La localización de la proteína en 3D Cultura de células madre neurales: una metodología de visualización híbrida

Summary

Aquí se describe cómo producir, expandir y immunolabel postnatal las células del hipocampo progenitoras neuronales (CPN) en tres dimensiones (3D) la cultura. A continuación, utilizando las tecnologías híbridas de visualización, se demuestra cómo las imágenes digitales de cryosections immunolabelled se puede utilizar para reconstruir y mapa de la posición espacial de las células en todo el inmunopositivas neuroesfera 3D completo.

Abstract

La importancia de tres dimensiones (3D) para influir en la topografía madre neuronales y células progenitoras (NPC) fenotipo es ampliamente reconocido todavía difíciles de estudiar. Cuando se disocian del cerebro embrionario o después del parto, los personajes solo se proliferan en la suspensión para formar neuroesferas. Células hijas dentro de estas culturas adoptan espontáneamente distintos linajes de desarrollo (neuronas, oligodendrocitos y astrocitos) en el transcurso de la expansión a pesar de estar expuesto al medio extracelular mismo. Este recapitula la progresión de muchos de los estadios observados a lo largo de la neurogénesis y gliogénesis en post-natal del cerebro y se utiliza a menudo para estudiar la biología básica NPC en un entorno controlado. Evaluar el impacto completo de la topografía en 3D y posicionamiento celular dentro de estas culturas sobre el destino de la APN, sin embargo, difícil. Para localizar las proteínas diana y determinar los linajes NPC por inmunocitoquímica, de libre flotación neuroesferas se colocan sobre un sustrato o seccionado en serie. Este proceso es necesario para garantizar la permeabilización de células equivalentes y el acceso de anticuerpos a lo largo de la esfera. Como resultado, las imágenes 2D de epifluorescencia cryosections o reconstrucciones en 3D confocal de Z-pilas sólo puede proporcionar información acerca de la posición espacial de células en 3D discreta rebanadas físico o digital y no se visualiza la posición en el ámbito celular intacta. En este caso, reiterar la topografía de la cultura neuroesfera y permitir el análisis espacial de la expresión de la proteína a lo largo de toda la cultura, se presenta un protocolo para el aislamiento, la expansión, y la sección de serie de post-natal neuroesferas hipocampo adecuado para inmunodetección epifluorescencia o confocal de las proteínas diana. Connexin29 (Cx29) se analiza como un ejemplo. A continuación, utilizando un híbrido de edición gráfica y software de modelado 3D aplicado rigurosamente para mantener el detalle biológica, se describe cómo volver a montar el posicionamiento estructural en 3D de estas imágenes y mapa digital de las células marcadas en el neuroesfera completa. Esta metodología permite la visualización y análisis de la situación celular de las proteínas diana y las células a través de la topografía en 3D toda la cultura y facilitará un análisis más detallado de las relaciones espaciales entre las células a lo largo de la neurogénesis y gliogénesis in vitro.

Ambos Imbeault y Valenzuela han contribuido por igual y deben ser considerados comparten la primera autoría.

Protocol

1. Aislamiento de células progenitoras neurales

Mantenga pañuelos desechables y soluciones de frío en todo momento durante el protocolo de aislamiento!

1. Antes de iniciar su cultura, prepare las siguientes soluciones madre:
   • La disociación de medios (26 mM NaHCO _3, 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,1 mM CaCl ₂ * 2H ₂ O, 3,2 mM MgCl ₂ * 6H ₂ O, 10 mM D-glucosa, 100 U / mL de penicilina, 100 mg / ml . estreptomicina filtro estéril y almacenar en alícuotas de 10-15 ml a -20 ° C. Prepare un balance de las concentraciones de enzimas que se utilizan para la disociación celular de doble destilada H ₂ O, filtro estéril y almacenar alícuotas a -20 ° C: la proteasa Neural (25 mg . / mL), la papaína (10 mg / ml), DNAseI (10 mg / ml) En el día del experimento, añadir enzimas a 15 ml de disociación los medios de comunicación en las concentraciones finales: 1 mg / mL de la proteasa, 0,1 mg / ml papaína, 0,1 mg / ml solución DNAsa I. La disección que contienen concentraciones finales de la enzima se puede mantener en hielo durante el proceso de disección.
   • Mantenimiento de los medios de comunicación: la Dulbecco modificado de Eagle F12 (DMEM/F12), 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 1X suplemento B27. Se puede mantener durante un máximo de 3 meses a 4 ° C, sin suplemento de B27 y hasta un mes a 4 ° C con suplemento B27.
   • Factores de crecimiento: Preparar alícuotas de valores de 0,1 mg / ml de factor humano recombinante de crecimiento epidérmico (hEGF) y 10 ug / mL factor de crecimiento fibroblástico-2 (FGF-2) en DMEM/F12 + 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA). Almacenar a -20 ° C.
2. Para anestesiar mortalmente C57BL / 6 crías de ratón, los ratones son inyectados por vía intraperitoneal con Euthansol en el día postnatal 0-3.
3. Retire con cuidado el cerebro mediante la disección estándar y almacenar en una placa de 60 mm que contienen líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF: 26 mM NaHCO _3, 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl ₂ * 2H ₂ O, 1,3 mM MgCl ₂ * 6H ₂ O , 10 mM D-glucosa, 100 U / mL de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina). pH a 7,3 si el filtro necesario y estéril en alícuotas de 50 ml, almacenar a -20 ° C.
4. Usando una hoja de afeitar, el cerebro mediante la eliminación de bloque en el cerebelo y el cerebro con pegamento Krazy Glue, parte rostral, de lado dorsal hacia arriba, hacia el plato vibratome. Una Leica VT1000S vibratome se utiliza en este protocolo.
5. Posición en el plato y añadir vibratome ACSF y el hielo en los compartimentos adecuados.
6. Cortar las rebanadas de 500 micras espesor con una velocidad de entre 3.5 a 4.5 y la frecuencia de 8,5.
7. Recopilar segmentos que contienen la formación del hipocampo en platos que contengan ACSF.
8. El uso de un microscopio estereoscópico, eliminar hipocampo entre bregma -1.60 mm y -2,40 mm (hasta la región CA3 comienza a curvarse ventral) y colóquelo en un plato seco nuevos (sin ACSF). Una Leica MZ6 microscopio de disección se utiliza en este protocolo.
9. Una vez que todos los hipocampos son recogidos, pique tejido con un bisturí (hasta un aspecto homogéneo y gas licuado se obtiene).
10. La transferencia de tejido picado a un tubo de polipropileno de 15 ml que contiene 2,5 ml de los medios de comunicación que contiene la disociación de la proteasa neural, la papaína, y DNAsa I (vea el paso # 1 para la preparación de la solución). Tenga en cuenta si hay una gran cantidad de tejido de origen (por ejemplo, de 6 cachorros) es una buena idea utilizar dos viales de 2,5 ml de medio de disociación para mantener la enzima óptima: relación de los tejidos. Se incuba a 37 ° C durante 45-60 minutos con la rotación. A Labnet PROBLOT 6 horno de hibridación (comprados a través de Mandel científico) se utiliza en este protocolo que seleccionar el modo de rotación 4.
11. Agregar 10 ml de fosfato de potasio estériles de cultivo de tejidos solución salina (KPBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM tampón fosfato, pH 7,4) y centrifugar a 300 xg durante 5 min. Una centrífuga Eppendorf (modelo 5702) se utiliza en este protocolo.
12. Desechar el sobrenadante y el precipitado se resuspende en 5 ml de kpbs.
13. Disociarse del tejido mediante trituración a través de una pipeta Pasteur.
14. Centrifugar la suspensión celular a 300 xg durante 5 min.
15. Resuspender las células en 3 ml de medio de mantenimiento, las células cuentan con azul de tripano y células de la placa de 60 mm no adherentes platos (Corning Ultra-Low platos adhesión obligatoria se utilizan en este protocolo, ver Materiales) a una densidad de 2,5 x 10 ⁵ células / plato en 5 ml de medio de mantenimiento. Placas de Petri se puede utilizar en lugar de platos adherencia ultra bajo, pero las culturas se requieren para ser aprovechado por la mañana y tarde todos los días durante la expansión de los primeros 6 días in vitro (DIV) para evitar la chapa y la diferenciación espontánea.
16. Añadir hEGF a una concentración final de 20 ng / mL y FGF-2 a una concentración final de 10 ng / ml inmediatamente después de la siembra. Agregar factores de crecimiento cada dos días durante la fase de expansión hasta el día de recolección en 14 DIV. (Las barras de escala en el vídeo de neuroesferas expansión representa 100 micras).

** Nota: los medios de comunicación pueden llegar a ser amarillo alrededor de DIV 10 de la fase de expansión. Si esto ocurre, agregue otro 1 ml Mailos medios de comunicación ntenance. Si los medios de comunicación se vuelve amarillo al día siguiente, agregue otro 1 ml de medio de mantenimiento - seguir haciendo esto si es necesario durante la fase de expansión - recuerde ajustar el volumen de factores de crecimiento en consecuencia para mantener la concentración final correcto.

2. Muestras criostáticas serie

1. Toque neuroesferas suavemente antes de la fijación para asegurar esferas están bien separados en el momento de la fijación.
2. Añadir formaldehído grado molecular directamente a las culturas a una concentración final de 3,7% y se incuban a temperatura ambiente (TA) durante 20 minutos con agitación lenta. Una bailarina del vientre Stovall se utiliza en este protocolo establecido a una velocidad de rotación de 2,5.
3. Recoger neuroesferas en un tubo de polipropileno de 15 ml y centrifugar a 300 xg durante 5 min.
4. Desechar el sobrenadante y el precipitado se resuspende en 10 ml de fosfato de sodio solución salina (nPBS: 154 mM NaCl, 10 mM tampón fosfato). Tenga en cuenta el cambio en el uso de solución de KPBS a nPBS.
5. Centrifugar a 300 xg durante 5 min.
6. Resuspender en 510 ml de sacarosa al 20% (w / v) en nPBS.
7. Mantenga neuroesferas a 4 ° C durante al menos 24 horas para cryoprotect culturas.
8. Llenar un cryomold desechables con una temperatura óptima de corte (octubre) Compuesto.
9. Vierta suavemente la solución de sacarosa que contiene neuroesferas en un plato.
10. Utilizar un microscopio estereoscópico para localizar los ámbitos representativos de diferentes tamaños con la menor evidencia de rotura mecánica. Al realizar este procedimiento por primera vez, en algunas culturas puede ser roto o rasgado. Morfología se mantiene muy bien con la práctica.
11. Aspire con cuidado cada neuroesfera hasta en un 1 ml punta de pipeta (mantener el volumen de sacarosa que contienen solución retirado a un mínimo) y colocarlo en el compuesto de octubre Marcar la ubicación aproximada en el molde para que pueda encontrar las esferas más tarde.
12. Una vez que usted ha puesto una pocas esferas en las cryomold, flash-congelar las muestras con CO ₂ hasta octubre es de color blanco.
13. Marca la ubicación de su ámbito en el cubo y el cubo de pop fuera del molde
14. Utilizando unas pinzas previamente enfriado, colocar el cubo en una hoja de papel de filtro previamente asegurado a un mandril con octubre
15. Lugar más complejo octubre alrededor del cubo y la congelación de adherirse al bloque que contiene las esferas con CO _2. Por otra parte el lugar de la tirada (con papel de filtro) en el criostato, chorro compuesto de octubre en papel de filtro, y el cubo a cabo directamente en octubre Esperar hasta octubre es de color blanco y duro. Una Leica CM1900 criostato se utiliza en este protocolo.
16. Una vez que el compuesto de octubre se convierte en blanco, puede colocar el mandril en el bloque de corte, y luego esperar al menos 30 minutos de la temperatura se equilibre.
17. Corte serie 10 secciones micras velando por sus marcas y el control a menudo bajo un microscopio para secciones neuroesfera. Lugar tantas secciones como usted puede en una diapositiva. Tenga en cuenta que puede no ser capaz de ver los primeros cortes de su neuroesfera en el ámbito, por lo que recoger todas las secciones hasta que vea las células y mantener el 3-5 antes de que las secciones de este comienzo y al final de su esfera. Estas secciones anterior y posterior, también serán procesados ​​para inmunocitoquímica. Una contratinción nuclear cuando se realiza inmunotinción es clave, ya que le permitirá detectar las células individuales en los polos neuroesfera no evidente bajo el microscopio estándar de fase inversa.
18. Secciones almacenar a -20 ° C.

3. Inmunocitoquímica

1. Retirar los portaobjetos de -20 ° C y descongelar mediante la aplicación de nPBS suavemente en todas las secciones y la incubación a temperatura ambiente durante 5 min.
2. Flick off nPBS exceso y aplicar de inmediato anticuerpo primario diluido en buffer de Ab (0,3% Triton X-100, un 0,3% de suero albúmina bovina en nPBS, pH 7,2). Usted necesitará ~ 100 l por diapositiva. En este protocolo, se localizan en la progenie Cx29 NPC discretas presentes en la cultura neuroesfera 3D.
3. Cubrir con parafilm corte para cubrir las secciones, pero que no exceda el tamaño de la diapositiva del microscopio como anticuerpo se extrae la diapositiva por ósmosis si la parafina alcanza o supera el ancho de la diapositiva. La parafina se evitar la evaporación. Incubar toda la noche a 4 ° C en una cámara húmeda. Tenga cuidado de hacer flotar la parafina en las secciones y no permiten que se adhiera a la diapositiva. Sin embargo, no suprimir o alterar la colocación de parafina, una vez aplicado como se debe tener cuidado de no aplicar ninguna fuerza de corte en las secciones y por lo tanto alterar la morfología.
4. Añadir aproximadamente 1 ml nPBS directamente a las secciones y el flotador de la parafina. Por otra parte, colocar la placa vertical directamente en una jarra Coplin hasta que la parafina se aleja flotando. No retire la parafina hasta que se aleja flotando de forma independiente de la manipulación, ya que puede alterar la estructura neuroesfera frágil. Una vez que la parafina es fuera de la diapositiva, incubar 5 min a temperatura ambiente. Flick off nPBS y continuar con más de 3 lavados a temperatura ambiente durante 5 min.
5. Aplicar el anticuerpo secundario diluido en buffer de Ab y se incuban a temperatura ambiente durante 1h en una cámara húmeda como se describió anteriormente. Una vez más se requieren aproximadamente 100 l / diapositivas.
6. Repita el lavado nPBS en el paso 4. Aplique una contratinción nuclear en el lavado 3 ^ª (Hoechst 33258 0,5 mg / ml en nPBS) durante 5 minutos y continúe con el lavado final de 5 min a temperatura ambiente.
7. Monte en su preferido anti-fade medios de montaje y cubreobjetos, asegurando el cubreobjetos con la primera nailpolish en las curvas, entonces alrededor de los bordes para evitar la pérdida (si se utiliza una base de glicerina de medios).
8. Proceder a la colección de imágenes usando un microscopio de epifluorescencia y confocal. En este protocolo, se utiliza un DMRA2 Leica, una cámara Hamamatsu Orca ER, y el software Openlab v3.56. En este ejemplo, se capturan las imágenes en tres canales: (1) de contraste de fases, (3) Azul UV (Leica A4 cubo: Filtro de combinaciones Ex 360/40, Di 400, Sp. BP470/40), y rojo (Leica Y3 cubo : combinaciones de filtros Ex BP535/50, Di 565, Sp. 610/75). Dispara a cada sección de serie prestando especial atención a los primeros y los últimos tramos mediante el seguimiento de los polos con Hoechst 33258 etiquetado de ADN, en la fase de detección de células individuales es difícil.

4. Alineación

1. Cuando el cryosections se descongele montados en las líneas de microscopio, se mueven y giran muy ligeramente. Estas desviaciones deben ser corregidas. Además, cuando cada sección se crea una imagen de serie, el centro de cada imagen no puede estar en la misma ubicación en la pantalla. Como resultado, cada sección de serie digitalizados deben ser cuidadosamente reajustado de conformidad con el apartado anterior para preservar la morfología exacta. Esta alineación requiere una atención cuidadosa y precisa a la citoarquitectura y detalles topográficos.
2. Imágenes seriadas de cada canal y bares residente escala de 10 micras y 50 micras (establecido en Openlab v3.56 software) se guardan como archivos TIFF individuales e importados en Photoshop CS4 utilizando un tamaño de lienzo estándar de 3300 x 2550 píxeles y una resolución de 72 píxeles / pulgada. La atención cuidadosa a tamaño del lienzo se debe tomar en esta importación para mantener una balanza de precisión. El tamaño del lienzo y la resolución son claves para el modelado posterior en Maya. La barra de escala, salvo en una capa separada en Photoshop, se debe utilizar para verificar que ningún cambio en las dimensiones XY se produce durante la alineación en Photoshop.
3. A continuación, enlace de los tres (o más) capas correspondientes a la misma sección (es decir, vincular cada fase, los rayos UV, y Cy3 serie de imágenes para cada sección). Esto asegura que cuando una capa se alinea, otras capas asociado a esa sección también están alineados al mismo tiempo. Alternativamente, puede bloquear la capa de fase, una vez en la posición adecuada (ver abajo) y luego alinear las capas asociados de esa sección de la capa de fase.
4. Para comenzar, todas las capas invisibles haciendo clic en el icono "ojo" en la ventana de capas.
5. A su vez las imágenes de primera y segunda fase de contraste de las secciones neuroesfera serie en, haga clic en el "ojo" iconos en la ventana de capas. Aumentar la transparencia de la segunda sección. Bajo la "imagen" ficha, abra "rotación de imagen" y seleccione "arbitraria". Gire la segunda sección hasta que son capaces de identificar los puntos de contigüidad geométricas y estructurales entre las imágenes. Es útil para comparar un lado a otro con el canal de UV (Hoechst 33258 marcado con secciones).
6. Repita la operación para todas las secciones posteriores de serie comparando "los vecinos más cercanos" (es decir, la sección inmediata anterior a la sección posterior inmediato) hasta que todos los sectores y todos los canales están alineados con precisión.
7. Crear un plano de Maya v10 que es de la misma proporción que el archivo de Photoshop.

5. Tipología de la célula

1. Desde la línea de estado de interfaz de usuario de Maya, cambiar la barra de menús de su configuración por defecto de animación a las superficies.
2. Use una esfera subdivisión primitivas para crear el cuerpo de la célula.
3. Con la neuroesfera seleccionado, comienza la manipulación de sus vértices haciendo clic en el botón derecho del ratón sobre el objeto y la selección de vértices en el menú marcado. Elaborar aún más la superficie de la esfera al cambiar el nivel de visualización desde el menú de marcación.
4. En la ficha Barrio Las superficies del menú principal, abra la Jerarquía Ocultar opciones de caja y el número de niveles a 2. El colapso de la esfera.
5. Cambiar la barra de menús de las superficies de polígonos.
6. Con la esfera seleccionada, abra la herramienta de geometría esculpir de la ficha de malla del menú principal.
7. Refinar la superficie de la célula a su forma final empleando las herramientas de Geometría esculpir en la ficha Ajustes de herramientas.
8. Repita este proceso para crear los diferentes órganos celulares para simular la variedad de NPCs y actual del NPC progenie en el neuroesfera. En esta demostración, diez cuerpos celulares de diferentes forman la base para la neuroesfera.
9. Seleccione la tipología de células y transformaciones de congelación.
10. Con las células de su tipología establecida, dos shaders superficie será diseñado para representar tanto las células que expresanla proteína de interés (en nuestro ejemplo Cx29 células positivas) y las células cuando la proteína está ausente. Aquí, cualquier célula con Cx29 inmunorreactividad se designa Cx29-positivo. En este ejemplo, la localización subcelular no se modela a pesar de este análisis es posible con las modificaciones a los shaders.
11. Abra la ventana Hypershade de la representación de Windows> Editores pestaña del menú principal.
12. Elija un sombreado de rampa de la ficha de superficie de materiales.
13. Abra el Editor de atributos y establecer el color de shaders, incandescencia, de color ambiente, Bump Map, y los atributos de color especular.
14. Asignar una textura 3D browniano en el nodo Color de ambiente y de una textura 2D fractal para el nodo Bump Mapping.
15. Seleccione la entrada de shaders resultante y conexiones de salida y de exportación de la red seleccionada.
16. Seleccione la tipología de las células y abrir la selección de opciones de exportación caja.
17. Elija el tipo de archivo mayaAscii y desactive la casilla Incluir estas entradas. Selección de exportación.

6. Mapeo de la célula

1. Abra el archivo alineadas las secciones de serie en Photoshop CS4.
2. Establecer una clave de trazos de lápiz para marcar la ubicación de cada una de células progenitoras en los cortes seriados. En esta demostración, una llave de tres golpes - un cuadrado, un cuadrado con una línea discontinua, y un cuadrado con una cruz - se utiliza para indicar si una célula se encuentra en uno, dos o tres secciones. Esta clave de los accidentes cerebrovasculares se define por el color - en este ejemplo, el rojo representa las células que expresan nuestra proteína de interés, Cx29, el blanco representa las células que no expresan Cx29.
3. A su vez la capa de fase y empezar marcando el centro de cada célula progenitora con un trazo de lápiz blanco. Use una capa separada dentro de la carpeta de la sección con la que construir sus mapas.
4. Alternar entre las secciones para localizar la posición células asegurar que las células en más de una sección están debidamente indicado.
5. Con la capa de Cx29 activado, seleccione las celdas que se encuentran en las regiones donde Cx29 se expresa de manera positiva.
6. Elija el comando Rellenar de la pestaña Editar de la barra de menú principal de Photoshop, y cambiar los trazos de blanco a rojo.
7. Con los mapas cumplimentado, a cada sección por separado como una imagen JPEG en la carpeta sourceimages del proyecto Maya. Para ello, un proyecto nuevo Maya, primero tendrá que ser creado.

7. La importación y ensamblaje de mapas en 3D

1. Desde la línea de estado de interfaz de usuario de Maya, cambiar la barra de menús de su configuración por defecto de animación a polígonos.
2. Importar los archivos planes.mb y scaleBar.mb de la carpeta de proyectos de escenas.
3. Con el plano seleccionado, asigne un sombreado de Lambert haciendo clic en el botón derecho del ratón sobre el objeto y la apertura de la ficha Asignar el nuevo material.
4. En el Editor de atributos, haga clic en el cuadro de cuadros a la derecha del atributo Color de los materiales.
5. En el menú emergente, seleccione Archivo de la sección de texturas 2D.
6. En la sección Atributos de archivo en el Editor de atributos, haga clic en el icono del archivo a la derecha del atributo Nombre de imagen.
7. Elija la primera sección de la carpeta sourceimages.
8. Conecte la cámara de la ventana del área de trabajo desde el punto de vista la perspectiva a la vista por defecto Inicio ortográficas mediante la apertura de la ficha de paneles.
9. Seleccione la herramienta Crear polígono de la ficha de malla del menú principal y trazar el contorno de la sección.
10. Elija el primer mapa de la carpeta sourceimages y asignarle al plano polígono de nueva creación siguiendo los pasos establecidos para crear el plano del polígono.
11. Con el objeto seleccionado, elija UV desde el Menú de marcado, haga clic en el botón derecho del ratón sobre el plano.
12. Seleccionar todos los puntos UV aviones y abrir el Editor de texturas UV en la ficha de Windows del menú principal.
13. Escala de la proporción de la UV para adaptarse al plano de sección.
14. Repita este proceso para cada sección de la neuroesfera asegurar que los espacios entre cada sección corresponden a la altura de la barra de escala.

8. Localización de las tipologías de células progenitoras en 3D

1. Desde la línea de estado de interfaz de usuario de Maya, cambiar la barra de menús de la configuración predeterminada de Animación a la dinámica.
2. Dejando sólo la primera sección de la neuroesfera visible, se esconden todas las demás secciones, cambiando la configuración de pantalla de la ficha Pantalla del menú principal.
3. Con la caja de la herramienta Curva CV opciones abiertas, seleccione un lineal de los ajustes de la curva CV.
4. Viendo la escena desde la cámara de visión superior, comenzar a asignar puntos a los mapas de la célula creando una curva de las células Cx29-negativas y una de las células Cx29-positivo.
5. Las curvas resultantes son planas cuando se ve desde una cámara de visión lateral. Establecer el espesor de las secciones al desplazar los puntos de la curva en el eje y utilizando la barra de escala importados de las imágenes de microscopía de guía.
6. Repita este proceso para cada sección de la neuroesfera.
7. Importe el archivo de la carpeta cellTyoplogy.ma escenas del proyecto y duplicar la tipología de células, tanto para las células Cx29-negativos y positivos-Cx29 en el neuroesfera.
8. Abra la ventana Hypershade de la representación de Windows> Editores pestaña del menú principal.
9. Importar los shaders previamente construida asignándolos a las células de la tipología.
10. Desde la ventana Outliner, quitar el nombre de archivo de inicio de los objetos importados. Esto será importante en las etapas posteriores del proceso de modelado.
11. Seleccione la pestaña de partículas desde el menú principal y crear un emisor de partículas de la primera curva de CV.
12. Abra la ficha particleShape1 y en Atributos de emisión cambiar el conde Max de -1 a la cantidad de puntos en la primera curva.
13. En la ficha Atributos Render cambiar el tipo de Render de partículas a la superficie Blobby (s / w). Haga clic en la casilla de Render Tipo de corriente abajo y cambiar el radio de las partículas de 0,010.
14. Coloque las partículas de los vértices de la curva, seleccionando primero las partículas luego cambiar la selección de la curva. Abrir las opciones de gol desde dentro de la pestaña de partículas del menú principal y establecer el peso ideal a 1. Haga clic en Crear.
15. Seleccione las celdas del número 1 al 10 en el orden en la ventana Outliner y abrir el Instancer (Sustitución) cuadro de opciones de la pestaña de las partículas del menú principal. En el cuadro Instancia objetos, los diez células deben ser listadas en orden.
16. Elegir el nombre correcto particleShape de la lista desplegable del objeto de partículas a la pestaña de la instancia. Haga clic en Crear.
17. Por defecto, sólo la primera celda que se ha seleccionado sustituirá a las partículas a lo largo de la curva. Con el fin de conseguir los diez tipos a aparecer y el ciclo de forma aleatoria entre las partículas, una expresión que se necesita. Una segunda expresión se asegurará de que las células emiten al azar de la misma manera cada vez que se vuelve a colocar el control deslizante de rango.
18. Con el emisor seleccionado, abra el Editor de atributos. En la ficha particleShape, con atributos dinámicos haga clic en Agregar en el cuadro general. Bajo el nombre largo de escribir random_index. En cambio atributo Tipo de escalar a la partícula por (matriz) y pulse Agregar.
19. En la partícula por (Array) Atributos de la ficha, una caja de random_index ha añadido. Al hacer clic en el botón derecho del ratón sobre el espacio vacío, seleccione Crear expresiones ... desde el menú desplegable.
20. Escriba el texto en la expresión: caja - particleShape1.random_index = rand (10), si (particleShape1.particleId == 1) semillas (1);
21. Para completar la expresión abierta de la Instancer (sustitución de la geometría) ficha en el Editor de atributos y en general Opciones> Objeto random_index Índice de seleccionar de la lista desplegable. Lleve el control deslizante de tiempo para el primer cuadro y pulsa el juego, los tipos de células están distribuidas al azar entre las partículas.
22. Repita este proceso para cada sección de la neuroesfera. Asegúrese de que cada índice emisor nuevo, instancer, y al azar se diferencian por su nombre y organizado de manera apropiada en la ventana Outliner.

9. Rendering / Composición

1. En el Render uso de la ventana de Ajustes de procesamiento, cambiar el procesador de software Maya de mental ray.
2. Abra la ficha de calidad y bajo Raytracing cambiar las reflexiones entorno a cero. Abra la ficha Framebuffer y cambiar el Colorclip de premultiplicar primas a Alfa y desmarque.
3. Abrir el canal de Box / Capa Editor y cambie la configuración del Editor de Niveles de visualización de Render.
4. Seleccione las celdas importadas de la tipología y haga clic en el icono Crear nueva capa y asignar los objetos seleccionados.
5. Cambiar el nombre de la capa de la oclusión del ambiente.
6. Al hacer clic en el botón derecho del ratón sobre la capa recién creada, seleccione Atributos en el menú.
7. A la derecha de la caja RenderLayer, haga clic en el botón Presets y seleccione la oclusión de la lista desplegable.
8. Seleccione la pestaña mib_amb_occlusion1 y cambiar las muestras de 16 a 256.
9. Vuelva a abrir el canal del decodificador / Capa Editor y en la pestaña Opciones, abra la caja de Capas Render Todas las opciones.
10. Seleccione Composite y mantener las capas.
11. Con la capa ambientOcclusion seleccionado, cambiar de Normal a Multiplicar en el menú desplegable justo por encima de la lista de capas.
12. Hacen dos pases de la neuroesfera, una vez con la capa ambientOcclusion encendido y una vez con el masterLayer encendido. Guarde las imágenes como archivos si y sólo si en la carpeta de proyectos de imágenes.
13. Abra las dos imágenes en Photoshop CS4. Coloque la capa ambientOcclusion en la parte superior de la masterLayer y lo puso a Multiplicar. Crear un fondo y acoplar la imagen.

Discussion

Este protocolo describe un procedimiento para la cultura y la serie cryosection post-natal NPCs del hipocampo, localizar la expresión de proteínas por inmunodetección, y, finalmente, reconstruir y analizar la posición topográfica de las células dentro de la inmunopositivas neuroesfera 3D completo. Mediante la combinación de la cultura de la biología celular y técnicas de procesamiento, las imágenes de microscopía (Openlab, improvisación y otros softwares de análisis de imágenes), las capacidades de software de edición gráfica (Adobe Photoshop), y la animación 3D y capacidades de composición de software (Autodesk Maya), se presenta una metodología para reconstruir el toda la composición celular de las culturas 3D de imágenes 2D de serie que permite la reconstrucción fiel de la posición de celular y expresión de la proteína a través de una cultura neuroesfera. Este protocolo se puede combinar con la misma eficacia para el registro y la reconstrucción de epifluorescencia secciones delgadas serial o confocal pilas Z-a través de las secciones más gruesas de serie. Debido a la expansión clonal de los PNJ en un solo recapitula la cultura neuroesfera muchas de las etapas observados a lo largo de la neurogénesis y gliogénesis en post-natal del cerebro, el impacto de la estructura 3D representa un factor determinante de la APN destino importante en la descendencia expuesta al mismo medio experimental ^1. La divergencia en el linaje y la expresión de proteínas en el núcleo y la periferia de las secciones neuroesfera serie sugiere que varios factores físicos como la posición de la celda, la tensión mecánica, y la fuerza de cizallamiento juegan un papel importante en la regulación de la biología NPC ^2. Por otra parte, la expresión de la conexina proteínas, aquí analizados, se ha demostrado que el cambio, dependiendo de cuándo NPCs se cultivan como neuroesferas 3D en la suspensión o plateado sobre un sustrato de laminina funcional con la conexina la comunicación mediada alterado si las células son cultivadas en plástico y el sustrato o en 3D gratis flotante culturas ^3. El impacto de la posición del móvil en el destino de la APN no está claro. Es un desafío técnico para analizar el impacto de la ubicación espacial dentro de la cultura en 3D sobre la biología de la APN, dado que la evaluación de antígenos de linaje y de proteínas de señalización requiere la interrupción de la arquitectura en 3D para permitir la permeabilización de las células y anticuerpos acceso a todas las células. Aquí mostramos que un método de visualización híbrida proporciona un medio para determinar si ciertas proteínas muestra única posición en la cultura localizaciones en 3D, se puede utilizar para inferir y prueba de función de la proteína y la regulación con respecto a la localización regional dentro de la neuroesfera, y, quizás lo más importante , proporciona los datos de posición necesarios para estudiar el impacto de la topografía en 3D y posicionamiento celular sobre el destino de la APN en la cultura en 3D.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Euthansol	Reagent	Merck & Co.
Krazy Glue	Reagent	Home Hardware
VT1000S vibratome	Equipment	Leica Microsystems
Neural protease	Reagent	Sigma-Aldrich	P6141	Stock solutions stored at -20°C
Papain	Reagent	Sigma-Aldrich	P4762	Stock solutions stored at -20°C
DNAse I	Reagent	Roche Group	11 284 932 001	Stock solutions stored at -20°C
MZ6 Dissecting Microscope	Equipment	Leica Microsystems
ProBlot 6 Hybridization Oven	Equipment	Labnet International
Centrifuge 5702	Equipment	Eppendorf
kPBS	Reagent	BioShop Canada	PBS404
B27 Supplement	Reagent	Invitrogen	17504-044
Ultra Low Binding Tissue Culture Dishes	Disposable	Corning	3261
Human Epidermal growth Factor	Reagent	Invitrogen	13247-051	Stock solutions stored at -20°C
Fibroblast growth factor-2	Reagent	Invitrogen	13256-029	Also known as basic fibroblast growth factor (bFGF) Stock solutions stored at -20°C
37% formaldehyde (molecular grade)	Reagent	Sigma-Aldrich	F8775
Belly Dancer Shaker	Equipment	Stovall Life Sciences, IBI Sciences
Tissue- Tek Cryomold	Disposable	Sakura Finetek	4566
Tissue-Tek OCT compound	Reagent	Sakura Finetek	4583
Whatman Grade 703 Blotting Paper	Disposable	VWR international	28298-020
CM1900 Cryostat	Equipment	Leica Microsystems
Polyclonal Anti-Cx29 Primary Antibody	Reagent	Kindly provided by Dr David Paul, Harvard Medical School		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
Cy3-conjugated donkey anti-rabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
H–chst 33258	Reagent	Sigma-Aldrich	861405
DMRA2 epiflourescent microscope, Orca ER camera, OpenLab v3.56	Equipment/ Software	Leica Microsystems		This protocol can be performed with any epifluorescent or confocal microscope.
Photoshop CS4	Software	Adobe		Graphic software
Maya v10	Software	Autodesk		Modeling software
Computer	Equipment	Intel		Processor: Intel Corei7 920, Memory:12GB DDR3 Video card: Nvidia GTX 285 (1GB RAM)
* All other standard chemical reagents listed in the protocol are from Sigma-Aldrich. All other standard tissue culture reagents are from Invitrogen.