina tamponata (kpbs: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, tampone fosfato 10 mM, pH 7,4) e centrifugare a 300 xg per 5 min. Una centrifuga Eppendorf (modello 5702) è utilizzato in questo protocollo.
12. Gettare il surnatante e risospendere pellet in 5 ml di kpbs.
13. Dissociarsi da triturazione dei tessuti attraverso una pipetta Pasteur.
14. Centrifugare sospensione cellulare a 300 xg per 5 min.
15. Risospendere le cellule in 3 ml di terreno di mantenimento, le cellule contare utilizzando Tricloroetano e cellule piastra in 60 mm non aderente piatti (Corning Ultra-Low piatti aderenza vincolanti sono utilizzati in questo protocollo, vedere Materiali) ad una densità di 2,5 x 10 ⁵ cellule / piatto in 5 ml di terreno di mantenimento. Piastre di Petri possono essere utilizzati al posto di Ultra-Low piatti aderenza ma le culture richiede di essere sfruttati di mattina e pomeriggio tutti i giorni durante l'espansione per i primi 6 giorni in vitro (DIV) per evitare placcatura e differenziazione spontanea.
16. Aggiungi hEGF a una concentrazione finale di 20 ng / mL e FGF-2 per una concentrazione finale di 10 ng / ml subito dopo la placcatura. Aggiungere ulteriori fattori di crescita ogni due giorni durante la fase di espansione fino al giorno di raccolta sulla DIV 14. (Bar Scala in video di neurosfere espansione rappresentano 100 micron).

** Nota: i media possono diventare giallo attorno DIV 10 della fase di espansione. In questo caso, aggiungere un altro mL 1 ° maggiontenance media. Se il supporto è di nuovo giallo il giorno successivo, aggiungere un altro 1 mL di mezzi di manutenzione - continuare a fare questo se necessario durante la fase di espansione - ricordati di regolare il volume di fattori di crescita al fine di mantenere la concentrazione giusta finale.

2. Criosezionamento seriale

1. Toccare neurosfere delicatamente prima di fissaggio per assicurare sfere sono ben separati al momento della fissazione.
2. Aggiungi molecolare formaldeide grado direttamente alle culture ad una concentrazione finale del 3,7% e incubare a temperatura ambiente (RT) per 20 minuti con agitazione lenta. Una danzatrice del ventre Stovall è usato in questo protocollo impostato su una velocità di rotazione di 2,5.
3. Raccogliere neurosfere in un tubo di polipropilene da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 5 min.
4. Gettare il surnatante e risospendere pellet in 10 ml di fosfato di sodio soluzione salina tamponata (nPBS: 154 mM NaCl, tampone fosfato 10 mM). Notare il cambiamento nell'uso soluzione da kbps a nPBS.
5. Spin down a 300 xg per 5 min.
6. Risospendere in 5-10 ml di saccarosio al 20% (w / v) in nPBS.
7. Tenere neurosfere a 4 ° C per almeno 24 h per cryoprotect culture.
8. Riempire un cryomold usa e getta con temperatura ottimale di taglio (OCT) Compound.
9. Delicatamente versare la soluzione di saccarosio contenente neurosfere in un piatto.
10. Utilizzare uno stereomicroscopio per individuare ambiti rappresentativi di varie dimensioni con la minima evidenza di rottura meccanica. Quando si esegue questa procedura per la prima volta, alcune culture possono essere rotti o strappati. Morfologia sarà ben mantenuto con la pratica.
11. Aspirare delicatamente ogni neurosfere in su in un mL 1 pipetta punta (mantenere il volume di saccarosio contenente soluzione rimosso al minimo) e metterla nel composto ottobre Segna la posizione approssimativa sullo stampo in modo da poter trovare le sfere più tardi.
12. Una volta che hai messo un paio di sfere in cryomold, flash-congelare i campioni utilizzando CO ₂ fino ad ottobre è bianco.
13. Contrassegnare la posizione del vostro sfere sul cubo e il cubo pop dallo stampo
14. Utilizzando pre-raffreddata pinze, posizionare il cubo su un foglio di carta da filtro in precedenza fissato a un mandrino con ottobre
15. Luogo più composto ottobre in tutto il cubo e congelamento di aderire al blocco contenente le sfere con CO _2. In alternativa, posizionare il mandrino (con carta da filtro) nel criostato, squirt composto ottobre su carta da filtro, e il cubo posto direttamente in ottobre Attendere fino a ottobre è bianco e duro. Una Leica CM1900 criostato viene utilizzato in questo protocollo.
16. Una volta che il composto diventa bianco ottobre, è possibile posizionare il mandrino sul blocco di taglio, quindi attendere almeno 30 minuti per la temperatura si stabilizzi.
17. Taglio di serie 10 sezioni micron guardando fuori per il tuo marchi e controllando spesso sotto un microscopio per le sezioni neurosfere. Posto come molte sezioni, come si può su una diapositiva. Nota non sarai in grado di vedere le fette primi del neurosfere nell'ambito di applicazione, in modo da raccogliere tutte le sezioni fino a vedere le cellule e mantenere i 3-5 sezioni prima di questo inizio e alla fine della vostra sfera. Queste sezioni anteriore e posteriore saranno trattati anche per immunocitochimica. Un contrasto nucleare durante l'esecuzione di immunoistochimica è dunque fondamentale in quanto consentirà di individuare le singole cellule ai poli neurosfere non immediatamente evidente sotto un microscopio a fase invertita.
18. Sezioni conservare a -20 ° C.

3. Immunocitochimica

1. Togliere i vetrini da -20 ° C e disgelo applicando nPBS delicatamente sopra tutte le sezioni e incubazione a temperatura ambiente per 5 min.
2. Flick off nPBS eccesso e applicare immediatamente l'anticorpo primario diluito in Ab tampone (0,3% Triton X-100, 0,3% di siero albumina bovina in nPBS, pH 7,2). Avrete bisogno di ~ 100 l per vetrino. In questo protocollo, abbiamo localizzare Cx29 in progenie NPC discreto presenti nella cultura neurosfere 3D.
3. Coprire con parafilm tagliate per coprire le sezioni, ma non superare la dimensione del vetrino da microscopio, come gli anticorpi saranno disegnate dal vetrino per osmosi se il parafilm raggiunge o supera la larghezza della diapositiva. Il parafilm impedisce l'evaporazione. Incubare per una notte a 4 ° C in camera umida. Fare attenzione a galleggiare sopra il parafilm le sezioni e non consentono di aderire alla diapositiva. Tuttavia, non rimuovere o alterare la posizione parafilm una volta applicato, come bisogna fare attenzione a non applicare alcuna forza di taglio delle sezioni e quindi interrompere morfologia.
4. Aggiungi ~ 1 nPBS mL direttamente alle sezioni e galleggiano al largo della parafilm. In alternativa, inserire il vetrino in verticale direttamente in una vaschetta Coplin fino a quando il parafilm galleggia lontano. Non rimuovere il parafilm fino a quando non galleggia lontano indipendente di manipolazione, come si può distruggere la struttura fragile neurosfere. Una volta che il parafilm è spenta la diapositiva, incubare 5 minuti a temperatura ambiente. Flick off nPBS e continuare con 3 lavaggi più a temperatura ambiente per 5 min.
5. Applicare l'anticorpo secondario diluito in Ab tampone e incubare a RT per 1h in una camera umida come descritto sopra. Sarete di nuovo bisogno di ~ 100 l / diapositive.
6. Ripetere lava nPBS al punto 4. Applicare un contrasto nucleare nel 3 ^° lavaggio (Hoechst 33258 0,5 mg / ml in nPBS) per 5 minuti e procedere con il lavaggio finale per 5 minuti a temperatura ambiente.
7. Montare nel vostro preferito mezzi di montaggio anti-sbiadimento e coprioggetti, garantire il coprioggetto con il primo nailpolish negli angoli poi tutto intorno i bordi per evitare la perdita (se si utilizza una a base di glicerolo media).
8. Procedere alla raccolta di immagini utilizzando un microscopio confocale o epifluorescente. In questo protocollo, utilizziamo una DMRA2 Leica, una macchina fotografica Hamamatsu Orca ER, e OpenLab v3.56 software. In questo esempio, le immagini vengono catturate su tre canali: (1) contrasto di fase, (3) Blu UV (Leica A4 cubo: Filtro combinazioni Ex 360/40, Di 400, Sp BP470/40) e Rosso (Leica Y3 cubo : combinazioni di filtro Ex BP535/50, Di 565, Sp 610 / 75). Spara ogni sezione seriale prestando particolare attenzione alla prima e le sezioni ultima tenendo traccia dei pali con Hoechst 33258 etichettatura di DNA in cui la rilevazione fase di singole cellule è difficile.

4. Allineamento

1. Quando il disgelo criosezioni sono montati sulle linee di microscopio, saranno spostare e ruotare leggermente. Questi scostamenti devono essere corrette. Inoltre, quando ogni sezione seriale è ripreso, il centro di ogni immagine non può essere nella stessa posizione sullo schermo. Come risultato, ogni sezione digitalizzato seriale deve essere attentamente riallineata con la sezione precedente per preservare la morfologia precisa. Questo allineamento richiede un'attenzione attenta e precisa di citoarchitettura e dettagli topografici.
2. Immagini di serie di ciascun canale e bar scala residente di 10 micron e 50 micron (fondata nel OpenLab v3.56 software) vengono salvati come singoli file TIFF e importati in Photoshop CS4 utilizzando un formato standard tela di 3300 x 2550 pixel e una risoluzione di 72 pixel / pollice. Particolare attenzione alla dimensione della superficie deve essere presa in questo importazione per mantenere una scala precisa. Le dimensioni della tela e la risoluzione sono fondamentali per la modellazione in Maya successive. La barra di scala, salvate come un livello separato in Photoshop, dovrebbe essere utilizzato per verificare che non modifica le dimensioni XY si verifica durante l'allineamento in Photoshop.
3. Quindi, collegare i tre (o più) strati corrispondenti alla stessa sezione (ad esempio, collegare ogni fase, UV, e Cy3 serie di immagini per ogni sezione). Ciò assicura che, quando uno strato è allineato, altri livelli associati a tale sezione sono anche allineati allo stesso tempo. In alternativa, è possibile bloccare il livello di fase, una volta nella posizione appropriata (vedi sotto) e quindi allineare gli strati di quella sezione associata allo strato di fase.
4. Per iniziare, tutti gli strati invisibili, cliccando sull'icona "occhio" nella finestra di strati.
5. Girare la prima e la seconda le immagini a contrasto di fase delle sezioni neurosfere di serie cliccando sul "occhio" icone nella finestra strati. Aumentare la trasparenza della seconda sezione. Nella scheda "Immagine", aprire "la rotazione delle immagini" e scegliere "arbitrario". Ruotare la seconda sezione fino a quando non sono in grado di identificare i punti di contiguità geometriche e strutturali tra le immagini. È utile per confrontare avanti e indietro con il canale UV (Hoechst 33258 marcato sezioni).
6. Ripetere l'operazione per tutte le sezioni successive serie a confronto "più vicini" (cioè, la sezione anteriore immediato con la sezione immediato posteriore) fino a tutte le sezioni e tutti i canali vengono accuratamente allineati.
7. Creare un piano in Maya v10 che è della stessa proporzione del file di Photoshop.

5. Tipologia delle cellule

1. Dalla linea di stato dell'interfaccia utente di Maya, modificare la barra dei menu dalla sua impostazione di default animazione alle superfici.
2. Utilizzare una sfera primitiva suddivisione per creare il corpo cellulare.
3. Con la neurosfere selezionato, di manipolare i suoi vertici cliccando il tasto destro del mouse sull'oggetto e selezionando dal menu Vertex marcatura. Elaborare ulteriormente la superficie della sfera, modificando il livello di visualizzazione dal menu di marcatura.
4. Dalla scheda Suddivisione superfici del menu principale, aprire la Gerarchia Collapse opzioni della finestra e impostare il numero di livelli a 2. Comprimere la sfera.
5. Modificare la barra dei menu da superfici a poligoni.
6. Con la sfera selezionato, aprire lo strumento Sculpt Geometry dalla scheda Mesh del menu principale.
7. Rifinire la superficie della cellula per la sua forma definitiva che impiega il set di strumenti Sculpt Geometry dalla scheda Impostazioni Strumento.
8. Ripetere questa procedura per creare corpi cellulari diversi per simulare la varietà degli NPC e progenie NPC presenti nel neurosfere. In questa dimostrazione, dieci corpi cellulari diversi costituiscono la base per le neurosfere.
9. Selezionare la tipologia di cellule e trasformazioni Freeze.
10. Con le cellule del vostro tipologia consolidata, due shader di superficie sarà progettato per rappresentare entrambe le cellule che esprimonola proteina di interesse (nel nostro esempio Cx29 cellule positive) e le cellule in cui la proteina è assente. Qui, ogni cella con Cx29 immunoreattività è designato Cx29-positivo. In questo esempio, la localizzazione subcellulare non è modellata anche se tale analisi è possibile con le modifiche al shader.
11. Aprire la finestra Hypershade dal rendering di Windows scheda> Editor del menu principale.
12. Scegli un Ramp Shader dalla scheda di superficie dei materiali.
13. Aprire l'Editor attributi e impostare il colore shader, incandescenza, Colore ambiente, Bump Map, e gli attributi Specular Color.
14. Assegnare una texture 3D browniano al nodo colore Ambient e una texture 2D Frattale al nodo Bump Mapping.
15. Selezionare l'ingresso risultante shader e Connessioni di uscita ed esportare la rete selezionata.
16. Selezionare la tipologia di cellule e aprire la casella di selezione delle opzioni di esportazione.
17. Scegli il tipo di file mayaAscii e deselezionare la casella Includi questi ingressi. Esportazione di selezione.

6. Mappatura delle cellule

1. Aprire il file di allineamento seriale sezioni in Photoshop CS4.
2. Stabilire una chiave di tratti di matita per contrassegnare le posizioni di ogni cellula progenitrice in sezioni seriali. In questa dimostrazione, una chiave di tre colpi - un quadrato, un quadrato con una linea tratteggiata, e un quadrato con una croce - sarà utilizzato per indicare se una cellula si trova in uno, due o tre sezioni. Questa chiave di colpi è ulteriormente definita in base al colore - in questo esempio, il rosso rappresenta cellule che esprimono la nostra proteina di interesse, Cx29, e bianco rappresenta le cellule non esprimono Cx29.
3. Girare lo strato di fase e iniziare segna il centro di ogni cellula progenitrice con un tratto di matita bianca. Utilizzare un livello separato all'interno della cartella sezione con cui costruire le vostre mappe.
4. Alterna tra le varie sezioni per individuare la posizione delle cellule garantisce che le unità in più di una sezione sono correttamente indicate.
5. Con la Cx29 strato acceso, selezionare le celle che rientrano nelle regioni in cui Cx29 è positivamente espresso.
6. Scegliere il comando Riempimento nella scheda Modifica della barra del menu principale di Photoshop e cambiare i colpi bianco a rosso.
7. Con le mappe completato, salvare ogni sezione come immagine separata jpeg nella cartella sourceimages del progetto Maya. Per fare questo, un nuovo progetto Maya dovranno prima essere creato.

7. Importazione e montaggio Maps in 3D

1. Dalla linea di stato dell'interfaccia utente di Maya, modificare la barra dei menu dalla sua impostazione di default Animazione a poligoni.
2. Importare i file planes.mb e scaleBar.mb dalla cartella progetti scene.
3. Con il piano selezionato, assegnare uno shader Lambert facendo clic sul pulsante destro del mouse sull'oggetto e aprendo la scheda Assegna nuovo materiale.
4. In Editor attributi fare clic sulla casella a scacchi a destra dell'attributo colore dei materiali.
5. Dal menu a comparsa, scegliere File dalla sezione Textures 2D.
6. Nella sezione File Attributi Attribute Editor, fare clic sull'icona del file a destra dell'attributo Nome immagine.
7. Scegli la prima sezione dalla cartella sourceimages.
8. Accendere la fotocamera della finestra di lavoro dalla vista prospettica per la vista ortogonale Top predefinita aprendo la scheda pannelli.
9. Selezionate lo strumento Crea poligono dalla scheda maglie del menu principale e tracciare il contorno della sezione.
10. Scegli la prima mappa dalla cartella sourceimages e assegnarlo al piano poligono appena creato seguendo la procedura stabilita per creare il piano poligono.
11. Con l'oggetto selezionato, scegliere dal menu UV marcatura, fare clic con il pulsante destro del mouse sopra l'aereo.
12. Selezionare tutti i punti UV aerei e aprire l'editor UV Texture dalla scheda Windows del menu principale.
13. Scala la proporzione dei raggi UV per adattarsi al piano di sezione.
14. Ripetere questo processo per ogni sezione del neurosfere garantire che gli spazi tra ogni sezione corrisponde alla altezza della barra della scala.

8. Individuazione tipologie di cellule progenitrici in 3D

1. Dalla linea di stato dell'interfaccia utente di Maya, modificare la barra dei menu dalla sua animazione impostazione predefinita per Dynamics.
2. Lasciando solo la prima sezione del neurosfere visibile, nascondere tutte le altre sezioni modificando le impostazioni dello schermo dalla scheda Visualizzazione del menu principale.
3. Con la casella delle opzioni dello strumento CV Curve è aperto, selezionare 1 lineare da Impostazioni Curve CV.
4. Guarda la scena dalla telecamera Vista dall'alto, iniziare ad assegnare i punti per le mappe delle cellule creando una curva per la Cx29-negativi cellule e uno per la Cx29 cellule positive.
5. Le curve risultanti sono piatte se visti da una telecamera laterale. Stabilire lo spessore delle sezioni spostando i punti della curva l'asse y utilizzando la barra di scala importati dalle immagini microscopia come guida.
6. Ripetere questo processo per ogni sezione del neurosfere.
7. Importare il file dalla cartella cellTyoplogy.ma scene del progetto e duplicare la tipologia delle cellule sia per le cellule Cx29 e Cx29-negativo-positivo all'interno del neurosfere.
8. Aprire la finestra Hypershade dal rendering di Windows scheda> Editor del menu principale.
9. Importare il shaders precedentemente costruito assegnandoli alle cellule della tipologia.
10. Dalla finestra Outliner, rimuovere il nome del file dall'inizio degli oggetti importati. Ciò diventerà importante nelle fasi successive del processo di modellazione.
11. Selezionare la scheda particelle dal menu principale e creare un emettitore di particelle per la prima curva CV.
12. Aprire la scheda particleShape1 e in Attributi emissione cambiare il Conte Max da -1 al numero di punti la prima curva.
13. Nella scheda Attributi Render modificare il tipo di rendering delle particelle alla superficie Blobby (s / w). Fare clic sulla casella Current Type Render sotto e modificare la distanza delle particelle 0.010.
14. Fissare le particelle ai vertici della curva selezionando prima le particelle poi spostare la selezione della curva. Aprire le opzioni Obiettivo dall'interno della scheda particelle del menu principale e impostare il peso di obiettivo a 1. Fare clic su Crea.
15. Selezionare le celle da numero 1 a 10 in ordine nella finestra Outliner e aprire il Instancer (sostituzione) di dialogo Opzioni nella scheda particelle del menu principale. Nella casella Istanza oggetti, tutte e dieci le cellule devono essere elencati in ordine.
16. Scegliere il nome corretto particleShape dal menu a tendina dell'oggetto particelle alla scheda istanza. Fare clic su Crea.
17. Per impostazione predefinita, solo la prima cella che è stato selezionato andrà a sostituire le particelle lungo la curva. Al fine di ottenere tutti i dieci tipi di apparire e di ciclo a caso tra le particelle, l'espressione è necessario. Una seconda espressione farà in modo che le cellule emettono casualmente nello stesso modo ogni volta che viene riposizionato Range Slider.
18. Con l'emettitore selezionato, aprire Attribute Editor. Nella scheda particleShape, in Aggiungi attributo dynamic clic sulla casella generale. In nome lungo scrivere random_index. Nel passaggio attributo Type da scalare per particella per (array) e premi Aggiungi.
19. In Particle (Array) scheda Attributi, una scatola random_index è stato aggiunto. Facendo clic con il pulsante destro del mouse sopra lo spazio vuoto, selezionare Crea Espressione ... dalla casella a discesa.
20. Digitare il testo nella Espressione: scatola - particleShape1.random_index = rand (10), se (particleShape1.particleId == 1) sementi (1);
21. Per completare l'espressione aprire il Instancer (sostituzione Geometria) scheda Attribute Editor e in generale Opzioni Oggetto random_index> Indice selezionare dal menu a tendina. Portare il cursore del tempo per il primo fotogramma e premere play, i tipi di cellule sono distribuite in modo casuale tra le particelle.
22. Ripetere questo processo per ogni sezione del neurosfere. Garantire che ciascun indice nuovo emettitore, Instancer e casuale è differenziato in base al nome e organizzata opportunamente nella finestra Struttura.

9. Rendering / Compositing

1. Nella Render Using sezione della finestra di rendering Impostazioni, modificare il renderer da Maya Software a mental ray.
2. Aprire la scheda Qualità e sotto Raytracing cambiare l'impostazione Riflessioni a zero. Aprire la scheda Framebuffer e cambiare il Colorclip da premoltiplicazione Raw ad Alpha e deselezionare.
3. Aprire il Box / Layer Channel Editor e modificare l'impostazione Layer Editor di visualizzazione per il rendering.
4. Selezionare le celle importate della tipologia e fare clic sul selezionate Crea nuovo livello e assegnare l'icona oggetti.
5. Rinominare il livello di occlusione ambientale.
6. Facendo clic con il pulsante destro del mouse sul livello appena creato, selezionare gli attributi dal menu.
7. A destra della casella renderLayer, fare clic sul pulsante Impostazioni predefinite e selezionare occlusione dalla discesa.
8. Selezionare la scheda mib_amb_occlusion1 e cambiare i Campioni 16-256.
9. Riaprire il Box / Layer Channel Editor e sotto la scheda Opzioni, aprire la casella Tutti Render Layers opzioni.
10. Seleziona composito e mantenere i livelli.
11. Con il livello ambientOcclusion selezionato, il cambiamento da Normale a Moltiplica dal menu a tendina appena sopra la lista dei livelli.
12. Render due passaggi del neurosfere, una volta con lo strato ambientOcclusion acceso e una volta con il masterLayer acceso. Salvare le immagini come file se e solo se nella cartella progetti immagini.
13. Aprite entrambe le immagini in Photoshop CS4. Posizionare lo strato ambientOcclusion in cima alla masterLayer e impostarlo su Moltiplica. Creare uno sfondo e appiattire l'immagine.

Discussion

Questo protocollo descrive una procedura per la cultura e serialmente cryosection NPC dell'ippocampo post-natale, localizzare l'espressione di proteine ​​da immunolocalizzazione, ed infine ricostruire e analizzare la posizione topografica delle cellule immunopositive all'interno del neurosfere intero 3D. Grazie alla combinazione di cultura biologia cellulare e tecniche di lavorazione, immagini di microscopia (OpenLab, Improvvisazione e altri software di analisi delle immagini), le capacità del software di editing grafico (Adobe Photoshop), e l'animazione 3D e capacità software per il compositing (Autodesk Maya), vi presentiamo una metodologia di ricostruire la tutta la composizione cellulare di culture 3D da immagini 2D di serie consentendo la ricostruzione fedele della posizione cellulare e l'espressione della proteina in tutto una cultura neurosfere. Questo protocollo può essere combinato con efficacia pari alla registrazione e la ricostruzione di sezioni sottili epifluorescente serial o confocale Z-stack attraverso spesse sezioni seriali. Perché l'espansione clonale di NPC singola cultura neurosfere ricapitola molte delle fasi osservate nel corso della neurogenesi e gliogenesis in post-natale del cervello, l'impatto della sua struttura 3D rappresenta un importante determinante destino NPC in progenie esposta al stesso ambiente sperimentale ^1. La divergenza tra lignaggio e l'espressione della proteina al centro e la periferia di sezioni neurosfere di serie suggerisce che molteplici fattori fisici compresa la posizione delle cellule, sollecitazioni meccaniche, e la forza di taglio giocano un ruolo importante nella regolazione della NPC biologia ^2. Inoltre, l'espressione della proteina connessina, qui analizzata, ha dimostrato di cambiare a seconda di quando gli NPC sono coltivate come neurosfere 3D in sospensione o placcato su un substrato di laminina con funzionali connessina comunicazione mediata alterata se le cellule sono coltivate su plastica e substrato o in 3D gratis fluttuante culture ^3. L'impatto della posizione cellulare sul destino NPC rimane poco chiaro. E 'tecnicamente impegnativo per analizzare l'impatto di posizione spaziale all'interno della cultura 3D su biologia NPC dato che la valutazione antigenica di lignaggio e proteine ​​di segnalazione richiede interruzioni di architettura 3D per permettere permeabilizzazione cellulare e di anticorpi accesso a tutte le celle. Qui mostriamo che una metodologia di visualizzazione ibrida fornisce un mezzo per stabilire se alcune proteine ​​mostra unica localizzazioni di posizione nella cultura 3D, può essere usata per capire e testare la funzione delle proteine ​​e la regolazione rispetto alla localizzazione regionale nel neurosfere, e, cosa forse più importante , fornisce i dati di posizione necessario per studiare l'impatto della topografia 3D e posizionamento cellulare sul destino NPC nella cultura 3D.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Euthansol	Reagent	Merck & Co.
Krazy Glue	Reagent	Home Hardware
VT1000S vibratome	Equipment	Leica Microsystems
Neural protease	Reagent	Sigma-Aldrich	P6141	Stock solutions stored at -20°C
Papain	Reagent	Sigma-Aldrich	P4762	Stock solutions stored at -20°C
DNAse I	Reagent	Roche Group	11 284 932 001	Stock solutions stored at -20°C
MZ6 Dissecting Microscope	Equipment	Leica Microsystems
ProBlot 6 Hybridization Oven	Equipment	Labnet International
Centrifuge 5702	Equipment	Eppendorf
kPBS	Reagent	BioShop Canada	PBS404
B27 Supplement	Reagent	Invitrogen	17504-044
Ultra Low Binding Tissue Culture Dishes	Disposable	Corning	3261
Human Epidermal growth Factor	Reagent	Invitrogen	13247-051	Stock solutions stored at -20°C
Fibroblast growth factor-2	Reagent	Invitrogen	13256-029	Also known as basic fibroblast growth factor (bFGF) Stock solutions stored at -20°C
37% formaldehyde (molecular grade)	Reagent	Sigma-Aldrich	F8775
Belly Dancer Shaker	Equipment	Stovall Life Sciences, IBI Sciences
Tissue- Tek Cryomold	Disposable	Sakura Finetek	4566
Tissue-Tek OCT compound	Reagent	Sakura Finetek	4583
Whatman Grade 703 Blotting Paper	Disposable	VWR international	28298-020
CM1900 Cryostat	Equipment	Leica Microsystems
Polyclonal Anti-Cx29 Primary Antibody	Reagent	Kindly provided by Dr David Paul, Harvard Medical School		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
Cy3-conjugated donkey anti-rabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
H–chst 33258	Reagent	Sigma-Aldrich	861405
DMRA2 epiflourescent microscope, Orca ER camera, OpenLab v3.56	Equipment/ Software	Leica Microsystems		This protocol can be performed with any epifluorescent or confocal microscope.
Photoshop CS4	Software	Adobe		Graphic software
Maya v10	Software	Autodesk		Modeling software
Computer	Equipment	Intel		Processor: Intel Corei7 920, Memory:12GB DDR3 Video card: Nvidia GTX 285 (1GB RAM)
* All other standard chemical reagents listed in the protocol are from Sigma-Aldrich. All other standard tissue culture reagents are from Invitrogen.