Summary
يوصف بروتوكول الأمثل لعزل الخلايا الجذعية من الغدة اللعابية الماوس. الأسلوب يعمل الهضم الأنزيمي والميكانيكية ، وتراخيص من العزلة salispheres تحتوي على خلايا ذات خصائص الخلايا الجذعية.
Abstract
الغدد اللعابية ناضجة سواء كانت ذات منشأ الإنسان والفأر تشمل الحد الأدنى من أنواع الخلايا الخمس ، كل واحد مما يسهل على إنتاج وإفراز اللعاب في الفم. خلايا عنيبية المصلية والمخاطية هي البروتين والأغشية المخاطية المصانع المنتجة للغدة على التوالي ، وتمثل مصدر إنتاج اللعاب. توليفها مرة واحدة ، تفرز مختلف المكونات البروتينية الأنزيمية وغيرها من اللعاب من خلال سلسلة من الخلايا الظهارية الأقنية التي تحمل نوع التشكل ، وحتى الطرد النهائي للعاب من خلال واحدة القناة الرئيسية في تجويف الفم. كما تم تعديل تركيبة اللعاب من قبل خلايا الأقنية خلال هذه العملية.
في مظهر من مظاهر الأمراض مثل متلازمة سجوجرن ، وفي بعض الحالات السريرية مثل العلاج الإشعاعي لسرطان الرأس والعنق ، وإفراز اللعاب من الغدد تنخفض بشكل كبير 1،2. وجفاف الفم الناتجة عن ذلك ، شعور ذاتي من جفاف الفم ، لا يؤثر فقط على قدرة المريض على البلع والكلام ، ولكنها تشجع أيضا على تطوير وتسوس الأسنان يمكن أن يضعف اجتماعيا لالمتألم.
إعادة إنتاج اللعاب في الظروف المذكورة أعلاه السريرية يمثل بالتالي لم تلب الحاجة الطبية ، وكما العديد من الدراسات أظهرت هذه القدرة على التجدد في الغدد اللعابية 3-5. مزيد من عزلة السكان تشبه الخلايا الجذعية من خلايا الأنسجة المختلفة من خلال الماوس وهيئات حقوق الإنسان 6-8 ، لقد أظهرنا باستخدام الطريقة الموصوفة التي يمكن أن تستخدم الخلايا الجذعية المعزولة من الغدد اللعابية الماوس لانقاذ إنتاج اللعاب في اللعاب المشع الغدد 9،10. هذا الاكتشاف يمهد الطريق لتطوير علاجات الخلايا الجذعية مقرها لمعالجة الأوضاع xerostomic في البشر ، وأيضا لاستكشاف الغدة اللعابية المكروية باعتبارها تحتوي على خلايا ذات القدرات الذاتية multipotent تجديد.
Protocol
1. الوصي التحضير
- العازلة : 1 ٪ (W / V) ألبومين المصل البقري في محلول ملح متوازن هانك
- إعادة الانزيمات. إنزيم هيالورونيداز : 40mg / مل ، الذائبة في العازلة. كولاجيناز الثاني : 23mg / مل ، الذائبة في العازلة. استخدام الحلول الطازجة المعدة أنزيم جديدة لكل العزلة. عندما يذوب ، وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها لعملية الهضم.
- كلوريد الكالسيوم 50 مم في الماء المقطر. فلتر تعقيم خلال 0.2 UM تصفية حجم المسام.
- الماوس الغدة اللعابية المتوسطة الثقافة (MSG) : DMEM : F12 مع البنسلين (100 وحدة دولية / مل) ، وستربتوميسين (100 ميكروغرام / مل) ، glutamax (2 ملم) ، وعامل نمو البشرة - 2 (20 نانوغرام / مل) ، عامل نمو الخلايا الليفية -2 (20 نانوغرام / مل) ، N2 الملحق (1 ٪) ، والانسولين (10 ميكروغرام / مل) ، وديكساميثازون (1 ميكرومتر).
2. الميكانيكية والأنزيمية الأنسجة الهضم
- تزن الغدد اللعابية تشريح.
- ختم الغدد في اللب متجانسة باستخدام مقص العقيمة تشريح المنحني في طبق بتري الصغيرة.
- جمع الأنسجة المفروم في 14 مل من الأنابيب ، وذلك باستخدام 1mL المخزن المؤقت في الأنسجة تحت الفك 80mg. شطف الأطباق بتري نظيفة من النسيج باستخدام بعض العازلة.
- إضافة آخر مل 1 من الأنسجة العازلة في 80 ملغ ، تليها 25 ميكرولتر حل كولاجيناز الانزيم الثاني ، و 25 إنزيم هيالورونيداز حل ميكرولتر و 250 كلوريد الكالسيوم في الأنسجة حل ميكرولتر 80 ملغ. إذا كان يعمل مع كميات كبيرة من الأنسجة ، والخطوات 2.4 -- 2.9 لا يمكن أن يؤديها في قوارير T25 زراعة الأنسجة للراحة.
- احتضان بالحمام المائي في الهز وضعت في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. إزالة أنابيب ومتمزج بواسطة ماصة للاختلاط انزيم بدقة من خلال نسيج جديد.
- في محل بالحمام المائي لمدة 20 دقيقة.
- جمع الأنسجة بواسطة الطرد المركزي في 400 XG ، لمدة 8 دقائق. تجاهل طاف.
- Resuspend العازلة في 2 مل لكل 80 ملغ الأنسجة ، وكرر الانزيمات والكالسيوم بالإضافة إلى كلوريد على النحو الوارد أعلاه. احتضان 20 دقيقة في حمام ماء الهز. إزالة أنابيب ومتمزج بواسطة ماصة لخلط الأنزيمات بدقة.
- لاحتضان النهائي في 20 دقيقة هز حمام الماء. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه ، تجاهل طاف.
3. خطوات الغسيل
- Resuspend ملغ كل 80 من الأنسجة في المخزن 2 و مل ماصة لغسل الأنسجة خالية من الانزيمات.
- الطرد المركزي سابقا لجمع. تجاهل طاف.
- تكرار غسل به العازلة 1 مل لكل 80 ملغ الأنسجة. أجهزة الطرد المركزي لجمع والتخلص من طاف.
4. تصفية
- Resuspend حل في الأنسجة العازلة مل 1 في الأنسجة 80 ملغ.
- إضافة إلى 100 مرشح حل المسام حجم ميكرون وضعت أكثر من 50 مل أنبوب فالكون. لا تنطبق أكثر من 3 ملل من محلول الأنسجة مفروم لكل عمود ، كما قد تصبح مسدودة المرشحات. تتسرب من خلال السماح ل. إزالة المواد التي تمت تصفيتها معلقة على السفلي من تصفية حسب ماصة ، وإضافة إلى الترشيح.
- استخدام المحاقن مع إبرة قياس 26 إلى اتخاذ الراشح من 50mL الأنابيب وتنطبق على المرشحات 50 ميكرومتر حجم المسام على أنابيب 5 مل. السماح لتصفية من خلال تقديم المساعدة من خلال تخفيف الأغطية إذا لزم الأمر.
- أنابيب الطرد المركزي كما في السابق لجمع. تجاهل طاف.
5. الطلاء والمتوسطة
- تجمع كل الكرات في مجلد واحد. العد الآلي باستخدام العداد الخلية أو haemocytometer.
- لوحة الخلايا في كثافة الخلايا 0.4 X 6 10 لكل بئر من 12 لوحة جيدا ، أو 2.67 × 10 6 خلايا الأنسجة T25 في قارورة الثقافة. إضافة 1 مل المتوسط MSG إلى كل بئر أو مل 6 إلى كل قارورة T25.
- احتضان عند 37 درجة مئوية. وينبغي أن تكون مرئية بوضوح مجالات النهار 2.
6. ممثل النتائج :
بعد يومين أو ثلاثة أيام في الثقافة ، فإن مجاميع صغيرة من الخلايا (salispheres) يكون واضحا في الثقافات. وسوف تستمر في النمو Salispheres في الحجم على مدى عشرة أيام في الثقافة. وتظهر الصور المجهري ممثل المرحلة النقيض من salispheres في الشكل 1. يمكن عزل الخلايا الجذعية المتكاثرة معربا عن البروتينات المرتبطة علامة خلية من هذه المجالات ، على النحو الأمثل بين عزلة يوما بعد 3-5 ، وتكون قادرة على التمايز إلى خلايا وظيفية اللعاب ، عنيبية المنتجة.
الشكل 1. تشكيل Salisphere في المختبر. بعد الهضم الميكانيكية والأنزيمية باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن العثور على مجالات زيادة حجم العائمة في الثقافات. لوحات لوحات تمثل المرحلة المجهر النقيض من المجالات من أيام 0 (A) و 4 (ب) و 7 (C) و 10 (D). مقياس بار = 50 ميكرومتر.
Discussion
وصف طريقة زراعة الأنسجة هنا يمثل بروتوكول استنساخه لعزل الخلايا الجذعية التي تحتوي على salispheres من الغدد اللعابية من الفئران. وقد أبرزت الدراسات التي تستخدم الخلايا المعزولة في هذه الطريقة القدرة على التجدد اللعابية الخلايا الجذعية الغدة 9. يسببها زرع الخلايا 100 + ج كيت المستمدة من salispheres الانتعاش وظيفية من الغدد اللعابية الماوس المشع. هذه البيانات هي مثيرة وتوفير نقطة انطلاق للتحقيق في الخلايا الجذعية العلاج استنادا لجفاف الفم. لا تزال العديد من السبل التي ينبغي استكشافها ولكن ، بما في ذلك التعريف الكامل التعبير علامة البروتين من الخلايا الجذعية ، وقدرة الغدد تحت الفك السفلي لانقاذ وظيفة الغدد اللعابية النكفية المشع ، والعكس بالعكس ، وتوصيف المفترضة في الخلية الجذعية المتخصصة في الجسم الحي الخلايا. في نهاية المطاف ، وترجمة هذا البروتوكول لعينات الأنسجة البشرية والإمكانات اللاحقة لعلاج جفاف الفم في المرضى من البشر باستخدام خلايا معزولة هو التطبيق الأكثر إثارة للطريقة وصفها.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Collagenase II | GIBCO, by Life Technologies | 17101-015 | Store at 4 °C |
| Epidermal Growth Factor-2 | Sigma-Aldrich | E9644 | Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots. |
| Fibroblast Growth Factor-2 | Sigma-Aldrich | F0291 | Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots. |
| N2 supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17502-048 | As manufacturer instructions. |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving. |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| 100 μM pore-size sterile cell strainers | BD Biosciences | 352360 | |
| Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) | BD Biosciences | 352235 |
References
- Vissink, A. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).
- Napeñ, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth). Odontology. 97, 76-83 (2009).
- Denny, P. C. Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland. 235, 475-485 (2005).
- Man, Y. G. Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat. J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).
- Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation. Differentiation. 79, 120-130 (2010).
- Eirew, P. A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability. Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).
- Gorjup, E. Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations. European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).
- Alonso, L., Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).
- Lombaert, I. M. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).
- Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage. Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).
