Summary
Ein optimiertes Protokoll für die Isolierung von Stammzellen aus der Maus Speicheldrüse beschrieben. Die Methode nutzt enzymatische und mechanische Verdauung, und erlaubt Isolierung salispheres enthaltenden Zellen mit Eigenschaften von Stammzellen.
Abstract
Ältere Speicheldrüsen von Mensch und Maus Herkunft aus einem Minimum von fünf Zelltypen, von denen jede die Produktion und Ausschüttung von Speichel erleichtert in die Mundhöhle. Serösen und Schleimhäuten Azinuszellen sind die Protein-und Schleim produzieren Fabriken der Drüse bzw. und stellen den Ursprung der Speichelproduktion. Sobald synthetisiert werden die verschiedenen enzymatischen und anderen proteinhaltigen Komponenten des Speichels durch eine Reihe von duktalen Zellen, die epithelial-Art-Morphologie abgesondert wird, bis die eventuellen Ausweisung der Speichel durch einen großen Kanal in der Mundhöhle. Die Zusammensetzung des Speichels wird auch durch den duktalen Zellen während dieses Prozesses verändert.
In der Manifestation von Krankheiten wie Sjögren-Syndrom, und in einigen klinischen Situationen wie Strahlentherapie bei Kopf-Hals-Tumoren, die Speichelproduktion durch die Drüsen ist dramatisch 1,2 reduziert. Die daraus resultierenden Xerostomie, ein subjektives Gefühl der Mundtrockenheit, betrifft nicht nur die Fähigkeit des Patienten zu schlucken und sprechen, sondern fördert auch die Entwicklung von Karies und kann sozial schwächenden für den Erkrankten.
Die Wiederherstellung der Speichel-Produktion in den oben genannten klinischen Bedingungen stellt daher einen ungedeckten klinischen Bedarf, und als solche haben mehrere Studien die Regenerationsfähigkeit der Speicheldrüsen 3-5 gezeigt. Im Anschluss an die Isolierung von Stammzellen, wie Populationen von Zellen aus verschiedenen Geweben innerhalb der Maus und menschlichen Körpern 6-8, haben wir gezeigt, mit dem beschriebenen Verfahren, dass Stammzellen aus der Maus Speicheldrüsen isoliert verwendet werden, um die Speichelproduktion in bestrahlten Speicheldrüsen zu retten Drüsen 9,10. Diese Entdeckung ebnet den Weg für die Entwicklung von Stammzell-basierten Therapien für die Behandlung von Xerostomie Verhältnisse beim Menschen, aber auch für die Erforschung der Speicheldrüse als Mikroumgebung enthaltenden Zellen mit multipotenten selbst erneuernde Fähigkeiten.
Protocol
1. Regent Vorbereitung
- Buffer: 1% (w / v) Rinderserumalbumin in balanced salt Hank-Lösung
- Rekonstituieren Enzyme. Hyaluronidase-Enzym: 40 mg / mL, in Puffer gelöst. Collagenase II: 23 mg / mL, in Puffer gelöst. Verwenden Sie frisch zubereitete Enzymlösungen frisch für jede Isolation. Wenn aufgelöst, Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung für die Verdauung.
- 50 mM Calciumchlorid in destilliertem Wasser. Filter durch einen 0,2 uM Filter mit einer Porengröße zu sterilisieren.
- Maus Speicheldrüse (MSG) Kulturmedium: DMEM: F12 mit Penicillin (100 IU / mL), Streptomycin (100 ug / mL), Glutamax (2 mM), epidermal growth factor-2 (20 ng / mL), Fibroblasten-Wachstumsfaktor -2 (20 ng / mL), N2 gegen Aufpreis (1%), Insulin (10 ug / ml) und Dexamethason (1 pM).
2. Mechanische und enzymatische Verdauung Tissue
- Wiegen Sie die seziert Speicheldrüsen.
- Hacken Drüsen zu einem homogenen Brei mit sterilen gebogenen Dissektion Schere in einer kleinen Petrischale.
- Sammeln Sie zerkleinerten Gewebes in 14 ml-Röhrchen mit 1 ml Puffer pro 80mg submandibularis Gewebe. Spülen Sie die Petrischalen sauber von Gewebe mit einigen der Puffer.
- Add another 1 ml Puffer pro 80 mg Gewebe, von 25 ul Kollagenase II Enzymlösung, 25 ul Hyaluronidase Enzymlösung und 250 ul Calciumchlorid-Lösung pro 80 mg Gewebe gefolgt. Wenn die Arbeit mit großen Mengen von Gewebe, Schritte von 2,4 bis 2,9 in T25 Zellkulturflaschen für die Bequemlichkeit durchgeführt werden kann.
- Inkubieren in einem Schüttel-Wasserbad bei 37 ° C für 20 Minuten. Entfernen Sie Rohre und verreiben mit einer Pipette auf Enzym gründlich mischen durch das Gewebe wieder.
- Ersetzen Sie im Wasserbad für weitere 20 Minuten.
- Sammeln Gewebe durch Zentrifugation bei 400 xg für 8 Minuten. Überstand.
- Resuspendieren in 2 ml Puffer für je 80 mg Gewebe, und wiederholen Enzym und Calciumchlorid zusätzlich wie oben beschrieben. Inkubieren 20 Minuten in Schüttelwasserbad. Entfernen Sie Rohre und verreiben durch eine Pipette, um Enzyme gründlich zu mischen.
- Inkubieren letzten 20 min in Schüttelwasserbad. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation wie oben, Überstand verwerfen.
3. Waschschritte
- Resuspendieren je 80 mg Gewebe in 2 mL Puffer und Pipette, um Gewebe frei von Enzymen zu waschen.
- Centrifuge wie zuvor zu sammeln. Überstand.
- Wiederholen Sie waschen mit 1 mL Puffer pro 80 mg Gewebe. Centrifuge zu sammeln, Überstand verwerfen.
4. Filtering
- Resuspendieren Gewebe Lösung in 1 mL Puffer pro 80 mg Gewebe.
- Add-Lösung bis 100 um Porengröße Filter über 50 mL Falcon-Röhrchen platziert. Nicht mehr als 3 ml zerkleinerte Gewebe Lösung pro Spalte, die als Filter blockiert werden. Lassen Sie die durchsickern. Entfernen Sie gefilterte Material hängen an der Unterseite des Filters durch eine Pipette, und fügen Sie Filtrat.
- Verwenden Spritze mit 26-Gauge-Nadel, um Filtrat von 50ml Röhrchen nehmen und gelten bis 50 Mikrometer Porengröße Filter auf 5 ml Tuben. Lassen Sie die Filter, durch, unterstützt durch Lösen Deckel, wenn nötig.
- Zentrifugenröhrchen wie zuvor zu sammeln. Überstand.
5. Plating-und Mittelbetriebe
- Kombinieren Sie alle Pellets in einem Band. Graf mit automatisierten Zelle Zähler oder Hämocytometer.
- Platte Zellen bei einer Dichte von 0,4 x 10 6 Zellen pro Vertiefung einer 12-Well-Platte, oder 2,67 x 10 6 Zellen pro T25 Zellkulturflasche. 1 ml MSG Medium in jede Vertiefung oder 6 ml in jedes T25 Kolben.
- Inkubation bei 37 ° C. Spheres muss deutlich sichtbar von Tag 2.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Nach zwei Minuten vor drei Tagen in Kultur werden kleine Aggregate von Zellen (salispheres) werden in den Kulturen deutlich. Salispheres wird weiterhin in der Größe über einen Zeitraum von zehn Tagen in Kultur zu züchten. Vertreter Phasenkontrast-Mikroskopie-Aufnahmen von salispheres sind in Abbildung 1 dargestellt. Proliferierenden Zellen, die Stammzellen-assoziierte Markerproteine können aus diesen Bereichen isoliert werden, optimal zwischen Tage 3-5 post Isolation und sind in der Lage Differenzierung in funktionale, Speichel produzieren Azinuszellen.
Abbildung 1. Salisphere Bildung in vitro. Nach der mechanischen und enzymatischen Aufschluss über die vorliegende Protokoll, können Kugeln mit zunehmender Größe in der schwimmenden Kulturen gefunden werden. Panels sind repräsentativ für die Phasenkontrast-Mikroskopie Bilder von Kugeln von Tagen 0 (A), 4 (B), 7 (C) und 10 (D). Balken = 50 um.
Discussion
Die Gewebekultur hier beschriebene Methode stellt eine reproduzierbare Protokoll für die Isolierung von Stammzellen mit salispheres aus den Speicheldrüsen der Mäuse. Studien unter Verwendung von Zellen auf diese Weise isoliert wurden, die Regenerationsfähigkeit der Speicheldrüse Stammzellen Zellen 9 hervorgehoben. Die Transplantation von hundert von c-Kit +-Zellen aus dem salispheres abgeleitet induzierte funktionelle Erholung von bestrahlten Maus Speicheldrüsen. Diese Daten sind spannend und bieten einen Ausgangspunkt für die Untersuchung von Stammzell-Therapie für Xerostomie. Viele Wege bleiben jedoch untersucht werden, einschließlich der vollständigen Markerprotein Expressionsprofil der Stammzellen, die Fähigkeit der submandibularis, um die Funktion der bestrahlten Parotis Speicheldrüsen und umgekehrt zu retten, und die Charakterisierung der putativen in vivo Stammzellnische der der Zellen. Letztlich ist die Übersetzung dieses Protokoll für die menschliche Gewebeproben und die anschließende Potenzial für die Therapie der Xerostomie bei menschlichen Patienten unter Verwendung der isolierten Zellen der aufregendsten Anwendung der beschriebenen Methode.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Collagenase II | GIBCO, by Life Technologies | 17101-015 | Store at 4 °C |
| Epidermal Growth Factor-2 | Sigma-Aldrich | E9644 | Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots. |
| Fibroblast Growth Factor-2 | Sigma-Aldrich | F0291 | Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots. |
| N2 supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17502-048 | As manufacturer instructions. |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving. |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| 100 μM pore-size sterile cell strainers | BD Biosciences | 352360 | |
| Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) | BD Biosciences | 352235 |
References
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