Summary
ここで、我々は3次元（3D）文化の中で、生産の拡大、およびimmunolabel生後海馬の神経前駆細胞（NPCに）する方法について説明します。次に、ハイブリッド可視化技術を使用して、我々はimmunolabelled凍結切片のデジタル画像が全体の3Dニューロスフィアを通して免疫陽性細胞の空間的位置を再構築し、マップするために使用することができる方法を示します。
Abstract
神経幹細胞および前駆細胞に影響を及ぼす3次元（3D）地形の重要性（NPC）表現型は、広く研究するために挑戦はまだ認められている。胎児または出生後の脳からのときは解離、単一のNPCはニューロスフェアを形成するために、懸濁液中で増殖される。これらの培養物内の娘細胞は、自発的に同一の細胞外環境にさらされているにもかかわらず、拡大の過程で明確な発達系統を（ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト）を採用。この進行の反復するには、ステージの多くは、出生後の脳における神経新生とgliogenesisの経過観察と、多くの場合、制御された環境の中で基本的なNPCの生物学を研究するために使用されます。 NPCの運命上のこれらの培養物内の3D地形や携帯電話の位置の完全な影響を評価する、しかし、難しいです。標的タンパク質をローカライズし、免疫細胞化学によってNPCの系統を識別するには、フリーフローティングニューロスフェアは、基板上に播種したり、シリアルに区分されている必要があります。この処理は、球全体に相当する細胞浸透性および抗体のアクセスを確保するために必要です。その結果、凍結切片または3D Z -スタックの共焦点再建の2D落射蛍光画像は、離散的な物理的またはデジタル3Dスライス内のセルの位置に関する空間的な情報を提供することができますし、無傷の球の細胞の位置を視覚化していない。ここでは、ニューロスフェアの文化の地形をあらためて表明し、全体の文化を通して蛋白質の発現の空間的な分析を可能にするために、我々は分離、展開、および標的タンパク質の落射蛍光または共焦点免疫検出に適した生後海馬ニューロスフェアのシリアルセクショニングのためのプロトコルを提示する。 Connexin29は（Cx29）の例として分析される。次に、グラフィックの編集と厳密に生物学的な詳細を維持するために適用される3Dモデリングソフトのハイブリッドを使用して、我々はどのようにこれらのイメージの再アセンブル3次元構造の位置へとデジタル完全なニューロスフェアの中で標識された細胞をマッピングについて説明します。この方法論は、全体の3次元文化の地形全体の標的蛋白質と細胞の細胞位置の可視化と分析を可能にし、in vitroで神経新生とgliogenesisの過程で細胞間の空間関係のより詳細な分析を容易にするでしょう。
Imbeaultとバレンスエラ両方が均等に貢献し、共同第一著者を考慮する必要があります。
Protocol
1。神経前駆細胞の分離
分離のプロトコル中に常に冷たい組織とソリューションを保つ！
- 自分の文化を開始する前に、以下のストック溶液を準備します。
- 解離メディア（26 mMの炭酸水素ナトリウム、124 mMのNaCl、5mMのKClを、0.1mMのCaCl 2を * 2H 2 O、3.2 mMのMgCl 2 · 6H 2 O、10 mMのD -グルコース、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのニューラルプロテアーゼ（25mgを：。-20℃で再蒸留H 2 O、滅菌フィルタ、-20℃で保存のアリコートで、細胞解離のために使用される酵素の株式の濃度を準備におけるストレプトマイシン滅菌フィルタ10〜15 mLのアリコートの店舗/ mL）を、パパイン（10 mg / mL）は、DNAseI（10 mg / mLの）実験当日、以下の最終濃度で解離メディアの15mlに酵素を追加します。1 mg / mLのプロテアーゼ、0.1mg / mLのパパイン、最終酵素濃度を含有は0.1 mg / mlのDNase Iの解離液は、解剖の過程で氷上で保存することができます。
- 保守メディア：ダルベッコ改変イーグル培地F12（DMEM/F12）、2mM L -グルタミン、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、1X B27サプリメント。最大3ヶ月まで4℃で保持することができる4℃B27サプリメントとは最大1ヶ月せず° B27サプリメントとC。
- 成長の要因：0.1μg/ mLのヒト組換え型上皮成長因子（hEGF）、10μg/ mLの株式のアリコートを準備DMEM/F12の線維芽細胞増殖因子-2（FGF - 2）+ 0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）。 -20℃で保存
- 致死量のC57BL / 6マウスの仔を麻酔するために、マウスは生後0から3にEuthansolを腹腔内注射されています。
- 26 mMの炭酸水素ナトリウム、124 mMのNaCl、5mMのKClを、2mMのCaCl 2を * 2H 2 O、1.3 mMのMgCl 2 · 6H 2 O：慎重に標準郭清と人工脳脊髄液を含む60mmディッシュの店（ACSFで頭脳を削除する、10mMのD -グルコース、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン）。 7.3〜pHの場合50 mLのアリコートに必要と滅菌フィルタ、-20℃で保存
- ビブラトームチャックにクレイジー接着剤、吻側側を上に、あなたが直面している背側、と小脳と接着剤の脳を削除して、かみそりの刃、ブロックの脳を使用する。ライカVT1000Sビブラトームは、このプロトコルで使用されています。
- 位置は、ビブラトームでチャックと適切なコンパートメントにACSFと氷を追加します。
- 500μmのスライスを切る8.5の3.5から4.5と周波数の間の速度を用いて厚さ。
- ACSFを含む皿に海馬体を含むスライスを収集する。
- （ACSFなし）（CA3領域が曲線腹側にし始めるまで）実体顕微鏡を使用して、ブレグマ-1.60 mmと-2.40 mmの間で海馬を削除し、新しい乾燥した皿の場所。ライカMZ6解剖顕微鏡は、このプロトコルで使用されています。
- すべての海馬が収集されると、（均質と液化外観が得られるまで）メスで組織をミンチ。
- 神経プロテアーゼ、パパイン、およびDNase Iを（溶液の調製のためのステップ＃1を参照）を含む2.5mLの解離のメディアを含む15 mLポリプロピレンチューブにみじん切りの組織を移す。組織率：元組織の多くがある場合はそれが最適な酵素を維持するために、2.5mLの解離のメディアの2バイアルを使用することは良い考えです（例えば、6匹から）注意してください。 ° C 45〜60分間回転させながら37℃でインキュベートする。 Labnet ProBlot 6ハイブリダイゼーションオーブンは（マンデル科学を通じて購入された）回転設定4に設定し、このプロトコルで使用されています。
- と5分間、300 xgで遠心分離：無菌組織培養のリン酸カリウムの10 mLの緩衝生理食塩水（137 mMのNaCl、2.7 mMの塩化カリウム、10mMリン酸緩衝液、pH7.4 KPBS）を追加します。エッペンドルフ遠心分離機（モデル5702）はこのプロトコルで使用されています。
- KPBS 5mLに上清とペレットを再懸濁しますを捨てる。
- パスツールピペットを介して粉砕によって組織を解離する。
- 5分間、300 xgで細胞懸濁液を遠心してください。
- メンテナンス培地3mlに再懸濁し、細胞を、60ミリメートル非接着性ディッシュにトリパンブルーとプレートの細胞を使用して、カウント細胞を2.5 × 10 5細胞の密度で（コーニング超低付着結合料理がこのプロトコルで使用されている、材料を参照してください）維持培地5mL中/皿。ペトリ皿は、超低付着皿の代わりに使用することができますが、文化は、メッキや自発的分化を防止するためにin vitroでの最初の6日間の膨張（DIV）の間、毎日午前と午後にタップが必要になります。
- すぐにメッキ後10 ng / mLの最終濃度ng / mLおよびFGF - 2 20の最終濃度にhEGFを追加。 DIV 14収集日まで、拡張フェーズ中に2日ごとに追加の成長因子を追加。 （ニューロスフェアを拡大ビデオのスケールバーは100μmを表す。）
**注意：メディアは、拡張相のDIVの約10黄色になることがあります。この問題が発生した場合は、別の1 mLの舞を追加ntenanceメディア。メディアは、次の日、再び黄色の場合、保守メディアの別の1 mlの - あなたの拡張の段階で、必要に応じてこれを実行してください - 正しい最終濃度を維持するためにそれに応じて成長因子の音量を調整することを忘れないでください。
2。シリアルCryosectioning
- 球が固定の時点で十分に分離されるように、固定前に静かにニューロスフェアをタップします。
- 直接文化にゆっくりと振とうしながら20分間室温で3.7％、インキュベートの最終濃度（RT）に分子等級ホルムアルデヒドを追加。ストーバルベリーダンサーは、2.5の回転速度に設定され、このプロトコルで使用されています。
- 15 mLのポリプロピレンチューブにニューロスフェアを収集し、5分間、300 xgでスピンダウン。
- （：154 mMのNaCl、10mMリン酸緩衝液nPBS）緩衝生理食塩水を10mLのリン酸ナトリウムで清とペレットを再懸濁しますを捨てる。 KPBSからnPBSへのソリューションの使用状況の変化に注意してください。
- 5分間、300 xgでスピンダウン。
- nPBS 5〜10 mLの20％ショ糖（w / v）溶液に再懸濁します。
- 文化をcryoprotectするには、少なくとも24時間4℃でニューロスフェアをしてください。
- 最適切断温度（OCT）コンパウンドで使い捨てcryomoldを埋める。
- 静かに皿にニューロスフェアを含むショ糖溶液を注ぐ。
- 機械的破壊の最低証拠と様々なサイズの代表的な球を見つけるために実体顕微鏡を使用してください。初めてこの手順を実行する際、いくつかの文化が壊れたり、引き裂かれることがあります。形態は、うまく実践して維持されます。
- 静かに1 mLのピペットチップ（最小に除去ショ糖を含む、溶液の体積を保つ）にそれぞれのニューロスフェアを吸引し、OCTコンパウンドに配置します。後で球を見つけることができるように、金型上のおおよその現在位置をマークします。
- 一度cryomoldにいくつかの球を配置した、OCTは白になるまでCO 2を使用してサンプルを急速冷凍。
- キューブ上の球の位置をマークし、金型からキューブを飛び出す
- あらかじめ冷却した鉗子を使用して、以前にOCTでチャックに固定されたフィルター紙の上に立方体を配置。
- キューブの周囲のより多くのOCT化合物を配置し、CO 2を使って球を含むブロックを接着するために凍結する。またクライオスタットのチャック（ろ紙付き）、ろ紙上に噴出OCTコンパウンド、およびOCTへの直接場所のキューブを置きます。 OCTは、白とハードになるまで待ちます。ライカCM1900クライオスタットは、このプロトコルで使用されています。
- OCTコンパウンドが白になるとしたら、平衡に温度の少なくとも30分待ってから、カットブロックの上にチャックを配置することがあります。
- シリアル10μm以下のセクションでは、あなたのマークを探してとニューロスフェアのセクションのための顕微鏡下でしばしばチェックするカット。多くのセクションを一つのスライドに可能な限りの場所。あなたは、スコープの下にニューロスフェアの最初のいくつかのスライスを参照することができない場合がありますので、セルが表示されるまで、すべてのセクションを収集し、このスタートの前にして、球の端で3〜5セクションを保つ注意してください。これらの前部と後部のセクションは、免疫細胞化学用に処理されます。それはあなたが標準的な倒立位相差顕微鏡下で容易に明らかではないロスフェア極で単一の細胞を検出できるようになりますように免疫染色を行う核対比したがってキーです。
- -20℃で保存するセクション
3。免疫細胞化学
- すべてのセクションにわたって優しくnPBSを適用し、5分間室温でインキュベートすることにより、-20℃および融解からスライドを削除します。
- 過剰nPBSはじき飛ばすと、すぐに抗体バッファー（nPBS、pH7.2中アルブミントリトンX - 100、0.3％ウシ血清0.3％）で希釈した一次抗体を適用する。あなたはスライド当たり〜100μLが必要になります。このプロトコルでは、我々は3Dニューロスフェア培養液中に存在する離散的なNPCの子孫でCx29をローカライズ。
- パラフィルムでカバーは、セクションをカバーすることではなく、パラフィルム、スライドの幅に達するか超えた場合、抗体が浸透して、スライドをオフに描画される顕微鏡のスライドのサイズを超えないようにカット。パラフィルムでは、蒸発を防ぐことができます。湿度の高いチャンバー内で4℃で一晩インキュベートする。セクションを介してパラフィルムをフロート状態に注意してください、それがスライドに付着することはできません。ただし、一度ケアとして適用削除または変更しないパラフィルムの配置は、セクションの任意のせん断力を加えると、それによって形態を混乱しないように注意する必要があります。
- セクションに直接〜1 mLのnPBSを追加し、パラフィルムをオフに浮く。パラフィルムを離れて浮かぶまで、あるいは、コプリンジャーに垂直に直接スライドを配置する。それはあなたが壊れやすいニューロスフェアの構造を破壊する可能性があるため、独立して操作の離れて浮かぶまで、パラフィルムを除去しないでください。パラフィルムをスライドオフになると、室温で5分間インキュベートする。 nPBSをはじき飛ばす、5分間室温でさらに3回洗浄を続けます。
- 1に室温で抗体バッファとインキュベート中に希釈した二次抗体を適用する上記のような湿気の多い部屋でH。再度〜100μL/スライドが必要になります。
- 手順4でnPBSの洗浄を繰り返します。 5分間3 回洗浄 （ヘキスト33258 nPBSでは0.5μg/ mL）を内核の対比染色を適用し、室温で5分間の最後の洗浄を進める。
- （グリセロールベースのメディアを使用している場合）の損失を防ぐために、すべてのエッジの周りにしてコーナーの最初のnailpolishとカバーを固定して、お好みのアンチフェードマウントメディアやカバースリップでマウントします。
- 落射蛍光または共焦点顕微鏡を用いて画像のコレクションに進みます。このプロトコルでは、我々はライカDMRA2、浜松オルカERのカメラ、およびオープンラボv3.56ソフトウェアを使用してください。この例では、画像が3つのチャネル上に捕獲されています：（1）位相コントラスト、（3）ブルーUV（ライカA4キューブ：フィルタの組み合わせ例40分の360、ディ400、SpのBP470/40）、そしてレッド（ライカY3キューブ：フィルタの組み合わせ例BP535/50、ディ565、Spは75分の610）。単一細胞の位相検出が困難であるDNAのヘキスト33258ラベルを使用して電柱を追跡することによって、最初と最後のセクションに細心の注意を払って各連続切片を撃つ。
4。アライメント
- 凍結切片の顕微鏡の行に解凍マウントされている場合、彼らは非常にわずかに移動して回転します。これらの偏差を修正する必要があります。また、各連続切片を撮影したときに、各画像の中央は、画面上の同じ場所にない可能性があります。その結果、各デジタル化されたシリアルセクションは、慎重に正確な形態を維持するために、前のセクションで再編されている必要があります。このアライメントは、細胞構築と地形細部まで慎重かつ正確な注意が必要です。
- 各チャンネルとは10μmと50μmの（オープンラボv3.56ソフトウェアで確立された）の居住者のスケールバーのシリアル画像は、個々のTIFFファイルとして保存され、3300 X 2550ピクセルと72の解像度の標準的なキャンバスのサイズを使用してPhotoshopのCS4にインポートされますピクセル/インチ。キャンバスのサイズには十分注意し、正確な規模を維持するために、このインポートで注意する必要があります。キャンバスのサイズと解像度は、Mayaの後続モデルの鍵となります。 Photoshopで別のレイヤーとして保存されたスケールバーは、、XY寸法に変更はPhotoshopで整列中に発生しないことを確認するために使用する必要があります。
- 次に、同じセクション（すなわち、各セクションの各フェーズ、UV、およびCy3の画像のシリーズをリンクさせる）に対応する3つ（またはそれ以上）のレイヤーをリンクします。これは1つのレイヤーが整列されている場合、そのセクションに関連付けられた他の層も同時に配置されることを保証します。あるいは、適切な位置（下記参照）に一度の位相層をロックしてから、位相層にそのセクションの関連するレイヤーを整列させることができます。
- 開始するには、レイヤーのウィンドウで"目"のアイコンをクリックしてすべてのレイヤーを非表示にする。
- レイヤーのウィンドウで、"目"のアイコンをクリックしてオンロスフェアシリアルセクションの第1および第2の位相コントラスト像を回す。番目のセクションの透明性を高める。 "イメージ"タブの下に、"画像回転"を開き、選択して"任意の。"あなたが画像間の幾何学的および構造的接近のポイントを特定できるまで、番目のセクションを回転させる。 UVチャンネル（ヘキスト33258標識のセクション）で、前後と比較すると便利です。
- すべてのセクション、すべてのチャネルが正確に整列されるまで、"最も近い隣人"（すなわち、即時の後のセクションで即時前方セクションを）比較するすべての後続の連続切片について、この手順を繰り返します。
- Photoshopのファイルと同じ割合であるマヤV10で平面を作成します。
5。細胞の類型
- Mayaのユーザインタフェースのステータスラインから、そのデフォルトのアニメーションの設定から表面にメニューバーを変更。
- 細胞体を作成するために原始的なサブディビジョン球を使用してください。
- ニューロスフェアを選択した状態で、オブジェクト上でマウスの右ボタンをクリックし、マーキングメニューから頂点を選択して、その頂点の操作を開始。さらにマーキングメニューから表示レベルを変更することにより、球体の表面を詳しく説明。
- メインメニューのサブディビジョンサーフェスのタブから、折りたたみ階層のオプションボックスを開き、2レベルの数を設定します。球を折りたたむ。
- ポリゴンの表面からメニューバーを変更します。
- 球を選択した状態で、メインメニューのMeshタブからジオメトリのスカルプトツールを開きます。
- [Tool Settings]タブから、ジオメトリのスカルプトツールセットを採用し、最終的な形への細胞の表面を改良。
- ニューロスフェアにおいてNPCとNPCの子孫の存在の様々なシミュレートするために別の細胞体を作成するには、このプロセスを繰り返します。このデモンストレーションでは、10種類の細胞体はニューロスフィアの基礎を形成する。
- 細胞の類型論とフリーズの変換]を選択します。
- あなたの類型の細胞が確立されると、2つのサーフェスシェーダが発現している両方のセルを表すように設計されます。目的のタンパク質（この例でCx29陽性細胞）とタンパク質がない細胞。ここでは、Cx29免疫活性を持つ細胞はCx29陽性指定されています。このような分析は、シェーダへの変更が可能ですが、この例では、細胞内局在性はモデル化されていません。
- メインメニューのウィンドウ>レンダリングエディタ]タブから、ハイパーシェードウィンドウを開きます。
- サーフェスマテリアルのタブからランプシェーダを選択します。
- アトリビュートエディタ（Attribute Editor）を開き、シェーダの色、白熱光、アンビエントカラー、バンプマップ、およびスペキュラカラー（Specular Color）アトリビュートを設定します。
- 周囲の色のノードとバンプマッピングのノードへの2次元フラクタルテクスチャにブラウンの3Dテクスチャを割り当てます。
- 結果シェーダの入力および出力の接続を選択し、選択したネットワークをエクスポートします。
- 細胞の類型を選択し、[エクスポートの選択]オプションボックスを開きます。
- 選択したファイルタイプmayaAsciiのチェックをはずしては、これらの入力ボックスを含めます。エクスポートの選択。
6。セルマッピング
- Photoshop CS4の整列シリアルセクションのファイルを開きます。
- 連続切片の各前駆細胞の位置をマークするために鉛筆のストロークのキーを確立する。このデモンストレーションでは、3打差の鍵 - 四角、破線の矩形、およびクロス正方形は - セルが1つ、2つまたは3つのセクションに配置されているかどうかを示すために使用されます。ストロークのこのキーは、さらに色によって定義されている - この例では、赤は興味が私たちのタンパク質を発現する細胞、Cx29を表し、白はCx29を発現しない細胞を表しています。
- に位相層を回して、白鉛筆ストロークで各前駆細胞の中心をマーキング開始。あなたのマップを作成するとセクションのフォルダ内に個別のレイヤーを使用してください。
- 複数のセクション上の細胞が正しく表記されることを保証するセルの位置を見つけるためにセクションを切り替える。
- Cx29レイヤーをオンにすると、Cx29が積極的に表現されている地域に分類されるセルを選択します。
- Photoshopのメインメニューバーの[編集]タブから塗りつぶしコマンドを選択し、赤に白のストロークを変更してください。
- マップが完了すると、Mayaプロジェクトのsourceimagesフォルダ内の個別のJPEG画像として各セクションを保存する。これを行うには、新しいMayaプロジェクトは、最初に作成する必要があります。
7。 3Dのマップをインポートし、組み立て
- Mayaのユーザインタフェースのステータスラインから、そのデフォルトのアニメーションの設定からポリゴンにメニューバーを変更。
- プロジェクトのシーンフォルダからplanes.mbとscaleBar.mbファイルをインポートします。
- 飛行機を選択した状態で、オブジェクト上でマウスの右ボタンをクリックし、[割り当ての新材料のタブを開いて、Lambertシェーダを割り当てます。
- アトリビュートエディタでマテリアルのカラーアトリビュートの右側に市松模様のボックスをクリックします。
- ポップアップメニューから、2Dテクスチャセクションからファイルを選択してください。
- アトリビュートエディタ（Attribute Editor）でファイルの属性]セクションの下に、イメージの名前（Image Name）アトリビュートの右側にファイルのアイコンをクリックします。
- sourceimagesフォルダから最初のセクションを選択してください。
- パネルのタブを開いてパースペクティブビューからデフォルト正上位のビューにワークスペースウィンドウのカメラを切り替えます。
- メインメニューのメッシュから作成]タブポリゴンツールを選択して、セクションの輪郭をなぞる。
- sourceimagesフォルダから最初のマップを選択し、ポリゴンプレーンを作成するために確立された手順に従って、新しく作成されたポリゴン平面に割り当てます。
- 選択したオブジェクトで、平面の上でマウスの右ボタンをクリックして、マーキングメニューからUVを選択します。
- すべてのプレーンのUVポイントを選択し、メインメニューのウィンドウ]タブからテクスチャエディタ（UV Texture Editor）を開きます。
- 断面平面を合わせて比例的にUVのをスケーリングします。
- 各セクションの間にスペースはスケールバーの高さに対応することを保証するニューロスフェアの各セクションに、このプロセスを繰り返します。
8。 3Dでの位置前駆細胞の類型
- Mayaのユーザインタフェースのステータスラインから、ダイナミクスに設定し、デフォルトのアニメーションからメニューバーを変更。
- 目に見えるニューロスフェアの前半部分のみを残して、メインメニューの[表示]タブから表示設定を変更することにより、他のすべてのセクションを非表示にします。
- CVカーブツールのオプションボックスが開いている状態で、CVカーブの設定からリニア1]を選択します。
- トップビューカメラからシーンを表示する、一Cx29 -陰性細胞の曲線とCx29陽性細胞のための1つを作成し、セルマップにポイントを割り当てることが。
- サイドビューカメラから見たときに得られる曲線はフラットです。ガイドとして顕微鏡画像からインポートスケールバーを使用して、y軸の曲線の点をシフトすることによって、セクションの厚さを確立する。
- ニューロスフェアの各セクションに、このプロセスを繰り返します。
- プロジェクトのシーンフォルダからcellTyoplogy.maファイルをインポートして、ニューロスフェアの中Cx29陰性とCx29陽性細胞の両方のセルの類型論を複製。
- メインメニューのウィンドウ>レンダリングエディタ]タブから、ハイパーシェードウィンドウを開きます。
- 類型の細胞にそれらを割り当てる前に建てられたシェーダをインポートします。
- アウトライン表示のウィンドウから、インポートされたオブジェクトの先頭からファイル名を削除します。これは、モデリングプロセスの後の段階で重要になるでしょう。
- メインメニューから、粒子のタブを選択し、最初のCVカーブのためのパーティクルエミッタを作成します。
- particleShape1タブを開いて、エミッション属性で-1から最初の曲線上の点の数に最大数を変更する。
- レンダリングではタブはメタボールの表面にパーティクルのレンダータイプ（S / W）を変更する属性。下記の現在のレンダリングの種類]ボックスをクリックし、粒子0.010半径を変更してください。
- まずカーブを選択するシフト粒子を選択することにより、曲線の頂点に粒子を取り付けます。メインメニューの粒子のタブの中から目標のオプションを開き、1に目標体重を設定します。 [作成]をクリックします。
- アウトラインウィンドウで順番に番号1〜10のセルを選択し、メインメニューの粒子のタブからスタン（交換）オプションダイアログボックスを開きます。インスタンスオブジェクト]ボックスに、10個すべての細胞が順にリストしてください。
- パーティクルオブジェクトのドロップダウンリストから[インスタンス]タブに正しいparticleShape名を選択してください。 [作成]をクリックします。
- デフォルトでは、選択された最初のセルだけでは、曲線に沿ってパーティクルを置き換えます。パーティクル間でランダムに現れるとサイクルに全10種類を取得するためには、式が必要です。番目の式は、細胞が同じようにランダムに範囲スライダの位置が変更されるたびに発することが保証されます。
- エミッタを選択した状態で、アトリビュートエディタ（Attribute Editor）を開きます。 particleShapeタブで、[追加]動的属性の下に一般的なボックスをクリックしてください。ロングネームの下random_indexを書きます。スカラからパーティクル単位（配列）とヒットに属性タイプのスイッチに追加します。
- タブを属性ごとに粒子（配列）で、random_indexボックスが追加されました。空のスペース上でマウスの右ボタンをクリックすると、式の作成]を選択します...ドロップダウンボックスから。
- 式のテキスト入力：ボックス - particleShape1.random_index = RAND（10）;場合（particleShape1.particleId == 1）シード（1）;
- スタン（ジオメトリ交換）アトリビュートエディタ（Attribute Editor）の[全般オプション]のタブを開いて式を完成する>オブジェクトのインデックスは、ドロップダウンリストからrandom_index]を選択します。最初のフレームにタイムスライダを持参して遊びをヒット、細胞型は、ランダムに粒子間に分散されています。
- ニューロスフェアの各セクションに、このプロセスを繰り返します。それぞれの新しいエミッタ、スタン、そしてランダムなインデックスを名前で区別されると、アウトライナ（Outliner）ウィンドウで、適切に編成されていることを確認します。
9。レンダリング/コンポジット
- レンダー設定（Render Settings）ウィンドウのセクションを使用してレンダリングでは、Mayaソフトウェアからのmental rayレンダラーを変更する。
- [品質]タブを開き、レイトレーシングでゼロに設定する反射を変更。フレームバッファのタブを開いて、RAWからアルファのチェックをはずして前増加するColorclipを変更してください。
- チャンネルボックス/レイヤエディタを開き、レンダリングするための表示から、レイヤエディタの設定を変更してください。
- 類型論のインポートされたセルを選択して、新規レイヤーを作成し、選択したオブジェクトのアイコンを割り当てる]をクリックします。
- 層アンビエントオクルージョンの名前を変更します。
- 新しく作成された層の上にマウスの右ボタンをクリックし、メニューから属性を選択します。
- renderLayerボックスの右側に、プリセットのボタンをクリックし、ドロップダウンリストからオクルージョンを選択します。
- mib_amb_occlusion1タブを選択して、16から256のサンプルを変更してください。
- チャンネルボックス/レイヤエディタを開き直すと[オプション]タブの下に、レンダリングのすべてのレイヤーオプションダイアログボックスを開きます。
- 複合選択し、レイヤーを保持。
- 選択したambientOcclusion層と、ちょうど層のリストの上にドロップダウンボックスから、Multiplyにノーマルから変更してください。
- かつてmasterLayerがオンになって一度オンになっていて、ambientOcclusion層と、ニューロスフェアの2つのパスをレンダリングします。プロジェクトのimagesフォルダ内のIFFファイルとして画像を保存します。
- Photoshop CS4の両方の画像を開きます。 masterLayerの上にambientOcclusion層を配置し、乗算に設定します。背景を作成し、画像を統合。
Discussion
このプロトコルは、文化とシリアル凍結切片産後海馬のNPCに手順を説明し、免疫検出によるタンパク質の発現をローカライズする、そして最終的に全体の3Dニューロスフィア内に免疫陽性細胞の地形の位置を再構築し、分析する。 、グラフィック編集ソフトウェア容量（アドビフォトショップ）、そして3Dアニメーションとの合成ソフトウェア容量（Autodesk Mayaを）細胞生物学の文化と加工技術、顕微鏡画像（オープンラボ、即興と他の画像解析ソフト）を組み合わせることにより、我々は、再構築する方法論を提示ニューロスフェア培養を通して細胞の位置およびタンパク質発現の忠実な再建を可能にするシリアル2D画像から3Dの文化の全体の細胞組成。このプロトコルは、登録と厚い連続切片を介して落射蛍光薄連続切片または共焦点Z -スタックの再建に等しい効果と組み合わせることができます。出生後の脳における神経新生とgliogenesisの経過観察の段階のニューロスフェア培養用反復する単一のNPCのクローン増殖が多いため、その立体構造の影響は、同じ実験環境1にさらさ後代における重要なNPCの運命決定因子を表しています。シリアルロスフェアのセクションのコアと周辺部で系統およびタンパク質発現の相違は、そのセルの位置、機械的応力、及びせん断力を含む複数の物理的要因はNPCの生物学2を調節する上で重要な役割を果たすことを示唆している。さらに、コネキシン蛋白質の発現は、、ここで解析のNPCが細胞をプラスチックや基板上または3Dを無料で培養されているかどうかを変更機能コネキシンを介したコミュニケーションによるラミニン基質上にサスペンションやメッキで3Dロスフェアとして培養されるときに応じて変更することが示されているフローティング文化3。 NPCの運命上の細胞の位置の影響は不明なままである。それは技術的に系統およびシグナル伝達タンパク質の抗原性の評価は、3次元構造の破壊は、細胞浸透性とすべてのセルへの抗体のアクセスを有効にするために必要な特定のNPCの生物学上の3次元文化の中で空間的な位置の影響を分析するために挑戦している。ここで、我々はハイブリッド視覚化手法は、おそらく最も重要なの、、特定の蛋白質が立体文化の中でユニークな位置ローカライゼーションを示すかどうかを決定する手段を提供するニューロスフェアの中で局所的配置に関連してタンパク質の機能と規制を推測し、テストするために使用することができる、としていることを示し、3次元培養におけるNPCの運命の3D地形や携帯電話の位置の影響を研究するために必要な位置データを提供します。
Disclosures
動物での実験はすべてオタワアニマルケア委員会の大学や動物ケアに関するカナダの理事会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。
Acknowledgments
我々は専門家の編集支援のためのデータ収集の支援のためにマットクック、ビデオ制作や編集の専門家の技術支援のためにエヴァンディザートとマークレオナールに感謝、そしてサラGelbard。仕事はSALB、SALBとSFの健康研究プログラムの助成金の戦略的トレーニングイニシアティブ（TGF神経変性脂質メタボロームのCIHRのトレーニングプログラム、9121）、およびインフラストラクチャへの健康研究のカナダ研究所（CIHR、MOP 62626）から営業の補助金によって賄われていたカナダの財団イノベーションとオンタリオ州イノベーショントラストからSFまでサポート。 SIは、パーキンソンの研究コンソーシアムからの拠出金と科学技術のオンタリオ大学院奨学金を受け取りました。 NVは、神経変性リピドミクス、ポストプロのフェローシップで老化研究所とCIHRのトレーニングプログラムを受け取ります。我々は感謝してAutoDesk社リサーチが提供する教育用ソフトウェアと技術サポートを認めます。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthansol | Reagent | Merck & Co. | ||
| Krazy Glue | Reagent | Home Hardware | ||
| VT1000S vibratome | Equipment | Leica Microsystems | ||
| Neural protease | Reagent | Sigma-Aldrich | P6141 | Stock solutions stored at -20°C |
| Papain | Reagent | Sigma-Aldrich | P4762 | Stock solutions stored at -20°C |
| DNAse I | Reagent | Roche Group | 11 284 932 001 | Stock solutions stored at -20°C |
| MZ6 Dissecting Microscope | Equipment | Leica Microsystems | ||
| ProBlot 6 Hybridization Oven | Equipment | Labnet International | ||
| Centrifuge 5702 | Equipment | Eppendorf | ||
| kPBS | Reagent | BioShop Canada | PBS404 | |
| B27 Supplement | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
| Ultra Low Binding Tissue Culture Dishes | Disposable | Corning | 3261 | |
| Human Epidermal growth Factor | Reagent | Invitrogen | 13247-051 | Stock solutions stored at -20°C |
| Fibroblast growth factor-2 | Reagent | Invitrogen | 13256-029 | Also known as basic fibroblast growth factor (bFGF) Stock solutions stored at -20°C |
| 37% formaldehyde (molecular grade) | Reagent | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Belly Dancer Shaker | Equipment | Stovall Life Sciences, IBI Sciences | ||
| Tissue- Tek Cryomold | Disposable | Sakura Finetek | 4566 | |
| Tissue-Tek OCT compound | Reagent | Sakura Finetek | 4583 | |
| Whatman Grade 703 Blotting Paper | Disposable | VWR international | 28298-020 | |
| CM1900 Cryostat | Equipment | Leica Microsystems | ||
| Polyclonal Anti-Cx29 Primary Antibody | Reagent | Kindly provided by Dr David Paul, Harvard Medical School | Stored 1:1 in glycerol at -20°C | |
| Cy3-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | Stored 1:1 in glycerol at -20°C | |
| H–chst 33258 | Reagent | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| DMRA2 epiflourescent microscope, Orca ER camera, OpenLab v3.56 | Equipment/ Software | Leica Microsystems | This protocol can be performed with any epifluorescent or confocal microscope. | |
| Photoshop CS4 | Software | Adobe | Graphic software | |
| Maya v10 | Software | Autodesk | Modeling software | |
| Computer | Equipment | Intel | Processor: Intel Corei7 920, Memory:12GB DDR3 Video card: Nvidia GTX 285 (1GB RAM) |
|
* All other standard chemical reagents listed in the protocol are from Sigma-Aldrich. All other standard tissue culture reagents are from Invitrogen. |
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References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
- Campos, L. S. Neurospheres: insights into neural stem cell biology. J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).
- Imbeault, S. The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells. BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).
