Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Выделение мышью слюнных желез стволовых клеток

doi: 10.3791/2484 Published: February 8, 2011

Summary

Оптимизированный протокол для выделения стволовых клеток из мыши слюнной железы описана. Метод использует ферментативной и механической пищеварение, и позволяет изоляции salispheres содержащие клетки с характеристиками стволовых клеток.

Abstract

Зрелые слюнных желез как человеческие, так и мышь происхождения составляют менее пяти типов клеток, каждый из которых обеспечивает производство и выделение слюны в полости рта. Серозный и клеток слизистой ацинарных являются белков и слизистых заводы железы, соответственно, и представляют происхождение выработку слюны. Как только синтезируется, различные ферментативные и другие белковые компоненты слюны выделяются через ряд протоков эпителиальных клеток, несущих типа морфологии, до возможной высылке слюной через один крупный канал в полость рта. Состав слюны также влияет протоков клеток во время этого процесса.

В проявлением таких заболеваний, как синдром Шегрена, а в некоторых клинических ситуациях, таких как лучевая терапия для лечения рака головы и шеи, слюны производства желез резко сокращается 1,2. В результате сухость во рту, субъективное ощущение сухости во рту, влияет не только на способности пациента глотать и говорить, но и способствует развитию кариеса зубов и может быть социально изнурительных для больного.

Восстановление выработку слюны в вышеупомянутых клинических состояний, следовательно, представляет неудовлетворенных клинической необходимости, и в этом качестве несколько исследований показали, регенеративная способность слюнных желез 3-5. В дополнение к изоляции стволовых клеток, как популяций клеток из различных тканей в мыши и человеческих тел, 6-8, мы показали, описанным способом, что стволовые клетки, выделенные из мыши слюнных желез могут быть использованы, чтобы спасти производство слюны при облучении слюнных желез 9,10. Это открытие открывает путь к развитию на основе стволовых клеток терапий для лечения xerostomic условиях в организме человека, а также для исследования слюнных желез, как микросреда, содержащих клетки с мультипотентные самообновлению возможностей.

Protocol

1. Регент подготовка

  1. Буфер: 1% (м / о) бычьего сывороточного альбумина в сбалансированном солевом растворе Хэнка
  2. Развести ферментов. Гиалуронидаза фермента: 40 мг / мл, растворяют в буфере. Коллагеназы II: 23mg / мл, растворяют в буфере. Используйте свежеприготовленные фермента решения свежей для каждого изоляции. При растворении, хранить при 4 ° С до использования для пищеварения.
  3. 50 мМ хлорида кальция в дистиллированной воде. Фильтры стерилизовать через 0,2 мкм поры фильтра размера.
  4. Мышь слюнной железы (MSG) культуральная среда: DMEM: F12 с пенициллином (100 МЕ / мл), стрептомицин (100 мкг / мл), glutamax (2 мМ), эпидермальный фактор роста-2 (20 нг / мл), фактор роста фибробластов -2 (20 нг / мл), N2 дополнение (1%), инсулин (10 мкг / мл) и дексаметазоном (1 мкМ).

2. Механические и ферментативной тканей Пищеварение

  1. Взвесьте расчлененный слюнных желез.
  2. Чоп желез в однородную целлюлозы с использованием стерильных изогнутые ножницы рассечение в маленькой чашке Петри.
  3. Сбор измельченной ткани в 14 мл трубы, с помощью 1 мл буфера в 80 мг подчелюстной ткани. Полоскание чашки Петри чистой ткани, используя некоторые из буфера.
  4. Добавьте еще 1 мл буфера на 80 мг ткани, а затем 25 мкл коллагеназа II раствора фермента, 25 мкл раствора фермента гиалуронидазы и 250 мкл раствора хлорида кальция на 80 мг ткани. При работе с большим количеством ткани, шаги 2,4 - 2,9 может быть выполнена в культуре ткани T25 Колбы для удобства.
  5. Инкубируйте в пожимая водяной бане установлена ​​на уровне 37 ° С в течение 20 минут. Удалить труб и растирают пипеткой для смешивания ферментов тщательно через ткани снова.
  6. Заменить в водяной бане в течение еще 20 минут.
  7. Сбор ткани с помощью центрифугирования при 400 мкг, в течение 8 минут. Удалите супернатант.
  8. Ресуспендируют в 2 мл буфера для каждого 80 мг ткани, и повторить фермента и помимо хлорида кальция, что и выше. Инкубируйте 20 минут тряски в водяной бане. Удалить труб и растирают пипеткой для смешивания ферментов тщательно.
  9. Инкубировать последние 20 минут тряски в водяной бане. Сбор клетки центрифугированием, как выше, отбросить супернатант.

3. Стиральная шаги

  1. Ресуспендируют каждые 80 мг ткани в 2 мл буфера и пипетки для мытья ткани свободных ферментов.
  2. Центрифуга, как ранее, чтобы собраться. Удалите супернатант.
  3. Повторите мыть с использованием 1 мл буфера на 80 мг ткани. Центрифуга для сбора, отбросить супернатант.

4. Фильтрация

  1. Ресуспендируют ткани раствор в 1 мл буфера на 80 мг ткани.
  2. Добавить решение до 100 мкм пор по размерам фильтре, расположенном более чем в 50 мл трубки Falcon. Не применять более 3 мл рубленого решение ткани на колонке, а фильтры могут быть заблокированы. Разрешить просачиваться. Удалить фильтруется материал висит на нижней фильтра пипеткой, и добавить к фильтрату.
  3. Используйте шприц с иглой 26 взять 50 мл фильтрата из труб и применяются до 50 мкм поры фильтров размером по 5 мл пробирок. Позвольте фильтр, помощь, ослабив крышками, если необходимо.
  4. Пробирки центрифужные, как ранее, чтобы собраться. Удалите супернатант.

5. Покрытие и среднего

  1. Смешайте все гранулы в одном томе. Граф с помощью автоматизированных счетчик ячейки или гемоцитометра.
  2. Пластина клетки при плотности 0,4 х 10 6 клеток на лунку 12-луночного планшета, или 2,67 х 10 6 клеток на T25 колбу культуры ткани. Добавьте 1 мл MSG среду в каждую лунку или 6 мл на каждый T25 колбу.
  3. Инкубировать при 37 ° C. Сферы, должны быть четко видимые днем ​​2.

6. Представитель Результаты:

Через два-три дня в области культуры, малые агрегаты клеток (salispheres) будет очевидным в культурах. Salispheres будет продолжать увеличиваться в размерах в течение десяти дней в культуре. Представитель микроскопии фазового контраста изображения salispheres показаны на рисунке 1. Пролиферирующих клеток, экспрессирующих стволовых клеток, белков, связанных с маркером может быть изолирована от этих сфер, оптимально 3-5 дней между сообщению изоляции, и способны к дифференцировке в функциональные, слюна ацинарных клеток.

Рисунок 1
Рисунок 1. Salisphere образование в пробирке. После механического и ферментативного пищеварения использовании настоящего протокола, сферы увеличением размера можно найти в плавучий культурами. Панели представитель фазового контраста изображения микроскопии сфер от нескольких дней 0 (), 4 (B), 7 (C) и 10 (D). Шкала бар = 50 мкм.

Discussion

Метод культуры тканей, описанные здесь представляет воспроизводимый протокол для выделения стволовых клеток, содержащих salispheres из слюнных желез мышей. Исследования с использованием клеток, выделенных таким образом выявили регенеративная способность слюнной железы стволовыми клетками 9. Трансплантация сто с-Kit + клетки, полученные из индуцированных salispheres функционального восстановления облученных мышей слюнных желез. Эти данные являются захватывающими и обеспечить отправную точку для исследования стволовых клеток для терапии, основанной на сухость во рту. Многие пути еще предстоит исследовать однако, в том числе полного маркера экспрессии белка профиля стволовых клеток, способность подчелюстной желез, чтобы спасти функции облученных околоушной слюнной железы, и наоборот, и характеристика предполагаемых в естественных условиях стволовые клетки ниши клеток. В конечном счете, перевод этот протокол для образцов человеческой ткани и последующем потенциал для лечения ксеростомии в человеческом пациентов с использованием изолированных клеток является самым захватывающим применения описанного метода.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506 Store at – 20 °C
Collagenase II GIBCO, by Life Technologies 17101-015 Store at 4 °C
Epidermal Growth Factor-2 Sigma-Aldrich E9644 Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots.
Fibroblast Growth Factor-2 Sigma-Aldrich F0291 Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots.
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048 As manufacturer instructions.
Insulin Sigma-Aldrich I6634 Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
100 μM pore-size sterile cell strainers BD Biosciences 352360
Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) BD Biosciences 352235

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vissink, A. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).
  2. Napeñ, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth). Odontology. 97, 76-83 (2009).
  3. Denny, P. C. Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland. 235, 475-485 (2005).
  4. Man, Y. G. Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat. J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).
  5. Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation. Differentiation. 79, 120-130 (2010).
  6. Eirew, P. A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability. Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).
  7. Gorjup, E. Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations. European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).
  8. Alonso, L., Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).
  9. Lombaert, I. M. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).
  10. Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage. Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).
Выделение мышью слюнных желез стволовых клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pringle, S., Nanduri, L. S. Y., Marianne, v. d. Z., Ronald, v. O., Coppes, R. P. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (48), e2484, doi:10.3791/2484 (2011).More

Pringle, S., Nanduri, L. S. Y., Marianne, v. d. Z., Ronald, v. O., Coppes, R. P. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (48), e2484, doi:10.3791/2484 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter