Summary
マウス唾液腺由来の幹細胞の単離のため最適化されたプロトコルが記述されています。方法は、酵素と機械的な消化を採用しており、幹細胞の特性を持つ細胞を含むsalispheresの分離を可能にします。
Abstract
ヒトとマウスの両方由来の成熟した唾液腺は口腔内に唾液の生産と排泄を促進するそれぞれの5つの細胞型、の最小値を含んで。漿液性と粘液腺房細胞は、それぞれ蛋白質と腺の粘液産生工場であり、唾液の生産の原点を表しています。一度合成さ、唾液の様々な酵素や他のタンパク質性の成分が口の中の空洞に一つの主要なダクトを介して唾液の最終的な追放されるまで、上皮型の形態をもつ管細胞の一連の分泌される。唾液の組成物はまた、このプロセス中に乳管細胞によって変更されます。
このようなシェーグレン症候群などの疾患の症状で、そのような頭頸部癌に対する放射線治療のようないくつかの臨床状況において、腺によって唾液の生産が飛躍的に1,2を削減されます。結果として口腔乾燥、口内乾燥の主観的な感覚は、飲み込むと話すように患者のだけでなく、能力に影響を与えるだけでなく、虫歯の開発を奨励し、被害者のための社会的に衰弱させることができます。
上記の臨床症状で唾液の生産の回復は、したがって、満たされていない臨床上の必要性を表し、そしてそのようないくつかの研究では、唾液腺3-5の再生能力を実証しているとして。幹細胞のようなマウスおよびヒトの体6から8までの様々な組織からの細胞集団の単離にさらに、我々はマウス唾液腺から単離された幹細胞を照射唾液で唾液の産生を救出するために使用できることを説明した方法を用いて示されている腺9,10。この発見は、多能性自己再生機能を持つ細胞を含む微小環境としての唾液腺の探査のためにも、ヒトのxerostomic状態の治療に幹細胞ベースの治療法の開発のための道を開く、と。
Protocol
1。リージェントの準備
- バッファー：1％（w / v）のハンクス平衡塩溶液にウシ血清アルブミン
- 再構成酵素。ヒアルロニダーゼ酵素：40mgの/ mLを、緩衝液に溶解した。コラゲナーゼII：23mg / mLの、緩衝液に溶解した。それぞれの分離のための新鮮な作りたての酵素液を使用してください。 4℃で溶解、店舗℃で消化するため、使用するまで。
- 蒸留水に50 mMの塩化カルシウム。 0.2μMの孔径のフィルターを通して滅菌フィルタリング。
- マウス唾液腺（MSG）の培地：DMEM：ペニシリンとF12（100 IU / mL）を、ストレプトマイシン（100μg/ mL）を、グルタミン（2mM）を、上皮増殖因子-2（20 ng / mL）を、線維芽細胞増殖因子-2（20 ng / mL）を、N2サプリメント（1％）、インスリン（10μg/ mLの）とデキサメタゾン（1μM）。
2。機械的および酵素組織消化
- 解剖唾液腺の重量を量る。
- 小さなペトリ皿の中で無菌湾曲した解剖鋏を使用して均質なパルプに腺を切る。
- 80mg顎下腺組織ごとのバッファ液1mLを使用して、14 mLチューブにみじん切りの組織を収集する。バッファの一部を用いて組織のきれいなペトリ皿をすすぐ。
- 25μLコラゲナーゼIIの酵素溶液、25μLのヒアルロニダーゼ酵素溶液と80 mgの組織ごとに250μLの塩化カルシウム溶液に続いて、80 mgの組織ごとにバッファの別の1 mLを追加します。組織の大量の作業をする場合、ステップ2.4から2.9までは、利便性のためにT25組織培養フラスコで行うことができます。
- 20分間37℃に設定した振とうしながら水浴中でインキュベートする。チューブを外し、再び組織を徹底的に酵素を混合し、ピペットでひいて粉にする。
- 別の20分間水浴中で交換してください。
- 8分間、400 × gで遠心分離して組織を採取します。上清を捨てる。
- 各80 mgの組織を2 mLのバッファーで再懸濁し、そして上記のように酵素と塩化カルシウムの添加を繰り返す。水浴を振りで20分間インキュベートする。チューブを外し、徹底的に酵素を混合し、ピペットでひいて粉にする。
- 水浴を振っての最後の20分間インキュベートします。上記のように遠心分離により細胞を収集し、上清を捨てる。
3。洗浄のステップ
- 2mLのバッファーと酵素の自由な組織を洗浄するのにピペットで組織の各80mgを懸濁します。
- 収集するように以前に遠心する。上清を捨てる。
- 80mgの組織あたり1mLの緩衝液を用いて洗浄を繰り返します。収集する心し、上清を捨てる。
4。フィルタリング
- 80mgの組織ごとに1 mLのバッファーで組織液を再懸濁します。
- 50mlのファルコンチューブの上に配置さ100μm、空孔サイズのフィルターにソリューションを追加します。フィルタがブロックされる可能性があるので、列ごとミンチ組織のソリューションの3つ以上のMLSを適用しないでください。を通じて浸透することができます。ピペットでフィルターの下側にぶら下がってフィルタリングされた材料を除去し、ろ液に加える。
- 50mLのチューブからろ液を取り、5 mLチューブ上に50μmの孔径のフィルターに適用する26ゲージの針で注射器を使用してください。必要に応じて、ふたを緩めて、支援、通過フィルタすることができます。
- 遠心チューブは、以前に収集する。上清を捨てる。
5。メッキとミディアム
- 1つのボリュームにすべてのペレットを組み合わせる。自動細胞計数器またはhaemocytometerを使用して数える。
- ウェル12ウェルプレートの当り0.4 × 10 6個の細胞、またはT25組織培養フラスコあたり2.67 × 10 6細胞の密度で細胞をプレート。各ウェルに1mLのMSG媒体または各T25フラスコに6mLのを追加。
- 37 ° C.球は2日目からはっきりと見えるはずです。
6。代表的な結果：
文化の中で2〜3日後、細胞（salispheres）の小さな凝集体は、培養では明らかであろう。 Salispheresは、培養中の10日間にわたって大きさに成長していきます。 salispheresの代表的な位相差顕微鏡像を図1に示されています。幹細胞関連マーカータンパク質を発現する増殖する細胞は、最適に日3月5日後の分離の間に、これらの球から単離し、機能性、唾液産生腺房細胞への分化が可能であることができる。
図1 in vitroで Salisphere形成。現在のプロトコルを使用して機械的および酵素的消化に続いて、増加するサイズの球体は浮遊培養では見つけることができます。パネルは、0日目（A）、4から球の代表的な位相差顕微鏡像（B）、7（C）と10（D）です。スケールバー= 50μmの。
Discussion
ここで説明した組織培養法は、幹細胞を含むマウスの唾液腺からsalispheresを単離するための再現可能なプロトコルを表します。この方法で単離した細胞を用いた研究は、9唾液腺幹細胞の再生能力を強調している。 salispheresから派生したのc - Kit +細胞の百の移植は、照射したマウス唾液腺の機能回復を誘導した。これらのデータは、エキサイティングであり、口腔乾燥のための幹細胞ベースの治療法の調査の出発点を提供しています。多くの道は、幹細胞の完全なマーカータンパク質の発現プロファイル、照射された耳下腺唾液腺およびその逆の機能を救出するために顎下腺の能力、とのin vivoで幹細胞のニッチにおける推定の特性評価を含む、しかし調査されずに残っている細胞。最終的に、ヒトの組織サンプルや単離細胞を用いて、ヒトの患者における口腔乾燥症の治療のためのその後の可能性に、このプロトコルの変換は、記載された方法の中で最もエキサイティングなアプリケーションです。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Collagenase II | GIBCO, by Life Technologies | 17101-015 | Store at 4 °C |
| Epidermal Growth Factor-2 | Sigma-Aldrich | E9644 | Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots. |
| Fibroblast Growth Factor-2 | Sigma-Aldrich | F0291 | Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots. |
| N2 supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17502-048 | As manufacturer instructions. |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving. |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| 100 μM pore-size sterile cell strainers | BD Biosciences | 352360 | |
| Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) | BD Biosciences | 352235 |
References
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