Summary
마우스 침샘에서 줄기 세포의 격리를 위해 최적화된 프로토콜이 설명되어 있습니다. 방법은 효소와 소화 기계를 고용하고, 줄기 세포의 특징과 세포를 포함하는 salispheres의 절연을 수 있습니다.
Abstract
인간과 마우스 양쪽 원산지 성숙 침샘은 구강에 타액의 생산과 배설을 용이 각각 다섯 세포 유형의 최소 구성됩니다. 묽은 및 점액 acinar 세포는 각각 단백질과 선 (腺)의 점액 생산 공장이며, 타액 생산의 출처를 나타냅니다. 일단 합성, 타액의 여러 효소 및 기타 proteinaceous 구성 요소는 구강의 구멍에 한 가지 큰 덕트를 통해 타액의 최종 퇴학까지 상피 타입 형태를 베어링 ductal 세포의 일련을 통해 분비됩니다. 타액의 구성도이 과정에서 ductal 세포에 의해 수정됩니다.
이러한 Sjögren 증후군과 같은 질병의 발현에서와 같은 내분비선을 통해 머리와 목 암, 타액 생산을위한 방사선 치료와 같은 일부 임상 상황에서 극적으로 1,2을 줄일 수있다. 결과 xerostomia, 구강 건조의 주관적인 느낌이, 제비와 대화할 수있는 환자의 능력뿐 아니라 영향을뿐만 아니라, 치과 카리 에스의 개발을 장려하고 괴로워하는 사람에 대한 사회적 쇠약 수 있습니다.
위에서 언급한 임상 조건에서 타액 생산의 복원 따라서 충족되지 임상 필요성을 대표하고, 이러한 여러 연구 침샘 3-5의 재생 능력을 보여준 것처럼. 마우스와 인간의 몸에서 6-8 내의 여러 조직에서 세포의 줄기 세포와 같은 인구의 고립을 더욱, 우리는 마우스 침샘에서 분리된 줄기 세포가 조사 타액의 타액 생산을 구출하는 데 사용할 수있는 설명 방법을 사용 보였습니다 땀샘 9,10. 이 발견은 multipotent 자기 갱신 기능을 통해 세포를 포함하는 microenvironment로 침샘의 탐사에도 인간 xerostomic 조건의 치료를위한 줄기 세포 기반 치료법의 개발을위한 방법으로 불법 체류자합니다.
Protocol
1. 리젠트 준비
- 버퍼 : 1 % (W / V) 행크의 균형 소금 용액에 소 혈청 알부민
- Reconstitute 효소. Hyaluronidase 효소 : 버퍼에 용해 40mg / ML. Collagenase II : 23mg / ML, 버퍼에 용해. 각 절연 신선한 신선한 효소 솔루션을 사용합니다. 4 녹아 저장 ° C 소화에 사용까지.
- 증류수 50 MM의 염화칼슘. 0.2 UM 기공 크기의 필터를 통해 소독을 필터링합니다.
- 마우스 침샘 (MSG) 배지 : DMEM : 페니실린과 F12 (100 IU / ML), 스트렙토 마이신 (100 μg / ML), glutamax (2 ㎜), 표피 성장 인자 - 2 (20 NG / ML), fibroblast의 성장 인자 -2 (20 NG / ML), N2 보완 (1 %), 인슐린 (10 μg / ML)과 dexamethasone (1 μm의).
2. 기계 및 효소 조직 소화
- 해부 침샘을 나가는거야.
- 작은 배양 접시에있는 무균 곡선 해부 가위를 사용하여 동질적인 펄프로 분비 잘라.
- 80mg 턱밑 조직마다 버퍼의 1mL를 사용하여, 14 ML 튜브에 다진 조직을 수집합니다. 버퍼의 일부를 사용하여 조직의 깨끗한 배양 접시를 씻어.
- 25 μL collagenase 효소 II 솔루션, 25 μL hyaluronidase 효소 솔루션 80 MG 조직 당 250 μL 염화칼슘 용액 다음 80 MG 조직마다 버퍼의 또 다른 한 ML을 추가합니다. 2.9 편의를 위해 T25 조직 문화 flasks에서 수행할 수 있습니다 - 조직의 대용량과 함께 일하고있다면, 2.4이 단계를 반복합니다.
- 20 분 ° C 37 세트 떨고 waterbath에 품어. 튜브를 제거하고 다시 조직을 통해 철저하게 효소를 섞어 피펫으로 씹다.
- 또 다른 20 분 대한 waterbath로 바꿉니다.
- 팔분에 대한 400 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 뜨는 폐기하십시오.
- 각 80 MG 조직 2 ML 버퍼에 Resuspend, 이상과 같은 효소와 염화칼슘 추가를 반복합니다. 물 목욕을 흔들어 20 분 알을 품다. 튜브를 제거하고 철저하게 효소를 섞어 피펫으로 씹다.
- 물 목욕을 흔들림의 마지막 20 분 알을 품다. , 위와 같이 원심 분리하여 세포를 수집 뜨는 폐기.
3. 워싱 단계
- 2 ML 버퍼와 효소의 무료 조직을 씻어 피펫으로 조직의 각 80 MG를 Resuspend.
- 수집하는 등 이전에 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오.
- 80 MG 조직 당 한 ML 버퍼를 사용하여 씻어 반복합니다. 수집 뜨는 폐기하기 위해 원심 분리기.
4. 필터링
- 80 MG 조직 당 한 ML 버퍼에 Resuspend 조직 솔루션입니다.
- 50 ML 팰컨 튜브를 통해 배치 100 μm의 기공 크기의 필터 솔루션을 추가합니다. 필터가 차단 될 수 있으므로, 컬럼마다 다진 조직 솔루션의 3 개 이상 MLS를 적용하지 마십시오. 을 통해 침투 수 있습니다. 피펫으로 필터의 아래쪽에 매달려 필터링된 자료를 제거하고, 여과액 추가할 수 있습니다.
- 50mL 튜브에서 여과물을 5 ML 튜브 50 μm의 기공 크기의 필터를 적용 26 게이지 바늘로 주사기를 사용하십시오. 필요한 경우 피부를 느슨해진하여 지원을 통해 필터링할 수 있습니다.
- 원심 분리기 튜브는 이전에 수집합니다. 뜨는 폐기하십시오.
5. 도금 및 매체
- 하나의 볼륨으로 모든 알약을 결합합니다. 자동 셀 카운터 또는 혈구계를 사용하여 계산합니다.
- 0.4 X 10 6 12 잘 플레이트 잘 당 세포, 또는 2.67의 밀도에 플레이트 세포 T25 조직 배양 플라스크 당 X 10 6 세포. 각 T25 플라스크에 각각 잘 또는 6 ML 1 ML의 MSG 매체를 추가합니다.
- 37 품어 ° C. 분야는 하루에 2 명확하게 표시해야합니다.
6. 대표 결과 :
문화 2-3일 후, 전지 (salispheres)의 작은 집계는 문화에 분명합니다. Salispheres 문화에서 10 일 기간 동안 크기로 성장할 것입니다. salispheres 대표 위상 콘트라스트 현미경 이미지는 그림 1에 표시됩니다. 줄기 세포 관련 마커 단백질을 표현 Proliferating 전지는 최적의 3-5 일 이후 절연 사이에,이 분야에서 고립, 그리고 기능, 타액 생산 acinar 세포로 분화 능력이있다 수 있습니다.
그림 1. 체외에서 Salisphere 형성. 현재 프로토콜을 사용하여 기계적 소화 효소에 따라 증가하는 크기의 분야는 부동 문화에서 찾을 수 있습니다. 패널 며칠 0 (A), 4 분야의 대표적인 위상 콘트라스트 현미경 이미지 (B), 7 (C) 10 (D)입니다. 스케일 바 = 50 μm의.
Discussion
조직 배양 방법은 줄기 세포 함유 생쥐의 침샘에서 salispheres을의 격리에 대한 재현성 프로토콜을 나타냅니다 여기에서 설명한. 이러한 방식으로 분리된 세포를 사용하는 연구는 침샘에 줄기 세포 9 재생 능력을 강조했습니다. salispheres에서 파생된 C - 키트 + 세포 백의 이식은 조사 마우스 침샘의 기능 회복을 유도. 이러한 데이터는 흥분하고 xerostomia를위한 줄기 세포 기반 치료의 조사를위한 출발점을 제공합니다. 많은 아베는 줄기 세포의 전체 마커 단백질 발현 프로파일, 조사 귀밑샘 분비 관이 그 반대의 기능을 구출하기 턱밑 분비의 능력, 그리고 생체내 줄기 세포 틈새에서 putative의 특성을 포함하여, 그러나 탐험으로 남아 세포. 결국, 인간의 조직 샘플과 분리된 세포를 사용하여 인간의 환자 xerostomia의 치료에 대한 후속 가능성이 프로토콜의 번역이 설명한 방법의 가장 흥미로운 응용 프로그램입니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Collagenase II | GIBCO, by Life Technologies | 17101-015 | Store at 4 °C |
| Epidermal Growth Factor-2 | Sigma-Aldrich | E9644 | Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots. |
| Fibroblast Growth Factor-2 | Sigma-Aldrich | F0291 | Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots. |
| N2 supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17502-048 | As manufacturer instructions. |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving. |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| 100 μM pore-size sterile cell strainers | BD Biosciences | 352360 | |
| Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) | BD Biosciences | 352235 |
References
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