Proteína localização em Cultura de Células-tronco neurais 3D: uma Metodologia de visualização híbrida

Summary

Aqui, descrevemos a forma de produzir, expandir e pós-natal do hipocampo immunolabel células progenitoras neurais (NPCs), em três dimensões da cultura (3D). Em seguida, usando tecnologias de visualização híbrida, que demonstram como as imagens digitais de criosecções immunolabelled pode ser usado para reconstruir e mapear a posição espacial de células imuno todo o neurosphere 3D inteiro.

Abstract

A importância de 3-dimensional de topografia (3D) em influenciar-tronco neurais e de células progenitoras (NPC) fenótipo é amplamente reconhecido, mas desafiadoras para estudar. Quando dissociado do cérebro embrionário ou pós-natal, NPCs único proliferam em suspensão para formar neurospheres. Células-filhas dentro dessas culturas espontaneamente adotar distintas linhagens de desenvolvimento (neurônios, oligodendrócitos e astrócitos) ao longo de expansão, apesar de ser exposto ao mesmo meio extracelular. Esta progressão recapitula muitos dos estágios observados ao longo de neurogênese e gliogenesis no pós-natal do cérebro e é freqüentemente usado para estudar biologia básica NPC dentro de um ambiente controlado. Avaliação do impacto total da topografia 3D e posicionamento celular dentro dessas culturas sobre o destino NPC é, no entanto, difícil. Para localizar e identificar proteínas-alvo linhagens NPC por imunocitoquímica, de livre flutuação neurospheres devem ser semeadas em um substrato ou seccionados. Este tratamento é necessário para garantir permeabilização de células equivalentes e acesso de anticorpos ao longo da esfera. Como resultado, 2D imagens de epifluorescência de criosecções ou reconstruções 3D confocal de Z-stacks só pode fornecer informações espaciais sobre a posição da célula dentro discreto física ou digital 3D fatias e não visualizar a posição de celular na esfera intacta. Aqui, para reiterar a topografia da cultura neurosphere e permitir a análise espacial de expressão da proteína em toda a cultura inteira, apresentamos um protocolo para o isolamento, expansão e corte de série do pós-natal do hipocampo neurospheres adequado para imunodetecção de epifluorescência ou confocal de proteínas-alvo. Connexin29 (Cx29) é analisado como um exemplo. Em seguida, usando um híbrido de edição gráfica e modelagem 3D softwares aplicados rigorosamente para manter detalhes biológicos, que descrevem como re-montar o posicionamento 3D estruturais dessas imagens e digitalmente mapa células marcadas dentro do neurosphere completa. Esta metodologia permite a visualização e análise da posição celular de proteínas-alvo e células em toda a topografia cultura inteira 3D e irá facilitar uma análise mais detalhada das relações espaciais entre as células ao longo da neurogênese e gliogenesis in vitro.

Ambos Imbeault e Valenzuela contribuíram igualmente e devem ser considerados conjunta primeiros autores.

Protocol

1. Isolamento de células progenitoras neurais

Manter os tecidos e soluções frio em todos os momentos durante protocolo de isolamento!

1. Antes de iniciar suas culturas, preparar as soluções de ações a seguir:
   • Dissociação de mídia (26 mM NaHCO _3, 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,1 mM CaCl ₂ * 2H ₂ O, 3,2 mM MgCl ₂ * 6H ₂ O, 10 mM D-glucose, 100 U / mL de penicilina, 100 mg / mL estreptomicina filtro estéril e armazenar em 10-15 mL alíquotas a -20 ° C. Prepare as concentrações de estoque de enzimas usadas para celular dissociação em duplo H ₂ O destilada, filtro estéril e alíquotas armazenar a -20 ° C:. protease Neural (25 mg . / mL), papaína (10 mg / mL), DNAseI (10 mg / mL) No dia do experimento, adicionar enzimas para 15 mL de dissociação de mídia nas seguintes concentrações finais: 1 protease mg / mL, 0,1 mg / mL papaína, 0,1 mg / mL solução DNAse I. Dissecção contendo concentrações enzima final podem ser mantidos em gelo durante o processo de dissecção.
   • Manutenção Media: meio modificado Dulbecco Águia F12 (DMEM/F12), 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / mL, 1X suplemento B27. Pode ser mantido por até 3 meses a 4 ° C, sem suplemento B27 e até um mês a 4 ° C com B27 suplemento.
   • Fatores de crescimento: Preparar alíquotas de ações de 0,1 mcg / ml do fator de crescimento epidérmico humano recombinante (hEGF) e 10 mcg / mL fator de crescimento de fibroblastos-2 (FGF-2) em DMEM/F12 + 0,1% albumina sérica bovina (BSA). Armazenar a -20 ° C.
2. Para letalmente anestesiar C57BL / 6 filhotes de rato, os ratos são injectados intraperitonealmente com Euthansol pós-natal em dia 0-3.
3. Remova cuidadosamente os cérebros por dissecção padrão e armazenar em um prato de 60 milímetros contendo líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF: 26 mM NaHCO _3, 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl ₂ * 2H ₂ O, 1,3 mM MgCl ₂ * 6H ₂ O , 10 mM D-glucose, 100 U / mL de penicilina, estreptomicina 100 mg / mL). pH para 7,3, se necessário filtrar e estéril em 50 alíquotas mL, armazenar a -20 ° C.
4. Usando uma lâmina de barbear, o cérebro através da remoção do bloco cerebelo e cérebro cola com Krazy Glue, lado rostral, lado dorsal voltada para si, para o chuck vibratome. A Leica Microsystems VT1000S vibratome é usado neste protocolo.
5. Chuck posição no vibratome e adicione ACSF e gelo no compartimento apropriado.
6. Fatias de corte de 500 mm espessura usando uma velocidade entre 3,5-4,5 ea freqüência de 8,5.
7. Colete fatias contendo a formação do hipocampo em pratos contendo ACSF.
8. Usando um microscópio estereoscópico, remova hipocampo entre bregma milímetros -1,60 -2,40 e mm (até que a região CA3 começa a curva ventralmente) e coloque em um prato novo e seco (sem ACSF). A Leica MZ6 microscópio de dissecação é usado neste protocolo.
9. Uma vez que todos os hipocampos são coletados, mince tecido com um bisturi (até uma aparência homogênea e é obtida liquefeito).
10. Transferência de tecido picada a um tubo de polipropileno de 15 mL contendo 2,5 mL de mídia contendo protease dissociação neural, papaína e DNAse I (veja o passo # 1 para a preparação de solução). Observe se há uma grande quantidade de tecido de origem (por exemplo, de 6 filhotes) é uma boa idéia usar 2 frascos de 2,5 mL de dissociação da mídia para manter a enzima ideal: índice de tecido. Incubar a 37 ° C por 45-60 min com rotação. A Labnet ProBlot forno de hibridização 6 (adquirido através de Mandel Científica) é usado neste protocolo definido para definição de rotação 4.
11. Adicionar 10 mL de fosfato de potássio estéril de cultura de tecidos solução salina tamponada (KPBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, tampão fosfato 10 mM, pH 7,4) e centrifugar a 300 xg por 5 min. Uma centrífuga Eppendorf (modelo 5702) é usado neste protocolo.
12. Elimine o sobrenadante e ressuspender pellet em 5 mL de kpbs.
13. Dissociar tecido por trituração através de uma pipeta Pasteur.
14. Centrífuga suspensão de células a 300 xg por 5 min.
15. Ressuspender as células em 3 mL de meio de manutenção, contagem de células utilizando Trypan Blue e células placa em 60 milímetros não aderente pratos (pratos Corning Ultra-Baixa adesão de ligação são utilizados neste protocolo, consulte Materiais) com uma densidade de 2,5 x 10 ⁵ células / prato em 5 mL de meio de manutenção. Placas de Petri pode ser usado no lugar de pratos Ultra-Baixa adesão, mas culturas exigirá a ser explorado pela manhã e à tarde todos os dias durante a expansão para os primeiros seis dias in vitro (DIV) para evitar revestimento e diferenciação espontânea.
16. Adicionar hEGF para uma concentração final de 20 ng / mL e FGF-2 para uma concentração final de 10 ng / mL imediatamente após o plaqueamento. Adicionar fatores de crescimento adicional a cada dois dias durante a fase de expansão até o dia coleção em DIV 14. (Barras Escala em vídeo de neurospheres expansão representam 100 mm.)

** Nota: A mídia pode tornar-se amarela ao redor DIV 10 da fase de expansão. Se isso ocorrer, adicionar outro 1 mL Maintenance mídia. Se a mídia é novamente amarela no dia seguinte, adicione 1 mL de uma outra mídia Manutenção - continuar fazendo isso como necessário durante a sua fase de expansão - não se esqueça de ajustar o volume de fatores de crescimento de acordo para manter as concentrações corretas final.

2. Cryosectioning Serial

1. Toque suavemente neurospheres antes da fixação para garantir esferas são bem separados no momento da fixação.
2. Adicionar formaldeído de grau molecular diretamente para as culturas para uma concentração final de 3,7% e incubar à temperatura ambiente (RT) por 20 min com agitação lenta. A Belly Dancer Stovall é usado neste protocolo definido para uma velocidade de rotação de 2,5.
3. Neurospheres coletar em um tubo de polipropileno de 15 mL e spin down a 300 xg por 5 min.
4. Elimine o sobrenadante e ressuspender sedimento em 10 mL de fosfato de sódio solução salina tamponada (NPBs: 154 mM NaCl, 10 mM tampão fosfato). Observe a mudança no uso da solução de KPBS para NPBs.
5. Girar a 300 xg por 5 min.
6. Ressuspender em sacarose 5-10 ml a 20% (w / v) em solução NPBs.
7. Mantenha neurospheres a 4 ° C durante pelo menos 24 h para cryoprotect culturas.
8. Preencher uma cryomold descartáveis ​​com Optimal Composto de corte de temperatura (OCT).
9. Delicadamente despeje a solução de sacarose contendo neurospheres em um prato.
10. Use um estereomicroscópio para localizar esferas representativas de vários tamanhos com a menor evidência de perturbação mecânica. Ao realizar este procedimento pela primeira vez, algumas culturas podem ser quebradas ou rasgadas. Morfologia será muito bem mantida com a prática.
11. Aspirar cuidadosamente cada neurosphere-se em um 1 mL pipeta ponta (manter o volume de sacarose contendo solução removido para um mínimo) e colocá-lo no composto outubro Marcar sua localização aproximada no molde para que você possa encontrar as esferas mais tarde.
12. Depois de ter colocado um pouco nas esferas cryomold, flash-congelar as amostras usando CO ₂ até outubro é branco.
13. Marca a localização do seu esferas do cubo e pop ao cubo para fora do molde
14. Utilizando pré-refrigerados fórceps, coloque o cubo em um pedaço de papel de filtro previamente presa a um mandril com outubro
15. Lugar mais composto outubro em todo o cubo e congelar a aderir o bloco contendo as esferas usando CO _2. Alternativamente coloque o mandril (com filtro de papel) no criostato, composto de outubro esguicho em papel filtro, e cubo diretamente no local outubro Esperar até outubro é branco e duro. A Leica CM1900 criostato é usado neste protocolo.
16. Uma vez que o composto outubro torna-se branco, você pode colocar o chuck para o bloco de corte, em seguida, aguarde pelo menos 30 min para que a temperatura atinja o equilíbrio.
17. Corte de série 10 seções M olhando para fora para suas marcas e verificação, muitas vezes sob um microscópio para seções neurosphere. Lugar como muitas seções como você pode em um slide. Note que você pode não ser capaz de ver as fatias primeiros de sua neurosphere no âmbito, de modo coletar todas as seções até ver as células e manter o 3-5 seções antes deste início e no final da sua esfera. Estas seções anteriores e posteriores também serão processados ​​por imunocitoquímica. A contracorante nuclear ao realizar imunocoloração é, portanto, fundamental uma vez que irá permitir que você para detectar células individuais nos pólos neurosphere não facilmente perceptível sob microscopia de fase padrão invertido.
18. Seções armazenar a -20 ° C.

3. Imunocitoquímica

1. Retirar as lâminas de -20 ° C e descongelar aplicando NPBs suavemente sobre todas as seções e incubar à temperatura ambiente por 5 min.
2. Flick off NPBs excesso e aplicar imediatamente o anticorpo primário diluído em Ab-tampão (0,3% Triton X-100, soro albumina bovina 0,3% em NPBs, pH 7,2). Você vai precisar de ~ 100 mL por slide. Neste protocolo, localizar Cx29 na progênie NPC discreta presente na cultura neurosphere 3D.
3. Cubra com parafilme corte para cobrir as seções, mas não exceder o tamanho da lâmina de microscópio como anticorpo serão atraídos para fora do slide por osmose se o parafilme atinge ou ultrapassa a largura do slide. O parafilme vai evitar a evaporação. Incubar overnight a 4 ° C em câmara úmida. Tome cuidado para flutuar o parafilme sobre as seções e não permitir que ele a aderir ao slide. No entanto, não retirar ou alterar a colocação parafilme uma vez aplicado como é preciso ter cuidado para não aplicar qualquer força de cisalhamento nas seções e, assim, interromper a morfologia.
4. Adicionar NPBs ~ 1 mL diretamente para as seções e flutuar fora do parafilme. Alternativamente, coloque o slide verticalmente diretamente em um frasco coplin até o parafilme flutua para longe. Não remova o parafilme até que flutua para longe de forma independente de manipulação como você pode perturbar a estrutura neurosphere frágil. Uma vez que o parafilme está fora do slide, incubar 5 min à temperatura ambiente. Flick off NPBs e continuar com mais 3 lavagens na RT por 5 min.
5. Aplicar anticorpo secundário diluído em tampão Ab e incubar à temperatura ambiente por 1h em câmara úmida, conforme descrito acima. Você vai voltar a exigir ~ mL 100 / slide.
6. Repita lava NPBs no passo 4. Aplicar um contracorante nuclear na 3 ^ª lavagem (Hoechst 33258 0,5 mg / mL em NPBs) por 5 min e prossiga com a lavagem final por 5 min à temperatura ambiente.
7. Monte a sua preferida anti-fade meios de montagem e lamínula, garantindo a lamela com a primeira nailpolish nos cantos, em seguida, todas as bordas para evitar a perda (se estiver usando uma mídia baseada em glicerol).
8. Proceder à recolha de imagem usando um microscópio de epifluorescência ou confocal. Neste protocolo, usamos um DMRA2 Leica, uma câmera de Hamamatsu Orca ER, e OpenLab software v3.56. Neste exemplo, as imagens são capturadas em três canais: (1) de contraste de fase, (3) Azul UV (Leica A4 cubo: Filtro de combinações Ex 360/40, Di 400, Sp BP470/40) e Vermelho (Leica Y3 cubo : combinações de filtro Ex BP535/50, Di 565, Sp 610/75). Atire cada seção de série prestando muita atenção a primeira ea última seções seguindo os pólos usando Hoechst 33258 rotulagem de DNA onde detecção de fase de células individuais é difícil.

4. Alinhamento

1. Quando o criosecções são-descongelamento montado no microscópio linhas, eles vão mover e girar muito ligeiramente. Estes desvios devem ser corrigidos. Além disso, quando cada seção de série é digitalizado, o centro de cada imagem não pode ser no mesmo local na tela. Como resultado, cada seção digitalizados série deve ser cuidadosamente realinhados com a seção anterior para preservar a morfologia precisas. Esse alinhamento exige uma atenção cuidadosa e precisa para citoarquitetura e detalhes topográficos.
2. Imagens de série de cada canal e barras de escala residente de 10 mm e 50 mm (criado em OpenLab software v3.56) são salvos como arquivos TIFF individuais e importados para o Photoshop CS4 usando um tamanho de tela padrão de 3300 x 2550 pixels e uma resolução de 72 pixels / polegada. Muita atenção ao tamanho da tela deve ser tomada neste importação para manter uma escala precisa. O tamanho da tela e resolução são essenciais para a modelagem subseqüente em Maya. A barra de escala, salvo como uma camada separada no Photoshop, deve ser usado para verificar que nenhuma mudança para as dimensões XY ocorre durante o alinhamento no Photoshop.
3. Em seguida, ligar os três (ou mais) camadas correspondentes à mesma seção (ou seja, link de cada fase, UV, e Cy3 série de imagens para cada seção). Isto assegura que quando uma camada está alinhado, outras camadas associado a essa secção são também alinhados ao mesmo tempo. Alternativamente, você pode bloquear a camada fase uma vez na posição adequada (ver abaixo) e em seguida, alinhe as camadas associadas de que a seção para a camada de fase.
4. Para começar, faça todas as camadas invisíveis, clicando no "olho" ícone na janela de camadas.
5. Por sua vez as imagens da primeira fase e segunda contraste das seções neurosphere serial clicando no "olho" ícones na janela de camadas. Aumentar a transparência da segunda seção. Sob a "Imagem" guia, abra "rotação de imagem" e escolha "arbitrária". Gire a segunda secção até que sejam capazes de identificar pontos de contiguidade geométricas e estruturais entre as imagens. É útil para comparar frente e para trás com o canal UV (Hoechst 33258 marcado seções).
6. Repita o procedimento para todas as seções de série comparar "vizinhos mais próximos" (isto é, a seção de imediato com a seção anterior imediata posterior) até que todas as seções e todos os canais são alinhados com precisão.
7. Criar um avião em Maya v10 que é da mesma proporção que o arquivo de Photoshop.

5. Tipologia celular

1. A partir da linha de status da interface de usuário do Maya, mudar a barra de menu de sua configuração padrão Animation para superfícies.
2. Use uma esfera subdivisão primitivos para criar o corpo celular.
3. Com o neurosphere selecionado, começar a manipular seus vértices clicando no botão direito do mouse sobre o objeto e selecionando Vertex a partir do Menu de marcação. Aprofundar a superfície da esfera, alterando o nível de exibição a partir do Menu de marcação.
4. A partir da guia Superfícies de Subdivisão do menu principal, abra a caixa de opções Recolher hierarquia e definir o número de níveis para 2. Colapso da esfera.
5. Mudar a barra de menu a partir de superfícies de polígonos.
6. Com a esfera selecionada, abra a ferramenta Sculpt Geometria a partir da guia de Malha do menu principal.
7. Refinar a superfície da célula para sua forma final empregando o conjunto de ferramentas Geometria Sculpt a partir da guia Configurações Tool.
8. Repita esse processo para criar corpos celulares diferentes para simular a variedade de NPCs e apresentar NPC progênie na neurosphere. Nesta demonstração, dez corpos celulares diferentes formam a base para o neurosphere.
9. Selecione a tipologia celular e Transformações Freeze.
10. Com as células de sua tipologia estabelecida, dois shaders superfície será concebida para representar ambas as células expressandoa proteína de interesse (no nosso exemplo Cx29 células positivas) e as células onde a proteína está ausente. Aqui, qualquer célula com imunorreatividade Cx29 Cx29 é designado positivo. Neste exemplo, a localização subcelular não é modelado, embora tal análise é possível com modificações para os shaders.
11. Abra a janela do Hypershade> guia Renderização Editores Windows do menu principal.
12. Escolha um Shader de rampa a partir da guia Materiais de superfície.
13. Abra o Editor de atributo e definir a cor shaders, Incandescence, cor Ambient, Bump Map, e os atributos de cor Specular.
14. Atribuir uma textura Browniano em 3D para o nó cor Ambient e uma textura Fractal 2D para o nó de Mapeamento Bump.
15. Selecione a entrada shaders resultante e Conexões de Saída e exportação da rede selecionada.
16. Selecione a tipologia celular e abrir a caixa de seleção Exportar opções.
17. Escolha o tipo de arquivo mayaAscii e desmarque a caixa Incluir estas entradas. Seleção de exportação.

6. Mapeamento de células

1. Abra o arquivo alinhados cortes seriados no Photoshop CS4.
2. Estabelecer uma chave de traços de lápis para marcar a localização de cada célula progenitora nas seções de série. Nesta demonstração, uma chave de três cursos - um quadrado sólido, um quadrado com uma linha tracejada, e um quadrado com uma cruz - será usado para indicar se uma célula está localizado em uma, duas ou três seções. Esta chave de acidentes vasculares cerebrais é ainda definido pela cor - neste exemplo, o vermelho representa células expressando nossa proteína de interesse, Cx29 e branco representa células não expressar Cx29.
3. Gire a camada fase e iniciar a marcação no centro de cada célula progenitora com um traço de lápis branco. Use uma camada separada dentro da pasta seção com a qual construir seus mapas.
4. Alternar entre as seções para localizar a posição células assegurar que as células em mais de uma seção são devidamente indicados.
5. Com a camada Cx29 ligado, selecione as células que caem nas regiões onde Cx29 é expressa de forma positiva.
6. Escolha o comando Preencher a partir da guia Editar da barra de menu principal do Photoshop e mudar os traços branco ao vermelho.
7. Com os mapas concluído, salvar cada seção como uma imagem jpeg em separado na pasta sourceimages do projeto Maya. Para fazer isso, um novo projecto Maya tem que primeiro ser criado.

7. Importação e montagem Mapas em 3D

1. A partir da linha de status da interface de usuário do Maya, mudar a barra de menu de sua configuração padrão para Animação polígonos.
2. Importar os arquivos planes.mb e scaleBar.mb da pasta cenas projetos.
3. Com o plano selecionado, atribua um shader Lambert, clicando no botão direito do mouse sobre o objeto e abrir o separador Assign Material Novo.
4. No Editor de Atributo clique na caixa de xadrez para a direita do atributo cor dos materiais.
5. A partir do menu pop-up, escolha Arquivo da seção Texturas 2D.
6. Sob a seção Atributos de arquivos no Attribute Editor, clique no ícone do arquivo para a direita do atributo Nome da imagem.
7. Escolha a primeira seção da pasta sourceimages.
8. O interruptor da janela Workspace do ponto de vista de perspectiva para a exibição Top padrão ortográfico, abrindo a guia Panels.
9. Selecione a ferramenta Create Polygon a partir da guia de Malha do menu principal e traçar o contorno da secção.
10. Escolha o primeiro mapa da pasta sourceimages e atribuí-lo ao plano do polígono recém-criado seguindo os passos estabelecidos para criar o plano do polígono.
11. Com o objeto selecionado, escolha UV a partir do Menu Marcação clicando no botão direito do mouse sobre o plano.
12. Selecione todos os pontos de aviões UV e abrir o Editor de textura UV a partir da guia do Windows do menu principal.
13. Dimensionar a proporção do UV para adequar o plano de seção.
14. Repita esse processo para cada seção do neurosphere assegurar que os espaços entre cada seção correspondem à altura da barra de escala.

8. Localizando Tipologias de células progenitoras em 3D

1. A partir da linha de status da interface de usuário do Maya, mudar a barra de menu do seu Animation configuração padrão para Dynamics.
2. Deixando apenas a primeira seção do neurosphere visível, oculte todas as outras seções alterando as configurações de vídeo na guia de exibição do menu principal.
3. Com caixa de ferramenta Curva CV de opções abertas, selecione uma das configurações Linear Curve CV.
4. Vendo a cena da câmera vista de cima, começar a atribuir pontos aos mapas célula, criando uma curva para as células Cx29-negativo e um para as células Cx29 positivo.
5. As curvas resultantes são flat quando visto de uma câmera de visão lateral. Estabelecer a espessura das seções, deslocando os pontos da curva no eixo y usando a barra de escala importados a partir das imagens de microscopia como um guia.
6. Repita esse processo para cada seção do neurosphere.
7. Importar o arquivo da pasta cellTyoplogy.ma cenas do projeto e duplicar a tipologia celular tanto para as células Cx29 Cx29-negativas e positivas dentro da neurosphere.
8. Abra a janela do Hypershade> guia Renderização Editores Windows do menu principal.
9. Importar os shaders previamente construída atribuindo-lhes para as células da tipologia.
10. A partir da janela Outliner, retire o nome do arquivo do começo dos objetos importados. Isso vai se tornar importante em fases posteriores do processo de modelagem.
11. Selecione a guia partículas a partir do menu principal e criar um emissor de partículas para a Curva de CV em primeiro lugar.
12. Abra a aba particleShape1 e em Atributos Emissão mudança do Conde Max de -1 para o número de pontos na sua primeira curva.
13. Na renderização Atributos guia alterar o tipo de renderização de partículas de Superfície Silva (s / w). Clique na caixa atual de renderização Digite abaixo e alterar o raio das partículas de 0,010.
14. Anexar as partículas para os vértices da curva, seleccionando primeiro as partículas então mudar a seleção da curva. Abrir as opções Meta de dentro do separador de partículas do menu principal e definir a meta de peso para 1. Clique em Criar.
15. Selecione as células a partir do número 1 a 10 em ordem na janela e abrir o Outliner Instancer (Reposição) caixa de opções da guia Partículas do menu principal. Na caixa Objetos Instância, todas as dez células devem ser listados em ordem.
16. Escolha o nome correto particleShape da lista drop-down do objeto de partículas para a guia Instância. Clique em Criar.
17. Por padrão, apenas a primeira célula que foi selecionada irá substituir as partículas ao longo da curva. A fim de obter todos os dez tipos de aparecer e ciclo aleatoriamente entre as partículas, uma expressão é necessária. A segunda expressão irá garantir que as células emitem aleatoriamente da mesma forma que toda vez que a Faixa de Slider é reposicionado.
18. Com o emissor selecionado, abrir o Editor de Atributo. Na guia particleShape, sob atributo dynamic Adicionar clique na caixa geral. Em Nome do longa escrever random_index. Chave de Atributo Tipo de escalar a partícula Per (matriz) e bateu Adicionar.
19. No Particle Per (Array) Atributos guia, uma caixa de random_index foi adicionado. Ao clicar no botão direito do mouse sobre o espaço vazio, selecione Criar Expressão ... a partir da caixa suspensa.
20. Digite o texto a expressão: box - particleShape1.random_index = rand (10); if (particleShape1.particleId == 1) semente (1);
21. Para completar a expressão abrir o Instancer (Substituição Geometry) guia no Editor de Atributo e em Geral> Objeto opções de índice random_index selecione na lista suspensa. Trazer o regulador de tempo para o primeiro quadro e bateu jogar, os tipos de células são agora distribuídos aleatoriamente entre as partículas.
22. Repita esse processo para cada seção do neurosphere. Garantir que cada índice emissor novo, instancer e aleatório é diferenciada pelo nome e organizado de forma adequada na Janela Outliner.

9. Renderização / Compositing

1. Na seção de renderização Usando da janela Render Settings, mude o renderizador de software Maya para o mental ray.
2. Abra a guia Qualidade e sob Raytracing mudar a configuração para Reflexões zero. Abra a aba Framebuffer e alterar o Colorclip de premultiply Raw para Alpha e desmarque.
3. Abra o Editor do Canal Box / Layer e altere a configuração editor da camada de exibição para Render.
4. Selecione as células importadas da tipologia e clique no botão Criar nova camada e atribua ícone de objetos selecionados.
5. Renomeie a camada oclusão de ambiente.
6. Ao clicar no botão direito do mouse sobre a camada recém-criada, selecione Atributos do menu.
7. À direita da caixa de renderLayer, clique no botão Presets e selecione Oclusão da lista suspensa.
8. Selecione a guia mib_amb_occlusion1 e alterar a amostras 16-256.
9. Reabrir o Canal Editor de Caixa / Layer e sob a guia Opções, abra a caixa de todas as camadas de renderização opções.
10. Selecione Composite e manter camadas.
11. Com a camada ambientOcclusion selecionado, mude de Normal para Multiply da caixa suspensa logo acima da lista de camadas.
12. Tornar duas passagens do neurosphere, uma vez que com a camada ambientOcclusion ligado e uma vez com o masterLayer ligado. Guardar as imagens como arquivos sse na pasta de imagens projetos.
13. Abra as duas imagens no Photoshop CS4. Coloque a camada ambientOcclusion em cima do masterLayer e configurá-lo para o Multiply. Criar um fundo e achatar a imagem.

Discussion

Este protocolo descreve um procedimento para a cultura e em série cryosection pós-natal do hipocampo NPCs, localizar a expressão da proteína por imunodetecção e, finalmente, reconstruir e analisar a posição topográfica de células imuno dentro do neurosphere inteira 3D. Através da combinação de cultura de células de biologia e técnicas de processamento, a imagem de microscopia (OpenLab, Improvisação e softwares de análise de imagem), capacidades de edição gráfica software (Adobe Photoshop), e animação 3D e capacidades software de composição (Autodesk Maya), apresentamos uma metodologia para reconstruir a composição celular de culturas inteiras 3D a partir de série de imagens 2D permitindo a reconstrução fiel da posição celular e expressão da proteína em toda uma cultura neurosphere. Este protocolo pode ser combinado com a mesma eficácia para o registro e reconstrução de epifluorescência finos cortes seriados ou confocal Z-stacks através de cortes seriados mais grosso. Porque a expansão clonal dos NPCs único recapitula cultura neurosphere muitos dos estágios observados ao longo de neurogênese e gliogenesis no pós-natal do cérebro, o impacto de sua estrutura 3D representa um determinante importante destino NPC na progênie expostos ao mesmo meio experimental ^1. Divergência na linhagem e expressão da proteína no centro e na periferia das seções neurosphere série sugere que múltiplos fatores físicos, incluindo a posição da célula, stress mecânico, ea força de cisalhamento desempenham um papel importante na regulação do NPC biologia ^2. Além disso, a expressão da proteína conexina, aqui analisados, foi mostrado para mudar dependendo de quando NPCs são cultivadas como neurospheres 3D em suspensão ou revestida sobre um substrato de laminina com a comunicação mediada por conexina funcionais alteradas se as células são cultivadas em substrato de plástico e ou em 3D grátis flutuante culturas ^3. O impacto da posição celular no NPC destino permanece incerto. É um desafio técnico para analisar o impacto de localização espacial dentro da cultura em 3D sobre a biologia NPC dado que a avaliação antigênica de linhagem e proteínas de sinalização exige a interrupção da arquitetura 3D para habilitar permeabilização celular e acesso a todas as células de anticorpos. Aqui, nós mostramos que uma metodologia de visualização híbrida fornece um meio de determinar se certas proteínas exibem única localizações na cultura posicional 3D, pode ser usado para inferir e testar a função da proteína e regulamentação no que diz respeito à localização regional no âmbito da neurosphere, e, talvez o mais importante , fornece os dados de posicionamento necessárias para estudar o impacto da topografia 3D e posicionamento celular sobre o destino NPC na cultura 3D.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Euthansol	Reagent	Merck & Co.
Krazy Glue	Reagent	Home Hardware
VT1000S vibratome	Equipment	Leica Microsystems
Neural protease	Reagent	Sigma-Aldrich	P6141	Stock solutions stored at -20°C
Papain	Reagent	Sigma-Aldrich	P4762	Stock solutions stored at -20°C
DNAse I	Reagent	Roche Group	11 284 932 001	Stock solutions stored at -20°C
MZ6 Dissecting Microscope	Equipment	Leica Microsystems
ProBlot 6 Hybridization Oven	Equipment	Labnet International
Centrifuge 5702	Equipment	Eppendorf
kPBS	Reagent	BioShop Canada	PBS404
B27 Supplement	Reagent	Invitrogen	17504-044
Ultra Low Binding Tissue Culture Dishes	Disposable	Corning	3261
Human Epidermal growth Factor	Reagent	Invitrogen	13247-051	Stock solutions stored at -20°C
Fibroblast growth factor-2	Reagent	Invitrogen	13256-029	Also known as basic fibroblast growth factor (bFGF) Stock solutions stored at -20°C
37% formaldehyde (molecular grade)	Reagent	Sigma-Aldrich	F8775
Belly Dancer Shaker	Equipment	Stovall Life Sciences, IBI Sciences
Tissue- Tek Cryomold	Disposable	Sakura Finetek	4566
Tissue-Tek OCT compound	Reagent	Sakura Finetek	4583
Whatman Grade 703 Blotting Paper	Disposable	VWR international	28298-020
CM1900 Cryostat	Equipment	Leica Microsystems
Polyclonal Anti-Cx29 Primary Antibody	Reagent	Kindly provided by Dr David Paul, Harvard Medical School		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
Cy3-conjugated donkey anti-rabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
H–chst 33258	Reagent	Sigma-Aldrich	861405
DMRA2 epiflourescent microscope, Orca ER camera, OpenLab v3.56	Equipment/ Software	Leica Microsystems		This protocol can be performed with any epifluorescent or confocal microscope.
Photoshop CS4	Software	Adobe		Graphic software
Maya v10	Software	Autodesk		Modeling software
Computer	Equipment	Intel		Processor: Intel Corei7 920, Memory:12GB DDR3 Video card: Nvidia GTX 285 (1GB RAM)
* All other standard chemical reagents listed in the protocol are from Sigma-Aldrich. All other standard tissue culture reagents are from Invitrogen.