Summary
Een geoptimaliseerde protocol voor de isolatie van stamcellen van de muis speekselklier wordt beschreven. De methode maakt gebruik van enzymatische en mechanische spijsvertering, en laat de isolatie van salispheres met cellen met kenmerken van stamcellen.
Abstract
Ouder speekselklieren van zowel mens en muis oorsprong bestaan uit een minimum van vijf celtypen, die elk de productie en de uitscheiding van speeksel vergemakkelijkt in de mondholte. Sereuze en slijmvliezen acinaire cellen zijn de eiwit en slijmvliezen produceren de fabrieken van de klier respectievelijk, en vertegenwoordigen de herkomst van de speekselproductie. Eenmaal gesynthetiseerd, worden de verschillende enzymatische en andere eiwitachtige componenten van speeksel uitgescheiden door middel van een serie van ductale cellen die epitheliale-type morfologie, tot de uiteindelijke verdrijving van het speeksel door middel van een grote buis in de holte van de mond. De samenstelling van het speeksel is ook aangepast door de ductale cellen tijdens dit proces.
In de manifestatie van ziekten zoals het syndroom van Sjögren, en in sommige klinische situaties zoals radiotherapie de behandeling van hoofd-halskanker, speeksel productie door de klieren wordt drastisch verminderd 1,2. De resulterende xerostomie, een subjectief gevoel van een droge mond, beïnvloedt niet alleen het vermogen van de patiënt om te slikken en spreken, maar ook stimuleert de ontwikkeling van tandcariës en kan worden sociaal invaliderend voor de patiënt.
De restauratie van speeksel productie in de bovengenoemde klinische aandoeningen is dan ook een onbeantwoorde een klinische noodzaak, en als zodanig een aantal studies hebben aangetoond dat de regeneratieve capaciteit van de speekselklieren 3-5. Naar aanleiding van het isolement van stamcel-achtige populaties van cellen van verschillende weefsels in de muis en het menselijk lichaam 6-8, hebben we laten zien met behulp van de beschreven methode die stamcellen geïsoleerd uit muizen speekselklieren kan worden gebruikt om de speekselproductie in bestraalde speekselklieren te redden klieren 9,10. Deze ontdekking maakt de weg vrij voor de ontwikkeling van stamcel-gebaseerde therapieën voor de behandeling van xerostomic aandoeningen bij mensen, en ook voor de verkenning van de speekselklier als een micro-omgeving bevat cellen met multipotente zelfvernieuwende mogelijkheden.
Protocol
1. Regent Voorbereiding
- Buffer: 1% (w / v) bovine serum albumine in gebalanceerde zoutoplossing Hank's
- Reconstrueren enzymen. Hyaluronidase enzym: 40 mg / ml, opgelost in buffer. Collagenase II: 23 mg / ml, opgelost in buffer. Gebruik vers bereide oplossingen enzym vers voor elke isolatie. Toen opgelost, bewaren bij 4 ° C tot gebruik voor de spijsvertering.
- 50 mM calciumchloride in gedestilleerd water. Filter steriliseren door een 0,2 uM poriegrootte filter.
- Muis speekselklier (MSG) cultuur medium: DMEM: F12 met penicilline (100 IU / ml), streptomycine (100 ug / ml), Glutamax (2 mM), epidermale groeifactor-2 (20 ng / ml), fibroblast groeifactor -2 (20 ng / ml), N2 supplement (1%), insuline (10 ug / ml) en dexamethason (1 uM).
2. Mechanische en enzymatische Tissue Spijsvertering
- Weeg de ontleed speekselklieren.
- Hak klieren in een homogene pulp met gebruikmaking van steriele gebogen dissectie schaar in een kleine petrischaal.
- Verzamel gehakt weefsel in 14 ml buizen, met behulp van 1 ml van de buffer per 80 mg submandibulaire weefsel. Spoel de petrischaaltjes schoon van weefsel met behulp van een aantal van de buffer.
- Voeg nog een 1 ml buffer per 80 mg weefsel, gevolgd door 25 pi collagenase II enzymoplossing, 25 il hyaluronidase enzymoplossing en 250 uL calciumchloride oplossing per 80 mg weefsel. Als het werken met grote hoeveelheden weefsel, op een steenworp 2,4 tot 2,9 kan worden uitgevoerd in T25 weefselkweek flessen voor het gemak.
- Incubeer in een schuddend waterbad ingesteld op 37 ° C gedurende 20 minuten. Verwijder de buizen en vermaal met een pipet om grondig te mengen enzym door het weefsel opnieuw.
- Vervang in waterbad voor nog eens 20 minuten.
- Verzamel materiaal door middel van centrifugatie bij 400 xg, 8 minuten. Gooi supernatant.
- Resuspendeer in 2 mL buffer voor elke 80 mg weefsel, en herhaal enzym en calciumchloride aanvulling als hierboven. Incubeer 20 minuten in schudwaterbad. Verwijder de buizen en vermaal met een pipet om grondig te mengen enzymen.
- Incubeer voor de laatste 20 minuten in schudwaterbad. Verzamel cellen door centrifugeren, zoals hierboven, gooi supernatant.
3. Wasstappen
- Resuspendeer elk 80 mg van het weefsel in 2 mL buffer en pipet aan het weefsel vrij van enzymen te wassen.
- Centrifuge, zoals eerder te verzamelen. Gooi supernatant.
- Herhaal wassen met behulp van een mL buffer per 80 mg weefsel. Centrifuge te verzamelen, supernatant weggooien.
4. Filteren
- Resuspendeer weefsel oplossing in 1 ml buffer per 80 mg weefsel.
- Voeg oplossing tot 100 urn poriegrootte filter geplaatst over 50 ml Falcon buis. Niet van toepassing meer dan 3 ml van gehakt weefsel oplossing per kolom, zoals filters verstopt kunnen raken. Laat sijpelen door. Verwijder gefilterd materiaal opknoping aan de onderkant van het filter met een pipet, en toe te voegen aan filtraat.
- Gebruik injectiespuit met 26 gauge naald te filtraat te nemen van 50 ml buizen en tot 50 urn poriegrootte filters op 5 ml buizen toe te passen. Laat filteren door middel van, helpen door het losdraaien van deksels indien nodig.
- Centrifugebuizen zoals eerder te verzamelen. Gooi supernatant.
5. Plating-en Kleinbedrijf
- Combineer alle pellets in een volume. Tellen met behulp van geautomatiseerde cel-counter of hemocytometer.
- Plaat cellen op dichtheid van 0,4 x 10 6 cellen per putje van 12-well plaat, of 2,67 x 10 6 cellen per T25 weefselkweek kolf. Voeg 1 mL MSG medium aan elk putje of 6 mL aan elke T25 fles.
- Incubeer bij 37 ° C. Bollen moet duidelijk zichtbaar zijn op dag 2.
6. Representatieve resultaten:
Na twee tot drie dagen in cultuur, zullen kleine aggregaten van cellen (salispheres) blijken in de culturen. Salispheres zal blijven in omvang te groeien in een periode van tien dagen in cultuur. Vertegenwoordiger van fase contrast microscopie beelden van salispheres zijn weergegeven in figuur 1. Delende cellen die stamcel-geassocieerde marker eiwitten kunnen worden geïsoleerd uit deze sferen, optimaal tussen de dagen 3-5 na de isolatie, en zijn in staat van differentiatie in functionele, speeksel produceren acinaire cellen.
Figuur 1. Salisphere vorming in vitro. Na de mechanische en enzymatische vertering met behulp van het huidige protocol, kan sferen van toenemende grootte te vinden in de zwevende culturen. Panelen zijn representatief voor fase-contrast-microscopie beelden van de bollen van dag 0 (A), 4 (B), 7 (C) en 10 (D). Schaalbalk = 50 pm.
Discussion
De weefselkweek hier beschreven methode is een reproduceerbaar protocol voor de isolatie van stamcellen-bevattende salispheres uit de speekselklieren van muizen. Studies met behulp van cellen die geïsoleerd op deze manier hebben gewezen op de regeneratieve capaciteit van de speekselklier stamcellen 9. Transplantatie van honderd van de c-Kit + cellen, afkomstig van de salispheres geïnduceerde functionele herstel van bestraalde muis speekselklieren. Deze gegevens zijn spannend en bieden een uitgangspunt voor het onderzoek van de stam-cel-gebaseerde therapie voor xerostomie. Veel wegen nog moet echter worden onderzocht, inclusief de volledige marker-eiwit expressie profiel van de stamcellen, het vermogen van submandibulaire klieren aan de functie van bestraalde parotis speekselklieren en vice versa te redden, en de karakterisering van de vermeende in vivo stamcellen niche van de cellen. Uiteindelijk is de vertaling van dit protocol om menselijk weefsel monsters en de daaropvolgende potentieel voor de behandeling van xerostomie in menselijke patiënten met behulp van de geïsoleerde cellen is de meest opwindende toepassing van de beschreven methode.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Collagenase II | GIBCO, by Life Technologies | 17101-015 | Store at 4 °C |
| Epidermal Growth Factor-2 | Sigma-Aldrich | E9644 | Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots. |
| Fibroblast Growth Factor-2 | Sigma-Aldrich | F0291 | Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots. |
| N2 supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17502-048 | As manufacturer instructions. |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving. |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| 100 μM pore-size sterile cell strainers | BD Biosciences | 352360 | |
| Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) | BD Biosciences | 352235 |
References
- Vissink, A. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).
- Napeñ, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth). Odontology. 97, 76-83 (2009).
- Denny, P. C. Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland. 235, 475-485 (2005).
- Man, Y. G. Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat. J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).
- Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation. Differentiation. 79, 120-130 (2010).
- Eirew, P. A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability. Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).
- Gorjup, E. Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations. European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).
- Alonso, L., Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).
- Lombaert, I. M. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).
- Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage. Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).
