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Biology

माउस लार ग्रंथि स्टेम सेल के अलगाव

doi: 10.3791/2484 Published: February 8, 2011

Summary

माउस लार ग्रंथि से स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल में वर्णित है. विधि enzymatic और यांत्रिक पाचन रोजगार, और स्टेम कोशिकाओं की विशेषताओं के साथ कोशिकाओं से युक्त salispheres के अलगाव परमिट.

Abstract

दोनों मानव और माउस मूल के परिपक्व लार की गिल्टी पांच प्रकार की कोशिकाओं, जिनमें से प्रत्येक मौखिक गुहा में उत्पादन और लार के उत्सर्जन की सुविधा की एक न्यूनतम शामिल हैं. तरल और श्लेष्म कोष्ठकी कोशिकाओं को प्रोटीन और ग्रंथि के श्लेष्म उत्पादन कारखानों क्रमशः रहे हैं, और लार के उत्पादन के मूल का प्रतिनिधित्व करते हैं. एक बार संश्लेषित लार के विभिन्न enzymatic और अन्य proteinaceous घटकों ductal उपकला प्रकार आकारिकी असर कोशिकाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से secreted हैं मुंह के गुहा में एक प्रमुख वाहिनी के माध्यम से लार की अंतिम निष्कासन तक. लार की रचना भी इस प्रक्रिया के दौरान ductal कोशिकाओं द्वारा संशोधित किया गया है.

1,2 Sjögren सिंड्रोम जैसे रोगों की अभिव्यक्ति में है, और सिर और गर्दन की ग्रंथियों द्वारा, लार के उत्पादन के कैंसर के लिए रेडियोथेरेपी उपचार के रूप में कुछ नैदानिक ​​स्थितियों में नाटकीय रूप से कम है. परिणामस्वरूप xerostomia, शुष्क मुँह के एक व्यक्तिपरक लग रहा है, न केवल रोगी की क्षमता को निगल और बात को प्रभावित करता है, लेकिन भी दंत क्षय के विकास को प्रोत्साहित करती है और पीड़ित के लिए सामाजिक दुर्बल हो सकता है.

उपर्युक्त नैदानिक ​​परिस्थितियों में लार के उत्पादन की बहाली इसलिए एक unmet नैदानिक ​​की जरूरत का प्रतिनिधित्व करता है, और जैसे कई अध्ययनों लार 3-5 ग्रंथियों के पुनर्योजी क्षमता का प्रदर्शन किया है. स्टेम माउस और मानव शरीर 6-8 के भीतर विभिन्न ऊतकों से कोशिकाओं के सेल की तरह आबादी के अलगाव के लिए इसके अलावा, हम पता चला है कि स्टेम कोशिकाओं माउस लार ग्रंथियों से अलग विकिरणित लार लार के उत्पादन में बचाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वर्णित विधि का उपयोग 9,10 ग्रंथियों. इस खोज मानव में xerostomic स्थितियों के उपचार के लिए स्टेम सेल आधारित चिकित्सा के विकास के लिए मार्ग प्रशस्त, और भी multipotent स्वयं renewing क्षमताओं के साथ कोशिकाओं से युक्त microenvironment के रूप में लार ग्रंथि के अन्वेषण के लिए.

Protocol

1. रीजेंट तैयारी

  1. बफर: 1% (w / v) हांक संतुलित नमक समाधान में गोजातीय सीरम albumin
  2. Reconstitute एंजाइमों. Hyaluronidase एंजाइम: 40mg / एमएल, बफर में भंग. Collagenase द्वितीय 23mg: / एमएल, बफर में भंग. हौसले से तैयार एंजाइम एक अलगाव के लिए ताजा समाधान का उपयोग करें. जब भंग 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस तक पाचन के लिए उपयोग.
  3. आसुत जल में 50 मिमी कैल्शियम क्लोराइड. एक 0.2 उम ध्यान में लीन होना आकार फिल्टर के माध्यम से बाँझ फ़िल्टर.
  4. लार ग्रंथि माउस (MSG) मध्यम संस्कृति: DMEM: पेनिसिलिन के साथ F12 (100 एमएल / आइयू), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg / एमएल), (2 मिमी) glutamax, epidermal वृद्धि कारक 2 (20 एनजी / एमएल), fibroblast वृद्धि कारक -2 (20 एनजी / एमएल), N2 पूरक (1%), (10 μg / एमएल) इंसुलिन और dexamethasone (1 सुक्ष्ममापी).

2. मैकेनिकल और enzymatic ऊतक पाचन

  1. वजन dissected लार की गिल्टी.
  2. एक समरूप एक छोटे पेट्री डिश में बाँझ घुमावदार विच्छेदन कैंची का उपयोग लुगदी में ग्रंथियों जल्द.
  3. 14 एमएल ट्यूबों में कीमा बनाया हुआ ऊतक, 80mg अवअधोहनुज ऊतक के प्रति बफर के 1ml का उपयोग कर लीजिए. बफर के कुछ का उपयोग ऊतक के पेट्री बर्तन साफ ​​कुल्ला.
  4. प्रति 80 मिलीग्राम ऊतक बफर के एक और 1 एमएल, 25 μL द्वितीय collagenase एंजाइम समाधान, 25 μL hyaluronidase एंजाइम समाधान और 250 प्रति 80 मिलीग्राम ऊतक μL कैल्शियम क्लोराइड समाधान द्वारा पीछा जोड़ें. यदि ऊतकों की बड़ी मात्रा में के साथ काम कर कदम, 2,4 - 2,9 T25 सुविधा के लिए टिशू कल्चर बोतल में प्रदर्शन किया जा सकता है.
  5. एक मिलाते में 37 डिग्री सेल्सियस 20 मिनट के लिए सेट waterbath में सेते हैं. ट्यूबों निकालें और विंदुक द्वारा triturate एंजाइम को अच्छी तरह से ऊतक के माध्यम से फिर से मिश्रण.
  6. एक और 20 मिनट के लिए waterbath में बदलें.
  7. Centrifugation द्वारा ऊतक में 8 मिनट के लिए 400 XG लीजिए. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  8. प्रत्येक 80 मिलीग्राम ऊतक के लिए 2 एमएल बफर में Resuspend, और इसके बाद के संस्करण के रूप में एंजाइम और कैल्शियम क्लोराइड अलावा दोहराने. पानी स्नान मिलाते में 20 मिनट सेते हैं. ट्यूबों निकालें और विंदुक द्वारा triturate एंजाइमों मिश्रण अच्छी तरह से.
  9. पानी स्नान मिलाते में अंतिम 20 मिनट के लिए सेते हैं. Centrifugation द्वारा कोशिकाओं इसके बाद के संस्करण के रूप में ले लीजिए सतह पर तैरनेवाला त्यागने.

3. वॉशिंग कदम

  1. 2 एमएल बफर और एंजाइमों के मुक्त ऊतक धोने विंदुक में प्रत्येक ऊतक के 80 मिलीग्राम Resuspend.
  2. अपकेंद्रित्र के रूप में पहले से इकट्ठा करने के लिए. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  3. प्रति 80 मिलीग्राम ऊतक 1 एमएल बफर का उपयोग कर धोने के लिए दोहराएँ. अपकेंद्रित्र को इकट्ठा करने के लिए, सतह पर तैरनेवाला त्यागने.

4. छनन

  1. 1 प्रति 80 मिलीग्राम ऊतक एमएल बफर में Resuspend ऊतक समाधान.
  2. 100 ताकना आकार सुक्ष्ममापी 50 एमएल फाल्कन ट्यूब पर रखा फिल्टर का हल जोड़ें. स्तंभ प्रति कीमा बनाया हुआ ऊतक समाधान के अधिक से अधिक 3 MLS लागू करने के लिए, के रूप में फिल्टर अवरुद्ध हो सकता है मत करो. के माध्यम से रिसना करने की अनुमति दें. फ़िल्टर विंदुक द्वारा फिल्टर के नीचे पर लटका सामग्री निकालें, और छानना को जोड़ने.
  3. 26 गेज सुई के साथ सिरिंज का प्रयोग 50ml ट्यूब से छानना लेने के लिए और 5 एमएल ट्यूब पर 50 सुक्ष्ममापी ध्यान में लीन होना आकार फिल्टर लागू. के माध्यम से फिल्टर, lids ढीला यदि आवश्यक सहायता की अनुमति दें.
  4. अपकेंद्रित्र ट्यूबों के रूप में पहले से इकट्ठा करने के लिए. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.

5. चढ़ाना और मझौले

  1. एक मात्रा में सभी छर्रों का मिश्रण. स्वचालित सेल काउंटर या haemocytometer का उपयोग गणना.
  2. प्लेट कोशिकाओं के घनत्व में 0.4 x 10 12 अच्छी तरह से थाली के 6 अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं, या 2.67 के एक्स T25 टिशू कल्चर फ्लास्क 6 प्रतिशत 10 कोशिकाओं . प्रत्येक अच्छी तरह से या प्रत्येक T25 फ्लास्क 6 एमएल 1 एमएल MSG मध्यम जोड़ें.
  3. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस क्षेत्रों स्पष्ट रूप से 2 दिन से दिखाई जानी चाहिए.

6. प्रतिनिधि परिणाम:

संस्कृति में दो से तीन दिनों के बाद, कोशिकाओं (salispheres) के छोटे समुच्चय संस्कृतियों में स्पष्ट हो जाएगा. Salispheres संस्कृति में दस दिन की अवधि से अधिक आकार में वृद्धि जारी रहेगा. Salispheres के प्रतिनिधि चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी छवियों चित्र 1 में दिखाया जाता है. Proliferating जुड़े स्टेम सेल मार्कर प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं इन क्षेत्रों से अलग किया जा सकता है, दिन 3-5 पोस्ट अलगाव के बीच बेहतर है, और कार्यात्मक, लार उत्पादन कोष्ठकी कोशिकाओं में भेदभाव करने में सक्षम हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1 इन विट्रो में Salisphere गठन. वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग यांत्रिक और enzymatic पाचन के बाद, बढ़ती आकार के क्षेत्रों अस्थायी संस्कृतियों में पाया जा सकता है. पैनलों प्रतिनिधि 0 (ए) के दिन, 4 से चरण विपरीत क्षेत्रों माइक्रोस्कोपी छवियों (बी), 7 (सी) और 10 (डी) हैं. स्केल बार = 50 सुक्ष्ममापी.

Discussion

टिशू कल्चर विधि यहाँ वर्णित स्टेम सेल युक्त चूहों की लार ग्रंथियों से salispheres के अलगाव के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करता है. इस तरीके से अलग कक्षों का उपयोग अध्ययन लार ग्रंथि में स्टेम 9 कोशिकाओं के पुनर्योजी क्षमता पर प्रकाश डाला है. सी किट + salispheres से निकाली गई कोशिकाओं के एक सौ के ट्रांसप्लांटेशन विकिरणित माउस लार ग्रंथियों के कार्यात्मक वसूली प्रेरित किया. इन आंकड़ों रोमांचक रहे हैं और xerostomia के लिए स्टेम सेल आधारित चिकित्सा की जांच के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करते हैं. कई रास्ते लेकिन पता लगाया पूरी स्टेम सेल मार्कर प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल, अवअधोहनुज ग्रंथियों की क्षमता विकिरणित कर्णमूलीय लार की गिल्टी और इसके विपरीत के समारोह बचाव, और vivo में स्टेम सेल के आला में ख्यात के लक्षण वर्णन सहित रहते हैं कोशिकाओं. अंततः, इस प्रोटोकॉल के मानव ऊतकों के नमूनों और बाद में मानव अलग कक्षों का उपयोग कर रोगियों में xerostomia के उपचार के लिए संभावित अनुवाद वर्णित विधि के सबसे रोमांचक अनुप्रयोग है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506 Store at – 20 °C
Collagenase II GIBCO, by Life Technologies 17101-015 Store at 4 °C
Epidermal Growth Factor-2 Sigma-Aldrich E9644 Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots.
Fibroblast Growth Factor-2 Sigma-Aldrich F0291 Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots.
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048 As manufacturer instructions.
Insulin Sigma-Aldrich I6634 Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
100 μM pore-size sterile cell strainers BD Biosciences 352360
Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) BD Biosciences 352235

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References

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Pringle, S., Nanduri, L. S. Y., Marianne, v. d. Z., Ronald, v. O., Coppes, R. P. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (48), e2484, doi:10.3791/2484 (2011).More

Pringle, S., Nanduri, L. S. Y., Marianne, v. d. Z., Ronald, v. O., Coppes, R. P. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (48), e2484, doi:10.3791/2484 (2011).

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