Локализация белка в 3D нейронные культуры стволовых клеток: Гибридные Методология Визуализация

Summary

Здесь мы описываем, как производить, расширять и immunolabel послеродовой гиппокампа нейронных клеток-предшественников (НПК) в трехмерной (3D) культуры. Далее, используя гибридные технологии визуализации, мы показали, как цифровые изображения immunolabelled cryosections может быть использован для реконструкции и карта пространственного положения иммунопозитивных клетки на протяжении всего neurosphere 3D.

Abstract

Важность 3-мерные (3D) топографии в формировании нейронных стволовых и клеток-предшественников (NPC) фенотип широкое признание еще сложных для изучения. При отрыве от эмбриона или послеродовой мозга, один НПС будут распространяться в виде суспензии для формирования нейросферы. Дочь клеток в этих культурах спонтанно принимать различные развитием линий (нейроны, олигодендроциты и астроциты) в течение расширения несмотря на то, подвержены тем же внеклеточной среде. Эта прогрессия повторяет многие из этапов наблюдается в течение нейрогенеза и gliogenesis в послеродовой мозга и часто используется для изучения фундаментальной биологии NPC в контролируемой среде. Оценка полное влияние 3D топографии и клеточной позиционирование в рамках этих культур на NPC судьбы, однако, трудно. Для локализации белков-мишеней и определить NPC линий по иммуноцитохимия, свободно плавающих нейросферы должны быть покрыты на подложке или последовательно секционного. Такая обработка необходима для обеспечения эквивалентного пермеабилизации клеток и антител доступа на всей территории области. В результате, 2D epifluorescent образы cryosections или конфокальной реконструкции 3D-Z-стеки могут обеспечить только пространственную информацию о ячейке позиции в дискретных физических или цифровых 3D ломтиками и не визуализировать сотовой позиции в нетронутой сферой. Здесь вновь топографии neurosphere культуры и разрешить пространственный анализ экспрессии белка в течение всего культура, мы представляем протокол для изоляции, расширение, и серийный секционирования послеродовой гиппокампа нейросферы подходит для epifluorescent или конфокальной иммунодетекции белков-мишеней. Connexin29 (Cx29) анализируется в качестве примера. Далее, используя гибрид графического редактирования и 3D моделирования программного обеспечения строгого применения для целей сохранения биологического подробно мы расскажем, как повторно собрать 3D структурных позиционирование этих изображений и цифровой карте меченых клеток в полной neurosphere. Эта методика дает возможность визуализации и анализа сотовой положение целевых белков и клеток в течение всего 3D топография культуры и будет способствовать более детальный анализ пространственных отношений между клетками в течение нейрогенеза и gliogenesis в пробирке.

Оба Imbeault и Валенсуэла способствовали в равной степени и должны быть рассмотрены совместные первых авторов.

Protocol

1. Выделение нейронные клетки-предшественники

Держите салфетки и растворов холодным в течение всего времени изоляции протокол!

1. Перед началом вашей культуры, подготовить следующие решения складе:
   • Диссоциация СМИ (26 мМ NaHCO _3, 124 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 0,1 мМ CaCl ₂ * 2H ₂ O, 3,2 мМ MgCl ₂ * 6H ₂ O, 10 мМ D-глюкоза, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл . стрептомицин Стерильный фильтр и хранят в 10-15 мл аликвоты при -20 ° С. Подготовка акции концентрации ферментов, используемых для сотовых диссоциации в бидистиллированной H ₂ O, стерильный фильтр и хранить аликвоты при -20 ° C: Нейронные протеазы (25 мг . / мл), папаин (10 мг / мл), DNAseI (10 мг / мл) в день эксперимента, добавлять ферменты 15 мл Диссоциация СМИ на следующих конечных концентраций: 1 мг / мл протеазы, 0,1 мг / мл папаин, 0,1 мг / мл ДНКазы I. Препарирование раствор, содержащий конечные концентрации фермента могут быть сохранены на льду во время вскрытия процесса.
   • Техническое обслуживание СМИ: средняя Дульбеко изменение Орла F12 (DMEM/F12), 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 1X B27 добавки. Может храниться до 3 месяцев при температуре 4 ° С без B27 дополнения и до одного месяца при температуре 4 ° С, В27 добавки.
   • Факторы роста: Подготовка акции аликвоты 0,1 мкг / мл человеческого рекомбинантного эпидермального фактора роста (hEGF) и 10 мкг / мл, фактор роста фибробластов-2 (FGF-2) в DMEM/F12 + 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА). Хранить при -20 ° C.
2. Чтобы смертельно обезболить C57BL / 6 щенков мыши, мыши вводят внутрибрюшинно Euthansol на послеродовой день 0-3.
3. Осторожно выньте мозги стандартными рассечение и храните в 60 мм блюда, содержащие искусственные спинномозговой жидкости (ACSF: 26 мМ NaHCO _3, 124 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl ₂ * 2H ₂ O, 1,3 мМ MgCl ₂ * 6H ₂ O , 10 мМ D-глюкоза, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина). рН до 7,3 в случае необходимости и стерильный фильтр в 50 мл порциями, хранить при температуре -20 ° C.
4. Использование лезвие бритвы, блок мозга путем удаления мозжечка и клей мозга с Krazy Glue, ростральной стороной вверх, спинной стороной к себе, на vibratome патрон. VT1000S Leica Microsystems vibratome используется в данном протоколе.
5. Позиция патрон в vibratome и добавить ACSF и льда в надлежащее отсеков.
6. Вырезать ломтиками толщиной 500 мкм использованием скорости между 3.5-4.5 и частоту 8.5.
7. Сбор ломтиками содержащие гиппокампа в блюдах, содержащих ACSF.
8. Использование стереомикроскопа, удалить гиппокампе между брегмы -1,60 мм и -2,40 мм (до СА3 регионе начинает кривой вентрально) и поместить в новый сухой блюдо (без ACSF). Leica MZ6 рассекает микроскоп используется в данном протоколе.
9. После того как все гиппокампе собираются, фарш ткани скальпелем (до однородной и сжиженного вид достигается).
10. Передача измельченной ткани в 15 мл полипропиленовые трубки, содержащей 2,5 мл Диссоциация средах, содержащих нейронных протеазы, папаин, и ДНКазы I (см. шаг № 1 для приготовления раствора). Обратите внимание, если есть много источников ткани (например, из 6 щенков) это хорошая идея использовать 2 флакона 2,5 мл диссоциации средств массовой информации для поддержания оптимального фермента: ткани отношение. Инкубировать при 37 ° С в течение 45-60 мин с вращением. LABNET ProBlot 6 гибридизации печи (приобретены через Мандель Scientific) используется в этом значение протокола вращения установки 4.
11. Добавьте 10 мл стерильного фосфат калия культуре ткани буферного раствора (Кбит: 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,4) и центрифуги при 300 мкг в течение 5 мин. Центрифуга Eppendorf (модель 5702) используется в этом протоколе.
12. Удалите супернатант и ресуспендируйте гранул в 5 мл Kpbs.
13. Диссоциируют ткани растиранием через пипетку Пастера.
14. Центрифуга клеточной суспензии при 300 мкг в течение 5 мин.
15. Ресуспендируют клетки в 3 мл обслуживание среды, подсчет клеток с использованием Голубой Трипан и пластины ячейки в 60 мм не соблюдают блюда (Corning Ultra-Low соблюдение обязательных блюд, используемые в настоящем протоколе, см. материалы) с плотностью 2,5 · 10 ^{5 клеток} / блюдо в 5 мл обслуживания среды. Чашки Петри может быть использован вместо Ultra-Low блюда приверженности но культурами потребует должно быть задействовано в утренние и дневные каждый день при расширении в течение первых 6 дней в пробирке (DIV), чтобы предотвратить покрытие и спонтанной дифференцировки.
16. Добавить hEGF до конечной концентрации 20 нг / мл и FGF-2 в конечной концентрации 10 нг / мл сразу же после покрытия. Добавить дополнительные факторы роста каждые два дня во время фазы расширения до коллекцию день на DIV 14. (Масштаб баров в видео расширения нейросферы представляют 100 мкм.)

** Примечание: средства массовой информации может стать желтой вокруг DIV 10 из фазы расширения. Если это произойдет, добавьте еще 1 мл Maintenance СМИ. Если СМИ вновь желтый следующий день, добавить еще 1 мл технического обслуживания средств массовой информации - продолжать делать это по мере необходимости во время фазы расширения - не забудьте отрегулировать громкость факторов роста, соответственно для поддержания правильной конечной концентрации.

2. Последовательный Cryosectioning

1. Нажмите нейросферы мягко до фиксации для обеспечения сферы хорошо разделенных на момент фиксации.
2. Добавить молекулярной класс формальдегида непосредственно к культурам, чтобы конечная концентрация 3,7% и инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 20 минут с медленным встряхивания. Танцовщица живота Стовалл используется в этом значение протокола скорость вращения 2.5.
3. Сбор нейросферы в 15 мл полипропиленовые трубы и спином вниз со скоростью 300 мкг в течение 5 мин.
4. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл фосфат натрия буферного раствора (nPBS: 154 мМ NaCl, 10 мМ фосфатного буфера). Обратите внимание на изменения в решение от использования Kpbs к nPBS.
5. Спином вниз со скоростью 300 мкг в течение 5 мин.
6. Ресуспендируют в 5-10 мл 20% сахарозы (вес / объем) раствор в nPBS.
7. Держите нейросферы при 4 ° С в течение не менее 24 ч до cryoprotect культур.
8. Заполните одноразовые cryomold с оптимальной температуры резания (ОКТ) Соединение.
9. Аккуратно вылить раствор, содержащий сахарозу нейросферы в блюдо.
10. Используйте стереомикроскопа, чтобы найти представителя сфер различных размеров с наименьшими доказательств механическое разрушение. При выполнении этой процедуры в первый раз, некоторые культуры могут быть сломаны или порвана. Морфология будет хорошо поддерживаться с практикой.
11. Аккуратно аспирата каждого neurosphere вверх в 1 мл пипетки (сохранить объем сахарозы содержащие-раствор удаляют до минимума) и поместите его в соединения октября Марк ваше приблизительное местоположение на плесень, таким образом Вы можете найти сферах позже.
12. Как только вы разместили несколько сфер в cryomold, флэш-замораживания образцов с использованием CO ₂ до октября белый.
13. Марк местоположение вашего сферы на куб и поп-кубе из формы
14. Использование предварительно охлажденным пинцетом, место куба на кусочек фильтровальной бумаги ранее закреплен на патрон с октября
15. Уделить больше октябре соединения вокруг куба и заморозить придерживаться блок, содержащий сфер использования СО _2. Кроме место патрон (с фильтровальной бумагой) в криостате, шприц соединения октября на фильтровальную бумагу и поместите куб непосредственно в октябре Подождите, пока октябре белый и твердый. Leica CM1900 криостат, используемые в настоящем протоколе.
16. Как только соединение октября становится белым, Вы можете разместить патрон на передний блок, то подождите не менее 30 мин для температуры, чтобы уравновесить.
17. Вырезать серийный 10 мкм разделы глядя на ваши знаки и проверки часто под микроскопом на neurosphere разделов. Место возможно создание разделов, как вы можете на одном слайде. Обратите внимание, вы не сможете увидеть первые несколько ломтиков ваш neurosphere под сферу, поэтому собрать все разделы, пока не увидите клеток и держать 3-5 разделов перед этим начале и в конце вашей сфере. Эти переднего и заднего отделов также будут обрабатываться для иммуноцитохимия. Ядерной контрастирующая при выполнении иммуноокрашивания Поэтому ключевым, поскольку он позволит вам обнаружить отдельные клетки в neurosphere полюсов не является очевидной при стандартных перевернутую фазовая микроскопия.
18. Магазин разделы при температуре -20 ° C.

3. Иммуноцитохимическая

1. Удалить слайды от -20 ° С и оттаивания, применяя nPBS мягко по всем разделам и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
2. Флик лишнюю nPBS и сразу же применять первичные антитела Ab разводят в буфере (0,3% Тритон Х-100, 0,3% бычьего сывороточного альбумина в nPBS, рН 7,2). Вам нужно будет ~ 100 мкл на слайд. В этом протоколе, мы локализовать Cx29 в дискретных потомства NPC присутствует в 3D культуры neurosphere.
3. Крышка с парафильмом вырезать, чтобы покрыть разделы, но не более размера стекло микроскопа, как антитела будут привлечены за пределы слайда путем осмоса, если парафильмом достигает или превышает ширину слайда. Парафильмом позволит предотвратить испарение. Выдержите в течение ночи при 4 ° С во влажной камере. Позаботьтесь, чтобы плавать парафильмом по разделам и не позволяют ему присоединиться к слайду. Однако, не удалять или изменять парафильмом размещения раз применяется как необходимо соблюдать осторожность, чтобы не применять какие-либо поперечной силы на участках и тем самым нарушить морфологии.
4. Добавить ~ 1 мл nPBS непосредственно к разделам и плавать с парафильмом. Кроме того, место слайд вертикально непосредственно в банке, пока Коплин парафильмом уплывает. Не снимайте парафильмом, пока он уплывает независимо от манипуляций, как вы можете нарушить хрупкую структуру neurosphere. После парафильмом выключен слайд, инкубировать 5 мин при комнатной температуре. Флик от nPBS и продолжить еще 3 моет при комнатной температуре в течение 5 мин.
5. Применять вторичные антитела разводят в Ab буфера и инкубируют при комнатной температуре в течение 1ч во влажной камере, как описано выше. Вы будете снова требуют ~ 100 мкл / слайдов.
6. Повторите nPBS моет в шаге 4. Применить ядерное контрастирующая в ^3-м мыть (Hoechst 33258 0,5 мкг / мл в nPBS) в течение 5 мин и приступить к последней промывки в течение 5 мин при комнатной температуре.
7. Горы в нужный анти-Fade монтажа средств массовой информации и покровное, обеспечение покровное с nailpolish первый в углах, то все вокруг края для предотвращения потерь (при использовании на основе глицерина СМИ).
8. Приступить к образ коллекции с помощью epifluorescent или конфокальной микроскопии. В этом протоколе, мы используем Leica DMRA2, Хамамацу Orca ER камеры, и OpenLab v3.56 программного обеспечения. В этом примере, что изображения будут захвачены на трех каналах: (1) фазового контраста, (3) Синий УФ (Leica A4 кубе: Фильтр комбинаций Ex 360/40, Ди 400, Sp BP470/40) и красный (Leica Y3 кубе : Фильтр комбинаций Ex BP535/50, Ди 565, Sp 610/75). Съемка каждого последовательного разделе обращая особое внимание на первый и последний разделы, отслеживая полюсов использованием Hoechst 33258 мечения ДНК, где фазовое детектирование одиночных клеток трудно.

4. Выравнивание

1. Когда cryosections являются тай-установлена ​​на микроскопе линий, они будут двигаться и вращаться очень незначительно. Эти отклонения должны быть исправлены. Более того, когда каждый последовательный разделе изображается, в центре каждого изображения не может быть в том же месте на экране. В результате, каждый цифровой серийный разделе должны быть тщательно перестроены с предыдущего раздела, чтобы сохранить точный морфологии. Это выравнивание требует тщательного и точного внимания cytoarchitecture и топографические детали.
2. Последовательные изображения для каждого канала и житель баров масштаба 10 мкм и 50 мкм (создана в OpenLab v3.56 программного обеспечения) сохраняются как отдельные файлы TIFF и импортировать в Photoshop CS4 с использованием стандартного размера полотна 3300 х 2550 пикселей и разрешением 72 точек / дюйм. Пристальное внимание к размер холста должны быть предприняты в этом импорт для поддержания точного масштаба. Размер холста и разрешения являются ключевыми для последующего моделирования в Maya. Шкалы, сохраняется в виде отдельного слоя в Photoshop, должна быть использована для проверки, что никаких изменений в XY размеры происходит во время выравнивания в Photoshop.
3. Далее, ссылка три (или более) слоев, соответствующих одному и тому же разделу (например, ссылка каждой фазе, ультрафиолетовому излучению и Cy3 серии изображений для каждого раздела). Это гарантирует, что, когда один слой выравнивается, другие слои, связанные с этим разделе также расположены в то же время. Кроме того, вы можете заблокировать фазы слой один раз в соответствующей позиции (см. ниже), а затем выровнять связанные слои этого раздела фаз слоя.
4. Для начала, сделайте все слои невидимыми, нажав "глаз" иконку в окне слоев.
5. Включите первого и второго фазового контраста изображения neurosphere серийных срезов, нажав на "глаз" кнопки в окне слоев. Повышение прозрачности втором разделе. Под "Имидж" на вкладке, открытой "поворот изображения" и выберите "произвольный". Поворот втором разделе, пока вы не в состоянии определить точки геометрических и структурных смежности между изображениями. Полезно сравнить назад и вперед с УФ-канал (Hoechst 33258 меченых разделы).
6. Повторите эти действия для всех последующих серийных срезов сравнения "ближайших соседей" (то есть, непосредственные переднего отдела при непосредственном задней части), пока все секции и все каналы точно выровнены.
7. Создайте плоскость в Maya V10, который имеет такой же пропорции, что и файл Photoshop.

5. Сотовые Типология

1. С Строка состояния пользовательского интерфейса Maya, изменение Menu Bar от ее настройки анимации по умолчанию поверхностей.
2. Использование примитивных сфере подразделение для создания тела клетки.
3. С neurosphere выбран, начинается манипулирует своей вершины, щелкнув правой кнопкой мыши на объекте и выбрав из вершин Маркировка меню. Дальнейшая разработка поверхности сферы путем изменения отображения уровня от маркировки меню.
4. На вкладке Подразделение Поверхности главном меню, откройте Свернуть Иерархия окно параметров и установить количество уровней до 2. Свернуть сфере.
5. Изменение Строка меню от поверхности до полигонов.
6. В сфере выделен, откройте Инструмент Sculpt геометрии из сетки вкладке главного меню.
7. Уточнить поверхности клетки для его окончательной формы использования инструментария Sculpt геометрии на вкладке настроек инструмента.
8. Повторите эту процедуру для создания различных органов клетка для имитации различных НПС и NPC потомства присутствует в neurosphere. В этой демонстрации, десять различных органов ячейки образуют основу для neurosphere.
9. Выбрать типологию клетки и заморозить преобразования.
10. В клетках вашего типологии установлено, два шейдеры поверхность будет предназначен для представления обеих клеток, экспрессирующихбелок (в нашем примере Cx29-положительных клеток) и клеток, где белок отсутствует. Здесь любой ячейке с Cx29 иммунореактивности обозначается Cx29-положительными. В этом примере, субклеточные локализации не моделируется хотя такой анализ возможен с доработками, шейдеры.
11. Откройте окно Hypershade Оказание Windows> Редакторы вкладке главного меню.
12. Выберите Рампа Shader из вкладки поверхности материалов.
13. Откройте редактор атрибутов и набора шейдеров Color, раскаление, Ambient Color, Bump Map, и зеркальное атрибуты цвета.
14. Назначение броуновского 3D текстуры окружающего узел цвет и текстуру 2D Фрактальная к узлу карты Bump.
15. Выберите результирующего входного шейдеров и выходные разъемы и экспорта выбранной сети.
16. Выделите ячейку, типология и открытых Экспорт Выбор окне.
17. Выберите тип файла mayaAscii и снимите флажок Включать эти входы коробки. Экспорт Selection.

6. Сотовые карты

1. Откройте файл соответствие серийных секций в Photoshop CS4.
2. Создание ключа Карандаш ударов, чтобы отметить места каждого клеток-предшественников в серийных срезов. В этой демонстрации ключ три удара - твердый квадрат, квадрат с пунктирной линией, а площадь с крестом - будет использоваться, чтобы указать, является ли ячейка находится в одном, двух или трех секций. Этот ключ ударов далее определяется по цвету - в этом примере, красный представляет клеток, экспрессирующих белок наших интересов, Cx29, и белые клетки не представляет выражения Cx29.
3. Включите фазы слой и начать маркировку центре каждого клеток-предшественников с белым инсульта карандаш. Используйте отдельный слой в разделе папку, с которой для построения карт.
4. Переключение между разделами, чтобы найти клетки позиции обеспечения того, чтобы клетки на более чем одном разделе, должным образом обозначены.
5. С Cx29 слой включен, выберите ячейки, которые попадают в регионах, где Cx29 положительно выражено.
6. Выберите команду Заполнить на вкладке Правка главного меню Photoshop и изменить белых штрихов на красный.
7. С карты завершена, сохраните каждый раздел как отдельное изображение JPEG в папке sourceimages Майя проекта. Чтобы сделать это, новый майя проект сначала должен быть создан.

7. Импорт и сборка карт в 3D

1. С Строка состояния пользовательского интерфейса Maya, изменение Menu Bar от ее настройки анимации по умолчанию в полигоны.
2. Импорт planes.mb и scaleBar.mb файлы из папки проектов сцен.
3. Выделив плоскость, назначьте шейдеров Ламберт, щелкнув правой кнопкой мыши на объекте и открытии вкладки Назначить нового материала.
4. В редакторе атрибутов нажмите клетчатый флажок, чтобы право атрибут Цвет материалов.
5. Из всплывающего меню выберите команду: Файл из раздела 2D Textures.
6. В разделе атрибутов файлов в редакторе атрибутов, щелкните на значке файла справа от атрибута Название изображения.
7. Выберите первый раздел из папки sourceimages.
8. Включите камеру рабочую область окна из Перспективный вид по умолчанию орфографические Вид сверху, открыв вкладку панели.
9. Выберите Создать Polygon Tool от Mesh вкладке главного меню и следа план раздела.
10. Выберите первую карту из папки sourceimages и назначить его вновь созданного многоугольника плоскости следующие шаги создан для создания полигона плоскости.
11. С целью выделения, выберите УФ Маркировка меню, нажав правой кнопкой мыши по плоскости.
12. Выделите все точки плоскости UV и открытой УФ редактор текстур на вкладке Окна главного меню.
13. Шкала пропорционально от УФ, чтобы соответствовать плоскости сечения.
14. Повторите эту процедуру для каждого раздела neurosphere обеспечение того, чтобы пространство между каждого раздела соответствуют высоте шкалы.

8. Доступ к типологии клеток-предшественников в 3D

1. С Строка состояния пользовательского интерфейса Maya, изменение строки меню с установленного по умолчанию настройки анимации для динамика.
2. Оставляя только первый раздел neurosphere видно, скрыть все другие разделы, изменяя параметры дисплея из отображаемого вкладке главного меню.
3. В окне Параметры инструмента CV кривой открыта, выберите один из линейных Настройки CV Curve.
4. Просмотр сцены из Top камеры, начинают назначения указывает на ячейку карты создания одной кривой Cx29-негативные клетки, а другой для Cx29-положительных клеток.
5. Полученные кривые плоские при осмотре камеры Сиде. Создание толщина разделов путем сдвига точки кривой у-оси с использованием шкалы, импортируемых из микроскопии изображений в качестве ориентира.
6. Повторите эту процедуру для каждого раздела neurosphere.
7. Импорт файлов cellTyoplogy.ma из сцен папку проекта и дублировать ячейки типология для Cx29-отрицательных и Cx29-положительных клеток в neurosphere.
8. Откройте окно Hypershade Оказание Windows> Редакторы вкладке главного меню.
9. Импорт ранее построенных шейдеры присвоения им клетки типологии.
10. С Outliner окна, удалить имя файла из начала импортированных объектов. Это станет важной в последующие этапы процесса моделирования.
11. Выберите вкладку Частицы из главного меню и создать эмиттер частиц в первый Кривая резюме.
12. Откройте вкладку particleShape1 и под выбросов Атрибуты изменения графа Макса от -1 до числа точек на вашей первой кривой.
13. В Визуализация атрибутов вкладку изменения типа частиц отдавайте Blobby поверхности (S / W). Нажмите на поле Текущие Тип визуализации ниже и изменить радиус частиц 0,010.
14. Прикрепить частиц вершины кривой, выбрав сначала частиц, то сдвиг выбора кривой. Открытое Цель варианты изнутри Частицы вкладке главного меню и набор веса цели 1. Нажмите кнопку Создать.
15. Выделите ячейки с цифрой 1 на 10 в порядке, в Outliner окно и открыть Instancer (замены) варианты коробку из частиц вкладке главного меню. В поле экземпляров объектов, все десять клетки должны быть перечислены в порядке.
16. Выберите правильный particleShape имя из выпадающего списка частиц Объект экземпляра вкладке. Нажмите кнопку Создать.
17. По умолчанию отображаются только первые ячейки, которая была выбрана заменит частиц вдоль кривой. Для того чтобы получить все десять типов появляться и цикл случайно среди частиц, выражение необходимости. Второе выражение будет гарантировать, что клетки излучают случайно таким же образом, каждый раз, когда Range Slider перепозиционируется.
18. С эмиттер выделен, откройте редактор атрибутов. В particleShape вкладке Добавить Динамический атрибутов щелкните на окне Общие. Под Длинное имя написать random_index. В Характеристики перейти от скалярного на одну частицу (массив) и нажмите Добавить.
19. В расчете на одну частицу (Array) Атрибуты вкладке окна random_index был добавлен. Щелчок правой кнопкой мыши пустое пространство, выберите команду Создать выражение ... из выпадающего списка.
20. Введите текст, в Expression: коробка - particleShape1.random_index = рандов (10); если (particleShape1.particleId == 1) семена (1);
21. Для завершения выражение открытой Instancer (Geometry для замены) вкладке Редактор атрибутов и в общих настройках> Object Индекс выберите random_index из выпадающего списка. Принесите ползунок времени на первый кадр и нажмите играть, типы клеток, в настоящее время случайным образом распределены между частицами.
22. Повторите эту процедуру для каждого раздела neurosphere. Убедитесь, что каждый новый излучатель, instancer, и случайный индекс дифференцируется по имени и организовал надлежащим образом в Outliner Window.

9. Оказание / Композиция

1. В визуализации Использование части окна Render Settings, измените визуализации от Maya Программное обеспечение для Mental Ray.
2. Откройте вкладку Качество и под Raytracing изменения Размышления установка на ноль. Открытое фреймбуфер вкладку и измените Colorclip из Сырье для Альфа и снимите Premultiply.
3. Открытый канал Box / Layer редактор и изменить настройки слоя редактор из Дисплей для визуализации.
4. Выберите импортированных клетках типологии и нажмите кнопку Создать новый слой и назначить выбранную иконку объектов.
5. Переименовать слой окружающей окклюзии.
6. Щелчок правой кнопкой мыши вновь созданный слой, выберите Свойства из меню.
7. Справа от RenderLayer рамки, щелкните кнопку Presets и выберите Occlusion из выпадающего списка.
8. Выберите mib_amb_occlusion1 вкладку и измените Образцы от 16 до 256.
9. Повторное открытие канала Box / Layer редактора и на вкладке Параметры откройте окно визуализации всех слоев вариантов.
10. Выберите композитный и держать слоев.
11. С ambientOcclusion выбран слой, изменить его с нормальной и умножить из выпадающего списка прямо над списком слоев.
12. Рендер двумя проходами neurosphere, один раз с ambientOcclusion слой включен и один раз masterLayer включен. Сохранить изображение как файлы если и только если в папке проектов изображений.
13. Откройте оба изображения в Photoshop CS4. Место ambientOcclusion слой поверх masterLayer и установить его на Multiply. Создание фона и выровнять изображение.

Discussion

Этот протокол описывает процедуру культуры и серийно cryosection послеродовой гиппокампа NPC, локализовать экспрессии белка от иммунологического и, наконец, реконструкция и анализ топографических положение иммунопозитивных клеток в течение всей 3D neurosphere. Объединив культуру клеток биологии и методов обработки, микроскопия томография (OpenLab, импровизация и другие программного обеспечения для анализа изображений), графическое программное обеспечение для редактирования мощностей (Adobe Photoshop), и 3D-анимации и возможности композитинга программного обеспечения (Autodesk Maya), приведем методику для восстановления весь клеточный состав 3D культур от серийного 2D-изображений позволяет верная реконструкция клеточных положение и экспрессии белка всей neurosphere культуры. Этот протокол может быть объединен с одинаковой эффективностью для регистрации и реконструкции epifluorescent тонкие серийных срезов или конфокальной Z-стеки через толстые серийных срезов. Потому что клональной экспансии одного NPC, в neurosphere повторяет культуру многих этапах наблюдается в течение нейрогенеза и gliogenesis в послеродовой мозга, воздействие ее 3D-структура представляет важный фактор, определяющий судьбу NPC в потомстве подвергаются той же экспериментальной среде ^1. Дивергенция в линии и экспрессии белка в ядро и периферию серийных срезов neurosphere предполагает, что несколько физических факторов, включая сотовые положении, механическим нагрузкам, и поперечной силы играют важную роль в регулировании NPC биологии ^2. Более того, коннексин экспрессии белка, проанализированы здесь, как было показано, меняются в зависимости от того, когда NPC, культивируют как 3D нейросферы в суспензии или высевают на ламинин подложки с функциональными коннексин-опосредованной коммуникации изменили ли клетки культивируют на пластике и субстрат или в 3D свободный плавающего культур ^3. Воздействие сотовой позицию по NPC судьба остается неясной. Это технически сложно анализировать влияние пространственного расположения в 3D культуры на NPC биологии, учитывая, что антигенные оценки происхождения и сигнальных белков требует разрушения 3D архитектуру, чтобы пермеабилизации клеток и антител доступ ко всем клеткам. Здесь мы показываем, что гибридная методика визуализации обеспечивает средства определения того, некоторые белки выставку уникальных позиционных локализаций в 3D-культуры, может быть использована для вывода и протестировать функцию белка и регулирования в отношении региональных локализации в neurosphere, и, пожалуй, самое главное , обеспечивает позиционных данных, необходимых для изучения влияния 3D топографии и клеточной позиционирование на NPC судьбу в 3D культуры.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Euthansol	Reagent	Merck & Co.
Krazy Glue	Reagent	Home Hardware
VT1000S vibratome	Equipment	Leica Microsystems
Neural protease	Reagent	Sigma-Aldrich	P6141	Stock solutions stored at -20°C
Papain	Reagent	Sigma-Aldrich	P4762	Stock solutions stored at -20°C
DNAse I	Reagent	Roche Group	11 284 932 001	Stock solutions stored at -20°C
MZ6 Dissecting Microscope	Equipment	Leica Microsystems
ProBlot 6 Hybridization Oven	Equipment	Labnet International
Centrifuge 5702	Equipment	Eppendorf
kPBS	Reagent	BioShop Canada	PBS404
B27 Supplement	Reagent	Invitrogen	17504-044
Ultra Low Binding Tissue Culture Dishes	Disposable	Corning	3261
Human Epidermal growth Factor	Reagent	Invitrogen	13247-051	Stock solutions stored at -20°C
Fibroblast growth factor-2	Reagent	Invitrogen	13256-029	Also known as basic fibroblast growth factor (bFGF) Stock solutions stored at -20°C
37% formaldehyde (molecular grade)	Reagent	Sigma-Aldrich	F8775
Belly Dancer Shaker	Equipment	Stovall Life Sciences, IBI Sciences
Tissue- Tek Cryomold	Disposable	Sakura Finetek	4566
Tissue-Tek OCT compound	Reagent	Sakura Finetek	4583
Whatman Grade 703 Blotting Paper	Disposable	VWR international	28298-020
CM1900 Cryostat	Equipment	Leica Microsystems
Polyclonal Anti-Cx29 Primary Antibody	Reagent	Kindly provided by Dr David Paul, Harvard Medical School		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
Cy3-conjugated donkey anti-rabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
H–chst 33258	Reagent	Sigma-Aldrich	861405
DMRA2 epiflourescent microscope, Orca ER camera, OpenLab v3.56	Equipment/ Software	Leica Microsystems		This protocol can be performed with any epifluorescent or confocal microscope.
Photoshop CS4	Software	Adobe		Graphic software
Maya v10	Software	Autodesk		Modeling software
Computer	Equipment	Intel		Processor: Intel Corei7 920, Memory:12GB DDR3 Video card: Nvidia GTX 285 (1GB RAM)
* All other standard chemical reagents listed in the protocol are from Sigma-Aldrich. All other standard tissue culture reagents are from Invitrogen.